中国医科大学学报  2018, Vol. 47 Issue (2): 97-101

文章信息

苏敬阳, 王蓉蓉, 袁媛, 李松霖, 朱正南, 黄露婷, 封瑞, 邵冬雪, 孙雪菲, 郝丽英
SU Jingyang, WANG Rongrong, YUAN Yuan, LI Songlin, ZHU Zhengnan, HUANG Luting, FENG Rui, SHAO Dongxue, SUN Xuefei, HAO Liying
CaM突变体质粒的构建、表达纯化及活性鉴定
Construction of a Mutant CaM-expressing Plasmid, and Expression, Purification, and Activity Identification of the Recombinant Protein
中国医科大学学报, 2018, 47(2): 97-101
Journal of China Medical University, 2018, 47(2): 97-101

文章历史

收稿日期:2017-06-14
网络出版时间:2018-01-08 10:54
CaM突变体质粒的构建、表达纯化及活性鉴定
中国医科大学药学院药物毒理学教研室, 沈阳 110122
摘要目的 制备钙调蛋白(CaM)突变体CaME141G的融合蛋白质粒,并进行蛋白表达、提取纯化和活性鉴定。方法 利用定点突变技术将野生型CaM的第141个氨基酸E(GAG)突变为G(GGG),再将突变体质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,大量培养后诱导其GST融合蛋白表达,GS-4B beads纯化,PreScission protease酶切GST标签,采用Bradford方法测定纯化后蛋白浓度,SDS-PAGE凝胶电泳检测CaME141G蛋白的相对分子量和纯度,pull-down实验鉴定纯化后蛋白的生物活性。结果 提取纯化后的CaME141G蛋白具有较高的浓度和纯度,且能与心肌CaV1.2钙通道C末端的PreIQ蛋白片段结合,并具有CaME141G蛋白浓度依赖性,提示该蛋白具有与心肌CaV1.2钙通道结合的能力。结论 成功构建了CaME141G融合蛋白质粒,并获得了纯化后的CaME141G蛋白,为深入研究CaM突变体在心肌CaV1.2钙通道中的调节作用及其与心血管系统疾病的关系奠定了基础。
关键词钙调蛋白    突变体    质粒    表达纯化    pull-down实验    
Construction of a Mutant CaM-expressing Plasmid, and Expression, Purification, and Activity Identification of the Recombinant Protein
Department of Pharmaceutical Toxicology, School of Pharmacy, China Medical University, Shenyang 110122, China
Abstract: Objective To construct a CaME141G fusion protein-expressing plasmid, and to express, purify, and identify the activity of the recombinant protein.Methods The 141st site of the wild type CaM, E (GAG), was mutated to G (GGG), using site-specific mutagenesis technology. Escherichia coli BL-21 was transformed with the mutant plasmid. The GST-CaME141G fusion protein was mass-cultured and induced for expression. Subsequently, the GST-CaME141G fusion protein was purified using GS-4B beads. PreScission protease was applied to remove the GST, the Bradford method used to determine the concentration of purified protein, and SDS-PAGE used to detect its relative molecular weight and purity. The GST pull-down assay was used to study the protein's biological activity.Results The CaME141G protein was successfully purified at a high concentration and purity. The protein could interact with PreIQ protein fragments from the myocardial CaV1.2 calcium channel C terminal, in a CaME141G concentration-dependent manner. Therefore, CaME141G has the ability to bind with the CaV1.2 calcium channel.Conclusion This study successfully constructed a CaME141G fusion protein-expressing plasmid and purified the CaME141G protein. This lays a foundation for regulating the function of CaM mutations in the myocardial CaV1.2 calcium channel, and for the study of its relationship with diseases of the cardiovascular system.
Keywords: calmodulin    mutant    plasmid    expression and purification    pull-down assay    

钙调蛋白(calmodulin,CaM)是体内一种重要的Ca2+感受器和信号转导蛋白,广泛存在于各种真核生物细胞中[1-2]。Ca2+诱导激活的CaM介导调控多种Ca2+依赖性生理过程[3],并参与调节心肌离子通道活性,如调节CaV1.2钙通道、NaV1.5钠通道、KV1.5钾通道和兰尼碱受体(ryanodine receptor 2,RyR2)等。CaM基因突变可导致多种严重心血管疾病[4-8],并能改变基因表达[9],如长QT综合征(long QT syndrome,LQTS)、儿茶酚胺介导的多形性室速(catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia,CPVT)、心肌肥厚、心律失常、原发性心室纤颤等。其中LQTS是一种危害极大的心血管系统疾病,CaM由3个不同的基因(CALM1CALM2CALM3)编码,其中任何1个基因发生突变都有可能导致LQTS [5, 7-8]。LQTS是指心室肌细胞动作电位复极过程紊乱,心电图QT间期延长,临床表现为晕厥、癫痫、猝死,而心脏结构却无任何异常。目前,所有被发现的与LQTS有关的CaM突变体都能降低CaM与Ca2+的亲和力,抑制CaV1.2钙通道的钙离子依赖性失活(calcium dependent inactivation,CDI)作用[5, 7, 10-11]。研究[6, 12]表明,导致LQTS的CaM基因突变有D96V、D130G、D130V、F142L、E141G几个位点,其中E141G是最为重要的一个突变点,因为CaME141G是目前被研究发现的第一个既影响CaV1.2钙通道又影响成年人NaV1.5钠通道的突变体,而其他突变位点只影响心肌CaV1.2钙通道的调节作用,并不影响成年人NaV1.5钠通道,也不影响RyR2。因此,本研究选取CaME141G为研究对象,构建CaME141G质粒,并提取纯化CaME141G蛋白,进行活性鉴定,为CaM突变体与心肌CaV1.2钙通道的相互作用研究奠定基础,进而为CaM与心血管系统疾病关系的进一步探索提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料

pGEX-6p-3/CaM质粒由日本鹿儿岛大学Kameyama教授惠赠;pGEX-6p-3/CaME141G质粒由武汉金开瑞生物工程有限公司定点突变及提供;氨苄西林(ampicillin,Amp)、溶菌酶、异丙基硫代-β-D半乳糖苷、二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT),甲叉双丙烯酰胺,过硫酸铵均购自美国Sigma公司。Glutathione-Sepharose 4B beads(GS-4B beads)、PreScission Protease购自英国GE Healthcare公司;SDS、PBS磷酸盐缓冲液粉末均购自美国Solarbio公司;NaCl、CaCl2购自北京北化精细化学品有限责任公司;胰蛋白胨、酵母提取物购自英国OXOID公司。

1.2 方法

1.2.1 BL21感受态细胞的转化

应用42 ℃精确热激法将CaME141G质粒转化入BL21感受态细胞。无菌条件下操作,取50 μL E.coli BL21感受态细胞,加入pGEX-6p-3/CaME141G质粒40 ng,混匀后冰浴30 min。42 ℃水浴锅热击45 s,然后快速转移至冰浴中2 min。向离心管中加入500 μL无菌1×LB培养基(不含抗生素),混匀后置于37 ℃水浴200 r/min振荡培养l h,使细菌复苏。根据实验要求,3 000 r/min离心2 min后弃掉300 μL上清,重悬细菌,取出50 μL均匀涂在含Amp的LB固体琼脂培养板上,直至液体被吸收,置于37 ℃电热恒温培养箱中倒置培养12~16 h。取单克隆菌种接种于装有3 mL含Amp(50 mg/mL)的LB培养液的15 mL离心管中,37 ℃、120 r/min培养12~16 h。保留菌种(50%甘油200 μL +菌液800 μL),置于1.5 mL高压灭菌EP管中,混匀并冻存于-80 ℃备用。

1.2.2 GST-CaME141G融合蛋白的诱导及表达

取100 μL菌种加入到装有400 mL含50 μg/mL Amp的LB培养液的锥形瓶中,37 ℃、120 r/min振荡培养12~16 h。当OD600 nm为0.6~1.0范围内时,加入终浓度为1 mmol/L的IPTG 400 μL,37 ℃、120 r/min振荡培养4 h,诱导融合蛋白表达。

1.2.3 CaME141G的提取纯化

菌液4 000 r/min离心10 min,弃上清。用PBS重悬沉淀(每400 mL菌液离心后的沉淀用20 mL PBS重悬),加入20 mg/mL溶菌酶和1 mol/L DTT各200 μL,混匀后冰上处理30 min,超声破碎30 min。15 000 r/min离心10 min,取上清置于15 mL EP管中,与PBS预先洗过的300 μL GS-4B beads于4 ℃孵育摇晃过夜。第二日清晨800 r/min离心,弃上清,用5 mL Tris buffer(pH8.0)清洗beads 3次,然后转移至2 mL EP管中,加495 μL Tris buffer、5 μL PreScission蛋白酶,室温旋转5 h,去除GST标签。800 r/min离心3 min,上清即是提取纯化的CaME141G蛋白,-20 ℃冻存备用。

1.2.4 CaME141G质粒DNA的酶切鉴定

重组质粒具有SalⅠ和NotⅠ 2个限制性酶切位点。质粒DNA经双酶切后,行1.0%琼脂糖电泳鉴定。

1.2.5 CaME141G分子量和纯度的鉴定

将纯化的CaME141G经5×SDS loading buffer蛋白上样缓冲液室温处理后,进行15%SDS-PAGE电泳,检测其相对分子量和纯度。

1.2.6 CaME141G浓度的测定

参照碧云天Bradford蛋白浓度测定试剂盒说明,以牛血清白蛋白为标准品,测定CaME141G的浓度。

1.2.7 CaME141G生物活性的鉴定

采用pull-down实验检测纯化后的CaME141G的活性。取连接于GS-4B beads的GST-PreIQ融合蛋白40 μL置于2 mL EP管中,加入0.001 mol/L CaCl2 3 μL([Ca2+]10 μmol/L),CaME141G(终浓度分别为0.7,1.4,2.1,3.5,7.0,10.0 μmol/L),用Tris buffer(pH8.0)补至总体系300 μL。4 ℃,孵育4 h。800 r/min,离心3 min,转移至1.5 mL EP管中,Tris buffer(10 μmol/L Ca2+)清洗beads 2次,加入15 μL 5×SDS loading buffer洗脱处理,取上清行15%SDS-PAGE电泳,鉴定纯化后的蛋白是否具有生物活性。

2 结果 2.1 重组质粒的酶切鉴定

质粒pGEX-6P-3约为4 900 bp,SalⅠ和NotⅠ之间的碱基全长约为10 bp,CaME141G约为470 bp,质粒pGEX-6P-3经SalⅠ和NotⅠ双酶切插入CaME141G后,重组质粒全长约为5 360 bp。pGEX-6p-3/CaME141G重组质粒经双酶切后应得到2个碱基片段,即1个约为4 890 bp的大分子量DNA和1个约为470 bp的小分子量DNA。琼脂糖凝胶电泳结果显示,在4 890 bp和470 bp处均出现明显条带,结果与理论值相符,说明pGEX-6p-3/CaME141G融合蛋白质粒构建成功。见图 1

M, DNA marker; 1, plasmid digested by SalⅠ/NotⅠ; 2, plasmid DNA. 图 1 重组质粒酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图 Fig.1 Agarose gel electrophoresis of recombinant plasmids digested by restriction endonuclease

2.2 重组质粒的DNA测序结果

DNA测序结果显示,CaM重组质粒是含有470 bp的DNA片段,CaM片段中的第422个碱基由A突变为G,所对应的第141个氨基酸由谷氨酸E突变为甘氨酸G,即CaME141G重组质粒。基因同一性比较为100%,氨基酸同一性比较为100%,且插入方向正确,读码框架正确,无移码突变,进一步证明构建重组质粒成功。见图 2

A, the DNA sequence identification of CaM; B, the amino acid sequence identification of CaM; C, the DNA sequence identification of CaME141G; D, the amino acid sequence identification of CaME141G. 图 2 CaM及CaME141G的DNA测序结果 Fig.2 DNA sequence identification of CaM and CaME141G

2.3 纯化后蛋白的分子量和纯度的鉴定

CaME141G蛋白的表观分子量约为16 700。GST-CaME141G融合蛋白经PreScission蛋白酶酶切后,上清即是CaME141G蛋白。将GST-CaME141G融合蛋白、酶切之后的沉淀beads、CaME141G蛋白分别进行15%SDS-PAGE电泳后,可观察到在表观分子量约为42 700(GST-CaME141G)、26 000(GST)和16 700(CaME141G)处出现明显条带,与预期结果一致,且lane3中其他杂蛋白较少,表明提取纯化获得纯度较高的CaME141G蛋白。见图 3

M, marker; 1, GST-CaME141G; 2, pellet after cutting off with PreScission protease; 3, CaME141G. 图 3 纯化后CaME141G蛋白的SDS-PAGE电泳图 Fig.3 SDS-PAGE of purified CaME141G

2.4 纯化后蛋白的浓度测定

采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒方法测定提纯后的蛋白浓度,计算CaME141G蛋白的浓度为1.39 mg/mL。

2.5 CaME141G蛋白活性的鉴定

用pull-down实验检测CaME141G的蛋白活性,在10 μmol/L Ca2+条件下,将提纯后的蛋白与PreIQ蛋白片段相互作用,15%SDS-PAGE凝胶电泳,在表观分子量约16 700处出现明显条带,见图 4。且随着CaME141G蛋白浓度的增加,结合量也呈递增趋势,见图 5。以上结果说明提取纯化的CaME141G蛋白具有与钙通道蛋白结合的能力,即具有生物活性。

图 4 CaME141G与GST-PreIQ结合的SDS-PAGE电泳图 Fig.4 SDS-PAGE of CaME141G binding with GST-PreIQ

图 5 CaME141G与GST-PreIQ结合的浓度依赖性 Fig.5 Concentration-dependent binding of CaME141G to GST-PreIQ

3 讨论

CaM通过传导和转换Ca2+信号来调节几个不同的离子通道(钙通道、钠通道、钾通道等)活性。当细胞内Ca2+水平升高时,CaM会结合4个Ca2+,在与CaM靶蛋白相互作用的区域维持一个开放的构象。研究发现,CaME141G突变体与Ca2+的亲和力比野生型CaM与Ca2+的亲和力降低了11倍,主要发生在CaM的C-lobe上。与之前报道[4-5, 10]的其他与LQTS或者CPVT相关的CaM突变体与Ca2+的亲和力降低的特性一致。表明,CaM与Ca2+结合特性发生变化是CaM突变体导致LQTS的病理机制的共性。

心肌CaV1.2钙通道通过与CaM的结合作用调节细胞内Ca2+浓度,CaME141G突变体与Ca2+的亲和力降低直接影响心肌CaV1.2钙通道的CDI作用。这是由于Ca2+与CaM结合特性发生变化,会损害CaV1.2钙通道的CDI作用。除了CaV1.2钙通道,CaM也参与调节心肌NaV1.5钠通道失活作用[13]。YIN等[11]研究发现与LQTS相关的CaM突变体(D96V、D130G和F142L)不影响NaV1.5钠通道作用,但后来发现CaMD130G会导致胎儿心肌NaV1.5钠通道晚期电流增加7.5倍。他们推测这种现象可能是因为CaM基因突变导致LQTS都发生在年幼时期,所以CaMD130G仅影响胎儿的钠离子通道。然而,接下来的研究表明,CaME141G突变体会影响成年人的心肌钠离子通道,导致NaV1.5钠通道晚期电流增加1.7倍,因此CaME141G是目前被发现的第1个既影响CaV1.2钙通道又影响成年人NaV1.5钠通道的突变体。此外,之前有报道[14]称,导致CPVT的CaM突变体N98S也有激活RyR2的作用,并且可能导致LQTS。表明与LQTS相关的CaM突变体不影响RyR2,而与CPVT相关的CaM突变体则会扰乱RyR2的生理作用。

CaM的基因突变会导致多种心血管系统疾病,严重威胁人类生命健康,关于CaM基因突变的研究大多是膜片钳技术测量电流变化和临床案例的探究,而对于导致这些疾病的机制还没有明确,仍需要进一步研究。

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