文章信息
- 范一博, 车晓芳, 赵欢, 胡雪君, 曲秀娟, 刘云鹏
- FAN Yibo, CHE Xiaofang, ZHAO Huan, HU Xuejun, QU Xiujuan, LIU Yunpeng
- microRNA-1183通过抑制CBL-B的表达促进胃癌细胞的增殖及转移
- microRNA-1183 Promotes the Proliferation and Metastasis by Suppressing the Expression of CBL-B in Gastric Cancer Cells
- 中国医科大学学报, 2018, 47(3): 202-205, 211
- Journal of China Medical University, 2018, 47(3): 202-205, 211
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文章历史
- 收稿日期:2017-08-23
- 网络出版时间:2018-03-02 17:38
2. 中国医科大学附属第一医院呼吸疾病研究所老年病呼吸感染科, 沈阳 110001
2. Institute of Respiratory Disease, Department of Respiratory and Infectious Disease of Geriatrics, The First Hospital, China Medical University, Shenyang 110001, China
microRNA(miRNA)是一类长度约为22个核苷酸,由内源基因编码的非编码单链RNA分子,参与转录后基因表达调控[1]。近年来,越来越多的研究[2-7]显示,microRNA参与多种肿瘤的增殖和转移,影响肿瘤患者的预后。然而,microRNA-1183是否促进胃癌细胞中的增殖和转移尚不清楚。本研究探讨了microRNA-1183对胃癌细胞MGC803增殖和转移的影响,以及CBL-B和Akt通路在其中的作用。研究结果为进一步明确microRNA-1183对胃癌细胞的增殖和转移机制提供了新思路。
1 材料与方法 1.1 材料Akt和phosph-Akt抗体购自美国Cell Signaling公司,CBL-B和β-actin抗体购自美国Santa Cruze公司。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养胃癌细胞系MGC803购自上海细胞库。人胃癌细胞MGC803生长于含有12 U/L庆大霉素、100 mL/L灭活胎牛血清的RPMI1640培养液中,于37 ℃、5%CO2的孵育箱内培养,2 d左右传代1次。所有实验均采用对数生长期细胞。
1.2.2 MTT法检测胃癌细胞的增殖取对数生长期的胃癌细胞MGC803细胞株接种于96孔板内,待细胞贴壁后转染microRNA阴性对照及microRNA-1183模拟物,72 h后每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)25 μL,继续孵育4 h,弃掉孔内上清液。加入二甲亚砜200 μL/孔,振荡至结晶物充分溶解,在酶联免疫测定仪上选择570 nm波长,空白孔调零,测定各孔吸光值,计算两者的增值率。
1.2.3 Transwell法检测胃癌细胞的转移取对数生长期的胃癌细胞MGC803,胰酶消化细胞后,1 000 r/min离心5 min,弃上清,加入无血清的RPIM 1640培养基,细胞计数至1×105 /mL加入Transwell小室(Corning)上室。下室加入2.5%胎牛血清的RPIM培养基。37 ℃培养箱培养24 h。取出Transwell,脱脂棉擦拭表面的细胞,PBS冲洗上室。瑞士吉姆萨染色后,PBS冲洗风干,显微镜下计数细胞数。实验重复3次。
1.2.4 Western blotting检测蛋白表达分别收集转染microRNA阴性对照及microRNA-1183模拟物的胃癌细胞MGC803,冰上裂解后,提取上清的蛋白,考马斯亮蓝法进行蛋白定量。将样品(30 μg/道)在10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳约3 h,然后转印至PVDF膜上。用含5%脱脂牛奶的TTBS封闭1 h后,按Marker标记的分子量剪裁转印膜,分别加入兔抗人CBL-B抗体(1:1 000)、pAkt抗体(1:500)、Akt抗体(1:1 000)和β-actin抗体(1:1 000)4 ℃过夜。TTBS洗4次后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠(1:800)或羊抗兔二抗(1:800)室温作用30 min后,再应用TTBS洗4次,ECL法显色,GIS凝胶图像分析系统照相并分析处理。
1.2.5 双荧光素酶报告基因检测系统检测将质粒(500 ng)、microRNA-1183模拟物或阴性对照(50 nmol/L)及pRL-TK(5 ng)瞬时转染至胃癌细胞MGC803细胞72 h后,双荧光报告系统检测荧光素酶的活性。
1.3 统计学分析采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析。所得数据均为3次独立实验结果,以x±s表示。2组间比较采用t检验,P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 microRNA-1183促进胃癌细胞MGC803的增殖和转移为证实microRNA-1183对胃癌细胞增殖的作用,将microRNA-1183瞬时转染到MGC803细胞,实时PCR结果显示,与对照组相比,microRNA-1183的表达升高了4.2倍(图 1A)。同时,MTT法结果证实,microRNA-1183可促进胃癌细胞MGC803的增殖(图 1B)。Transwell法结果证实,microRNA-1183可促进胃癌细胞MGC803的转移(图 1C)。
2.2 microRNA-1183直接与CBL-B 3’UTR区结合
为了明确microRNA-1183促进胃癌细胞增殖的机制,通过生物信息学网站TargetScan及microRNA.org预测microRNA-1183的靶基因,结果显示,CBL-B等是microRNA-1183的靶基因。BLAST对比分析结果显示,microRNA-1183与CBL-B的3’UTR区有直接结合位点(图 2A)。进一步过表达microRNA-1183后,CBL-B的表达以浓度依赖的方式下调(图 2B)。荧光报告素酶结果证实,转染模拟物microRNA-1183后,荧光素酶的活性明显降低(图 2C),说明CBL-B是microRNA-1183的靶基因。
2.3 CBL-B抑制胃癌MGC803细胞的增殖
为证实CBL-B对胃癌MGC803增殖的作用,Western blotting验证CBL-B的敲除效率情况(图 3A)。MTT法结果显示,瞬时敲除CBL-B后,细胞增殖的能力明显增强。Transwell法结果显示,敲除CBL-B后,细胞的转移能力明显增强。结果表明,CBL-B抑制了胃癌细胞MGC803的增殖(P < 0.01,图 3B)。
2.4 microRNA-1183/CBL-B/Akt信号轴促进胃癌细胞MGC803的增殖与转移
Western blotting检测microRNA-1183瞬时转染到MGC803细胞48 h后,CBL-B及下游分子Akt的表达变化。结果表明,瞬时转染microRNA-1183后,CBL-B的表达明显下调,伴随Akt的活化明显增强,见图 4。
3 讨论
microRNA的异常表达可影响多种肿瘤患者的预后[2-7]。已有文献[8]报道,microRNA-1183在类风湿性关节炎的患者中高表达,且可作为诊断疾病的分子标志物。然而,目前microRNA-1183在肿瘤中发挥的作用尚未见报告。本研究证实,胃癌中microRNA-1183可促进其增殖及转移。
既往研究[8]显示,胃癌患者血浆microRNA-1183的表达可作为诊断类风湿关节炎的生物标志物,其中CXCR4、EGF和EGFR都是其靶基因。然而,microRNA-1183是否存在其他的靶基因,及其在胃癌中的增殖作用尚不明确。本研究结果显示,microRNA-1183可以通过浓度依赖的方式促进胃癌细胞MGC803的增殖和转移,进一步提示其参与胃癌细胞的恶性转化。
既往关于microRNA-1183的功能及靶基因仅有1篇文章报告。通过TargetScan及microRNAorg预测CBL-B可能是microRNA的靶基因。CBL-B是一种抑癌基因,通过泛素化降解受体或非受体酪氨酸激酶,从而抑制细胞的生长、分化和凋亡[9-10]。本研究发现,过表达microRNA-1183后CBL-B的表达明显下调,并伴随着Akt的活化。这些结果提示,microRNA-1183通过负向调控CBL-B促进胃癌细胞的增殖及转移。
综上所述,microRNA-1183可促进胃癌细胞的增殖和转移,其通过抑制CBL-B的表达促进了Akt的活化,提示microRNA-1183/CBL-B/Akt通路是促进胃癌细胞增殖和转移的机制之一。本研究为进一步明确胃癌细胞的增殖和转移机制,寻找治疗胃癌的靶分子提供重要的科学意义和潜在的临床应用价值。
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