中国医科大学学报  2018, Vol. 47 Issue (3): 251-255

文章信息

周冬梅, 孔灵菲
ZHOU Dongmei, KONG Lingfei
哮喘患者气道上皮细胞关键基因的生物信息学分析
Identification of Key Genes of Airway Epithelial Cells in Asthma Patients by Bioinformatics-based Analysis
中国医科大学学报, 2018, 47(3): 251-255
Journal of China Medical University, 2018, 47(3): 251-255

文章历史

收稿日期:2017-10-13
网络出版时间:2018-03-02 17:38
哮喘患者气道上皮细胞关键基因的生物信息学分析
周冬梅1 , 孔灵菲2     
1. 中国医科大学附属第一医院老年呼吸感染科, 沈阳 110001;
2. 中国医科大学附属第一医院呼吸内科, 沈阳 110001
摘要目的 通过比较支气管哮喘患者气道上皮细胞与正常气道上皮细胞的基因芯片数据,鉴定哮喘气道上皮细胞中的关键基因。方法 对哮喘气道上皮细胞基因芯片数据GSE43696进行GEO2R分析,筛选出差异表达基因。然后使用DAVID数据库对差异表达基因进行功能及通路富集化分析。利用STRING对差异表达基因进行蛋白相互作用网络图(PPI)分析,并选出关键基因及显著模块。结果 共获得355个差异表达基因,130个上调基因,225个下调基因,主要涉及细胞运动、生长因子结合离子转运和通道活性。共筛出9个关键基因,包括BDNFERBB2IL6VEGFAKITADCY4PRKAR2BCCR6NMU结论 筛选的关键基因均在支气管哮喘中起重要作用,为支气管哮喘的诊治提供潜在的治疗目标。
Identification of Key Genes of Airway Epithelial Cells in Asthma Patients by Bioinformatics-based Analysis
ZHOU Dongmei1 , KONG Lingfei2     
1. Department of Respiratory and Infection in Elderly, The First Hospital, China Medical University, Shenyang 110001, China;
2. Department of Respiratory, The First Hospital, China Medical University, Shenyang 110001, China
Abstract: Objective We aimed to identify key genes and pathways of airway epithelial cells involved in bronchial asthma by comparing genetic information in the databases for patients with bronchial asthma and normal people.Methods To find differentially expressed genes (DEGs), mRNA microarray dataset, GSE43696, of airway epithelial cells in asthma was analyzed by GEO2R. Functional and pathway enrichment analyses were performed for DEGs using the DAVID database. The protein-protein interaction networks were established using STRING to identify key genes and important complexes.Results A total of 355 DEGs were identified; of which, 130 were up-regulated and 225, down-regulated. The genes identified were involved in cell movement, growth factor binding, and ion channel activity. Nine key genes were recognized, including BDNF, ERBB2, IL6, VEGFA, KIT, ADCY4, PRKAR2B, CCR6, and NMU.Conclusion All nine key genes identified play important roles in asthma and serve as potential targets for treatment of bronchial asthma.

支气管哮喘(简称哮喘)是一种以慢性气道炎症、黏液高分泌和气道高反应性为主要特征的全世界发病率最高的慢性疾病之一。气道上皮细胞是气道的第一道屏障,大量研究[1]表明,哮喘患者的气道上皮细胞存在功能障碍,其在哮喘的发生发展过程中起到重要作用。气道上皮屏障功能损伤的严重程度与支气管哮喘急性发作的严重程度相关。气道上皮细胞损伤后通过加强促炎活性,释放生长因子等参与支气管哮喘气道炎症与气道重塑[2],找出哮喘患者气道上皮与正常人的差异,有助于哮喘分型及找出新的治疗策略。本研究对正常人与重症哮喘患者气道上皮基因芯片的数据进行分析处理,旨在找出支气管哮喘气道上皮细胞在调控哮喘疾病进展中的关键基因。

1 材料与方法 1.1 基因芯片数据

基因表达数据库(Gene Expression Omnibus,GEO)http://www.ncbi. nlm.nih.gov/geo是当今最大最全面的公共基因表达数据的储存地址,例如基因芯片和二代测序。从GEO数据库获得关于支气管哮喘患者气道上皮细胞的基因芯片数据GSE43696,实验平台为GPL6480,是美国Agilent公司的全人类基因组芯片。GSE43696包含108个样本,对其中的20例正常对照组和38例重度哮喘的数据进行分析处理,以获得突出的差异表达基因。

1.2 获取差异表达基因

GEO2R是一个交互式网络工具,允许用户进行2组或多组GEO系列样本比较以识别差异基因。调整后PAdj.p.val < 0.05,差异倍数|logFC|>0.6认为其具有表达差异。

1.3 差异表达基因的基因本体及通路富集分析

DAVID(http://david.abcc,ncifcrf.gov)是一个基于网络的基因功能富集分析软件、整合生物学数据以及功能注释和信息链接为贴点的覆盖广泛的分析工具。使用DAVID在线分析软件对筛选出的差异表达基因进行基因本体(gene oncology,GO)分析和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

1.4 差异表达基因的蛋白相互作用网络图及获取关键模块

STRING数据库(http://http://www.string-db.org/)是一个关于已知或预测蛋白质间相互作用数据组成的数据库。使用STRING对差异基因编码的蛋白进行蛋白-蛋白相互作用网络分析。并将结果上传至Cytoscape中的MOCODE插件,用以获取关键模块。

2 结果 2.1 差异表达基因分析

通过GEO2R对GSE43696中20个正常样本及38个重症哮喘样本进行差异表达基因的分析。Adj.p.val < 0.05,| logFC |>0.6作为差异表达基因的标准。共获得355个差异表达基因,其中130个上调基因,225个下调基因,见表 1。上调及下调差异表达基因的前50个做热图,见图 1

表 1 前10名上调及下调差异表达基因 Tab.1 Top 10 up-regulated and down-regulated DEGs
Gene Adj.p.val P t B logFC
CLCA1 4.46×10-2 1.23×10-3  3.40 -1.05  3.21
SLCO1B3 1.04×10-6  5.07×10-11  7.99 14.41  2.64
PHACTR3 2.29×10-3 7.16×10-6  4.92 3.63  2.25
CEACAM5 8.92×10-4 1.81×10-6  5.30  4.90  2.20
CGREF1 8.95×10-3 7.20×10-5  4.27  1.52  2.06
PRR4 1.60×10-2 1.86×10-4  3.99  0.66  1.87
TPO 4.35×10-6  7.42×10-10  7.33 12.06  1.87
B3GNT6 3.42×10-3 1.45×10-5  4.73  2.99  1.86
NTRK2 2.37×10-2 3.82×10-4  3.77 < 0.01  1.63
CLorf186 1.45×10-3 4.14×10-6  5.08  4.14  1.61
SYT4 1.55×10-4 1.29×10-7 -6.00  7.33 -1.60
TMEM74B 4.92×10-6  9.61×10-10 -7.27 11.83 -1.62
PTGIR 0.21×10-3 1.95×10-7 -5.89  6.95 -1.66
ANO4 2.08×10-4 1.84×10-7 -5.91  7.00 -1.73
ERICH1-AS1 4.78×10-4 7.11×10-7 -5.55  5.76 -1.74
LOC10013228 2.24×10-4 2.19×10-7 -5.86  6.84 -1.77
MMP16 1.04×10-4 6.07×10-8 -6.20  8.02 -1.92
KCNA1 1.88×10-2 2.53×10-4 -3.90  0.38 -2.04
CSH1 1.01×10-3 2.25×10-6 -5.24  4.70 -2.33
WNK4 1.79×10-6  2.18×10-10 -7.65 13.18 -2.45

图 1 前50名上调和下调差异表达基因的热图 Fig.1 Heat map of top 50 up-regulated and down-regulated DEGs

2.2 差异表达基因的基因本体分析

将所有差异表达基因上传至DAVID进行GO分析及KEGG分析。GO分析结果(表 2)显示,上调的差异表达基因在生物学过程中主要涉及细胞运动,较多基因定位于膜小泡和胞外区,在分子功能方面主要涉及生长因子结合和蛋白二聚化。下调的差异表达基因在生物学过程中主要涉及离子转运和转运调节,细胞成分主要涉及突触和细胞连接,在分子功能方面主要涉及通道活性。

表 2 差异表达基因的基因本体分析 Tab.2 Gene oncology analysis of DEGs
Express GO ID Term Count P
Up-express 0040011 Locomotion 22 1.36×10-3
0006928 Localization of cell 24 1.95×10-3
0031988 Membrane-bounded vesicle 39 6.24×10-3
0005576 Extracellular region 47 6.44×10-3
0019838 Growth factor binding 5 1.09×10-2
0046983 Protein dimerization activity 15 2.30×10-2
Under-express 0051049 Regulation of transport 41 3.07×10-6
0006811 Ion transport 34 1.96×10-5
0045202 Synapse 26 7.12×10-8
0030054 Cell junction 28 3.46×10-4
0005216 Ion channel activity 15 2.80×10-4
0015267 Channel activity 15 8.17×10-4

2.3 差异表达基因的通路富集分析

KEGG分析结果显示,上调的差异表达基因主要涉及半乳糖、果糖和甘露糖代谢,而下调的差异表达基因主要涉及色氨酸代谢和神经活性受体及配体相互作用,见表 3

表 3 差异表达基因的通路富集分析 Tab.3 Pathway enrichment analysis of DEGs
Express Pathway ID Term Count P Gene
Up-express Hsa00052 Galactose metabolism 3 2.04×10-2 HKDC1AKR1B10GALE
Hsa00051 Fructose and mannose metabolism 3 2.30×10-2 HKDC1AKR1B10FBP2
Under-express Hsa00380 Tryptophan metabolism 4 8.45×10-3 DDCKYNUMAOBKMO
Hsa04080 Neuroactive ligand-receptor interaction 8 2.63×10-2 GPR156CSH1GABRG1PTGIRRPLJRGRIA2PTH2RFPR3

2.4 蛋白相互作用网络建设及模块的选择

差异表达基因的蛋白相互作用网络包含329个节点和337个边(图 2A)。关联值≥10作为关键基因的标准。共筛出9个关键基因,包括脑源性神经生长因子受体(brain derived neurotrophic factorBDNF),原癌基因-受体酪氨酸激酶(proto-oncogene receptor tyrosine kinaseKIT),腺苷酸环化酶4(adenylate cyclase 4ADCY4),神经介素U(neuromedin U,NMU),ERB-B2受体酪氨酸激酶2(erb-b2 receptor tyrosine kinase 2ERBB2),白细胞介素(interleukin,IL)6,血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor AVEGFA),蛋白激酶依赖性Ⅱ型调节亚单位βprotein kinase cAMP-dependent typeregulatory subunit betaPRKAR2B),趋化因子受体6(C-C motif chemokine receptor 6CCR6)。通过Cytoscape下的MCODE,筛出了一个最显著的模块,包含9个节点,36个边(图 2 B),主要涉及环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)通路及趋化因子信号通路。

A, PPI network; B, PPI subnetwork. 图 2 差异表达基因的蛋白互作网络图及关键模块 Fig.2 Significant modules in the protein-protein interaction network of DEGs in bronchial asthma

3 讨论

气道上皮细胞是气道的第一道屏障,通过纤毛摆动,释放抗微生物肽、趋化因子和细胞因子,招募并激活其他类型的免疫细胞来清除病原体。在支气管哮喘中,气道上皮细胞的屏障功能障碍,多项研究[3-5]均强调哮喘中气道上皮细胞是气道炎症的来源之一,有望成为治疗哮喘的靶细胞。近年来,基因芯片技术被广泛用于揭示疾病进展过程中的遗传改变。对哮喘气道上皮细胞基因芯片数据进行分析,有助于发掘针对气道上皮细胞治疗哮喘的靶基因。

利用GEO2R对GSE43696基因芯片数据进行分析,获得重症哮喘与正常人气道上皮细胞差异表达的355个基因,其中130个上调基因,225个下调基因。通过蛋白相互作用网络,筛选出9个关键基因,包括BDNFERBB2IL6VEGFAKITADCY4PRKAR2BCCR6NMUIL-6是重要的Th2型炎症介质,CCR6可诱导淋巴细胞归巢,BDNF的上调可导致气道高反应,与哮喘的严重程度和Th2型气道炎症相关[6],而ERBB2是表皮生长因子受体之一,介导慢性哮喘小鼠模型气道高反应和重塑[7]NMU可以诱导肥大细胞脱颗粒,NMU敲除的哮喘小鼠嗜酸性粒细胞浸润显著下降[8]。在儿童哮喘中,VEGFA的基因多态性与哮喘预后相关[9],而ADCYAP1R1的基因多态性与哮喘患病率相关[10]。对哮喘小鼠注射KIT基因的干扰RNA,可抑制气道炎症、IL-4和IL-5的产生[11]PRKAR2B基因编码AMP依赖的蛋白激酶类型Ⅱ型调节亚单位β,近期研究[12]显示,树突细胞通过cAMP途径调节Th2型免疫反应,其中ADCY3增加,ADCY4降低。但尚没有ADCY4与哮喘的具体研究。

MECODE筛选的关键模块涉及的关键通路为cAMP及趋化因子信号通路。其中,SUCNR1(succinate receptor 1)为琥珀酸受体1。琥珀酸是三羧酸循环的中间产物,在线粒体ATP代谢过程中起至关重要的作用。SUCNR1代谢功能的障碍可导致肥胖相关糖尿病及肾功能障碍[13],但除了代谢功能外,SUCNR1还参与炎症反应的调节[14]。疾病研究中,敲除SUCNR1可以增强肥大细胞的活性,减轻关节炎,但在哮喘中其作用尚不清楚。

通过生物信息学方法,分析哮喘气道上皮细胞潜在的差异基因及信号通路,找到9个关键基因。BDNFERBB2IL6VEGFAKITCCR6NMU在支气管哮喘已多有研究,但有些基因在气道上皮细胞中的作用还有待进一步探索。趋化因子信号通路是哮喘的气道上皮细胞的重要信号通路,亦多有研究,但cAMP通路在哮喘中还有待更进一步探索。这些实验研究结果表明通过挖掘数据,并利用生物信息学分析工具可预测哮喘气道上皮功能障碍中的关键基因及通路,为哮喘的诊治提供潜在的治疗目标。

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