文章信息
- 苏敬阳, 王蓉蓉, 袁媛, 李松霖, 朱正南, 黄露婷, 封瑞, 邵冬雪, 孙雪菲, 郝丽英
- SU Jingyang, WANG Rongrong, YUAN Yuan, LI Songlin, ZHU Zhengnan, HUANG Luting, FENG Rui, SHAO Dongxue, SUN Xuefei, HAO Liying
- CaM突变体质粒的构建、表达纯化及活性鉴定
- Construction of a Mutant CaM-expressing Plasmid, and Expression, Purification, and Activity Identification of the Recombinant Protein
- 中国医科大学学报, 2018, 47(2): 97-101
- Journal of China Medical University, 2018, 47(2): 97-101
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文章历史
- 收稿日期:2017-06-14
- 网络出版时间:2018-01-08 10:54
钙调蛋白(calmodulin,CaM)是体内一种重要的Ca2+感受器和信号转导蛋白,广泛存在于各种真核生物细胞中[1-2]。Ca2+诱导激活的CaM介导调控多种Ca2+依赖性生理过程[3],并参与调节心肌离子通道活性,如调节CaV1.2钙通道、NaV1.5钠通道、KV1.5钾通道和兰尼碱受体(ryanodine receptor 2,RyR2)等。CaM基因突变可导致多种严重心血管疾病[4-8],并能改变基因表达[9],如长QT综合征(long QT syndrome,LQTS)、儿茶酚胺介导的多形性室速(catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia,CPVT)、心肌肥厚、心律失常、原发性心室纤颤等。其中LQTS是一种危害极大的心血管系统疾病,CaM由3个不同的基因(CALM1,CALM2,CALM3)编码,其中任何1个基因发生突变都有可能导致LQTS [5, 7-8]。LQTS是指心室肌细胞动作电位复极过程紊乱,心电图QT间期延长,临床表现为晕厥、癫痫、猝死,而心脏结构却无任何异常。目前,所有被发现的与LQTS有关的CaM突变体都能降低CaM与Ca2+的亲和力,抑制CaV1.2钙通道的钙离子依赖性失活(calcium dependent inactivation,CDI)作用[5, 7, 10-11]。研究[6, 12]表明,导致LQTS的CaM基因突变有D96V、D130G、D130V、F142L、E141G几个位点,其中E141G是最为重要的一个突变点,因为CaME141G是目前被研究发现的第一个既影响CaV1.2钙通道又影响成年人NaV1.5钠通道的突变体,而其他突变位点只影响心肌CaV1.2钙通道的调节作用,并不影响成年人NaV1.5钠通道,也不影响RyR2。因此,本研究选取CaME141G为研究对象,构建CaME141G质粒,并提取纯化CaME141G蛋白,进行活性鉴定,为CaM突变体与心肌CaV1.2钙通道的相互作用研究奠定基础,进而为CaM与心血管系统疾病关系的进一步探索提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料pGEX-6p-3/CaM质粒由日本鹿儿岛大学Kameyama教授惠赠;pGEX-6p-3/CaME141G质粒由武汉金开瑞生物工程有限公司定点突变及提供;氨苄西林(ampicillin,Amp)、溶菌酶、异丙基硫代-β-D半乳糖苷、二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT),甲叉双丙烯酰胺,过硫酸铵均购自美国Sigma公司。Glutathione-Sepharose 4B beads(GS-4B beads)、PreScission Protease购自英国GE Healthcare公司;SDS、PBS磷酸盐缓冲液粉末均购自美国Solarbio公司;NaCl、CaCl2购自北京北化精细化学品有限责任公司;胰蛋白胨、酵母提取物购自英国OXOID公司。
1.2 方法 1.2.1 BL21感受态细胞的转化应用42 ℃精确热激法将CaME141G质粒转化入BL21感受态细胞。无菌条件下操作,取50 μL E.coli BL21感受态细胞,加入pGEX-6p-3/CaME141G质粒40 ng,混匀后冰浴30 min。42 ℃水浴锅热击45 s,然后快速转移至冰浴中2 min。向离心管中加入500 μL无菌1×LB培养基(不含抗生素),混匀后置于37 ℃水浴200 r/min振荡培养l h,使细菌复苏。根据实验要求,3 000 r/min离心2 min后弃掉300 μL上清,重悬细菌,取出50 μL均匀涂在含Amp的LB固体琼脂培养板上,直至液体被吸收,置于37 ℃电热恒温培养箱中倒置培养12~16 h。取单克隆菌种接种于装有3 mL含Amp(50 mg/mL)的LB培养液的15 mL离心管中,37 ℃、120 r/min培养12~16 h。保留菌种(50%甘油200 μL +菌液800 μL),置于1.5 mL高压灭菌EP管中,混匀并冻存于-80 ℃备用。
1.2.2 GST-CaME141G融合蛋白的诱导及表达取100 μL菌种加入到装有400 mL含50 μg/mL Amp的LB培养液的锥形瓶中,37 ℃、120 r/min振荡培养12~16 h。当OD600 nm为0.6~1.0范围内时,加入终浓度为1 mmol/L的IPTG 400 μL,37 ℃、120 r/min振荡培养4 h,诱导融合蛋白表达。
1.2.3 CaME141G的提取纯化菌液4 000 r/min离心10 min,弃上清。用PBS重悬沉淀(每400 mL菌液离心后的沉淀用20 mL PBS重悬),加入20 mg/mL溶菌酶和1 mol/L DTT各200 μL,混匀后冰上处理30 min,超声破碎30 min。15 000 r/min离心10 min,取上清置于15 mL EP管中,与PBS预先洗过的300 μL GS-4B beads于4 ℃孵育摇晃过夜。第二日清晨800 r/min离心,弃上清,用5 mL Tris buffer(pH8.0)清洗beads 3次,然后转移至2 mL EP管中,加495 μL Tris buffer、5 μL PreScission蛋白酶,室温旋转5 h,去除GST标签。800 r/min离心3 min,上清即是提取纯化的CaME141G蛋白,-20 ℃冻存备用。
1.2.4 CaME141G质粒DNA的酶切鉴定重组质粒具有SalⅠ和NotⅠ 2个限制性酶切位点。质粒DNA经双酶切后,行1.0%琼脂糖电泳鉴定。
1.2.5 CaME141G分子量和纯度的鉴定将纯化的CaME141G经5×SDS loading buffer蛋白上样缓冲液室温处理后,进行15%SDS-PAGE电泳,检测其相对分子量和纯度。
1.2.6 CaME141G浓度的测定参照碧云天Bradford蛋白浓度测定试剂盒说明,以牛血清白蛋白为标准品,测定CaME141G的浓度。
1.2.7 CaME141G生物活性的鉴定采用pull-down实验检测纯化后的CaME141G的活性。取连接于GS-4B beads的GST-PreIQ融合蛋白40 μL置于2 mL EP管中,加入0.001 mol/L CaCl2 3 μL([Ca2+]10 μmol/L),CaME141G(终浓度分别为0.7,1.4,2.1,3.5,7.0,10.0 μmol/L),用Tris buffer(pH8.0)补至总体系300 μL。4 ℃,孵育4 h。800 r/min,离心3 min,转移至1.5 mL EP管中,Tris buffer(10 μmol/L Ca2+)清洗beads 2次,加入15 μL 5×SDS loading buffer洗脱处理,取上清行15%SDS-PAGE电泳,鉴定纯化后的蛋白是否具有生物活性。
2 结果 2.1 重组质粒的酶切鉴定质粒pGEX-6P-3约为4 900 bp,SalⅠ和NotⅠ之间的碱基全长约为10 bp,CaME141G约为470 bp,质粒pGEX-6P-3经SalⅠ和NotⅠ双酶切插入CaME141G后,重组质粒全长约为5 360 bp。pGEX-6p-3/CaME141G重组质粒经双酶切后应得到2个碱基片段,即1个约为4 890 bp的大分子量DNA和1个约为470 bp的小分子量DNA。琼脂糖凝胶电泳结果显示,在4 890 bp和470 bp处均出现明显条带,结果与理论值相符,说明pGEX-6p-3/CaME141G融合蛋白质粒构建成功。见图 1。
2.2 重组质粒的DNA测序结果
DNA测序结果显示,CaM重组质粒是含有470 bp的DNA片段,CaM片段中的第422个碱基由A突变为G,所对应的第141个氨基酸由谷氨酸E突变为甘氨酸G,即CaME141G重组质粒。基因同一性比较为100%,氨基酸同一性比较为100%,且插入方向正确,读码框架正确,无移码突变,进一步证明构建重组质粒成功。见图 2。
2.3 纯化后蛋白的分子量和纯度的鉴定
CaME141G蛋白的表观分子量约为16 700。GST-CaME141G融合蛋白经PreScission蛋白酶酶切后,上清即是CaME141G蛋白。将GST-CaME141G融合蛋白、酶切之后的沉淀beads、CaME141G蛋白分别进行15%SDS-PAGE电泳后,可观察到在表观分子量约为42 700(GST-CaME141G)、26 000(GST)和16 700(CaME141G)处出现明显条带,与预期结果一致,且lane3中其他杂蛋白较少,表明提取纯化获得纯度较高的CaME141G蛋白。见图 3。
2.4 纯化后蛋白的浓度测定
采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒方法测定提纯后的蛋白浓度,计算CaME141G蛋白的浓度为1.39 mg/mL。
2.5 CaME141G蛋白活性的鉴定用pull-down实验检测CaME141G的蛋白活性,在10 μmol/L Ca2+条件下,将提纯后的蛋白与PreIQ蛋白片段相互作用,15%SDS-PAGE凝胶电泳,在表观分子量约16 700处出现明显条带,见图 4。且随着CaME141G蛋白浓度的增加,结合量也呈递增趋势,见图 5。以上结果说明提取纯化的CaME141G蛋白具有与钙通道蛋白结合的能力,即具有生物活性。
3 讨论
CaM通过传导和转换Ca2+信号来调节几个不同的离子通道(钙通道、钠通道、钾通道等)活性。当细胞内Ca2+水平升高时,CaM会结合4个Ca2+,在与CaM靶蛋白相互作用的区域维持一个开放的构象。研究发现,CaME141G突变体与Ca2+的亲和力比野生型CaM与Ca2+的亲和力降低了11倍,主要发生在CaM的C-lobe上。与之前报道[4-5, 10]的其他与LQTS或者CPVT相关的CaM突变体与Ca2+的亲和力降低的特性一致。表明,CaM与Ca2+结合特性发生变化是CaM突变体导致LQTS的病理机制的共性。
心肌CaV1.2钙通道通过与CaM的结合作用调节细胞内Ca2+浓度,CaME141G突变体与Ca2+的亲和力降低直接影响心肌CaV1.2钙通道的CDI作用。这是由于Ca2+与CaM结合特性发生变化,会损害CaV1.2钙通道的CDI作用。除了CaV1.2钙通道,CaM也参与调节心肌NaV1.5钠通道失活作用[13]。YIN等[11]研究发现与LQTS相关的CaM突变体(D96V、D130G和F142L)不影响NaV1.5钠通道作用,但后来发现CaMD130G会导致胎儿心肌NaV1.5钠通道晚期电流增加7.5倍。他们推测这种现象可能是因为CaM基因突变导致LQTS都发生在年幼时期,所以CaMD130G仅影响胎儿的钠离子通道。然而,接下来的研究表明,CaME141G突变体会影响成年人的心肌钠离子通道,导致NaV1.5钠通道晚期电流增加1.7倍,因此CaME141G是目前被发现的第1个既影响CaV1.2钙通道又影响成年人NaV1.5钠通道的突变体。此外,之前有报道[14]称,导致CPVT的CaM突变体N98S也有激活RyR2的作用,并且可能导致LQTS。表明与LQTS相关的CaM突变体不影响RyR2,而与CPVT相关的CaM突变体则会扰乱RyR2的生理作用。
CaM的基因突变会导致多种心血管系统疾病,严重威胁人类生命健康,关于CaM基因突变的研究大多是膜片钳技术测量电流变化和临床案例的探究,而对于导致这些疾病的机制还没有明确,仍需要进一步研究。
[1] |
KURSULA P. The many structural faces of calmodulin:a multitasking molecular jackknife[J]. Amino Acids, 2014, 46(10): 2295-2304. DOI:10.1007/s00726-014-1795-y |
[2] |
HALLING DB, Liebeskin BJD, Hall AW, et al. Conserved properties of individual Ca2+-binding sites in calmodulin[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2016, 113(9): E1216-E1225. DOI:10.1073/pnas.1600385113 |
[3] |
BEN-JOHNY M, YUE DT. Calmodulin regulation (calmodulation) of voltage-gated calcium channels[J]. J Gen Physiol, 2014, 143(6): 679-692. DOI:10.1085/jgp.201311153 |
[4] |
NYEGAARD M, OVERGAARD MT, SONDERGAARD MT, et al. Mutations in calmodulin cause ventricular tachycardia and sudden cardiac death[J]. Am J Hum Genet, 2012, 91(4): 703-712. DOI:10.1016/j.ajhg.2012.08.015 |
[5] |
CROTTI L, JOHNSON CN, GRAF E, et al. Calmodulin mutations associated with recurrent cardiac arrest in infants[J]. Circulation, 2013, 127(9): 1009-1017. DOI:10.1161/CIRCULATIONAHA.112.001216 |
[6] |
MARSMAN RF, BARC J, BEEKMAN L, et al. A mutation in CALM1 encoding calmodulin in familial idiopathic ventricular fibrillation in childhood and adolescence[J]. J Am Coll Cardiol, 2014, 63(3): 259-266. DOI:10.1016/j.jacc.2013.07.091 |
[7] |
MAKITA N, YAGIHARA N, CROTTI L, et al. Novel calmodulin mutations associated with congenital arrhythmia susceptibility[J]. Circ Cardiovasc Genet, 2014, 7(4): 466-474. DOI:10.1161/CIRCGENETICS.113.000459 |
[8] |
REED GJ, BOCZEK NJ, ETHERIDGE SP, et al. CALM3 mutation associated with long QT syndrome[J]. Heart Rhythm, 2015, 12(2): 419-422. DOI:10.1016/j.hrthm.2014.10.035 |
[9] |
FRIEDRICH FW, BAUSERO P, SUN Y, et al. A new polymorphism in human calmodulin Ⅲ gene promoter is a potential modifier gene for familial hypertrophic cardiomyopathy[J]. Eur Heart J, 2009, 30(13): 1648-1655. DOI:10.1093/eurheartj/ehp153 |
[10] |
LIMPITIKUL WB, DICK IE, JOSHI-MUKHERJEE R, et al. Calmodulin mutations associated with long QT syndrome prevent inactivation of cardiac L-type Ca(2+) currents and promote proarrhythmic behavior in ventricular myocytes[J]. J Mol Cell Cardiol, 2014, 74: 115-124. DOI:10.1016/j.yjmcc.2014.04.022 |
[11] |
YIN G, HASSAN F, HAROUN AR, et al. Arrhythmogenic calmodulin mutations disrupt intracellular cardiomyocyte Ca2+ regulation by distinct mechanisms[J]. J Am Heart Assoc, 2014, 3(3): e000996. DOI:10.1161/JAHA.114.000996 |
[12] |
BOCZEK NJ, GOMEZ-HURTADO N, YE D, et al. Spectrum and prevalence of CALM1-, CALM2-, and CALM3-encoded calmodulin variants in long QT syndrome and functional characterization of a novel long QT syndrome-associated calmodulin missense variant, E141G[J]. Circ Cardiovasc Genet, 2016, 9(2): 136-146. DOI:10.1161/CIRCGENETICS.115.001323 |
[13] |
GEORGE AL JR. Inherited disorders of voltage-gated sodium channels[J]. J Clin Invest, 2005, 115(8): 1990-1999. DOI:10.1172/JCI25505 |
[14] |
HWANG HS, NITU FR, YANG Y, et al. Divergent regulation of ryanodine receptor 2 calcium release channels by arrhythmogenic human calmodulin missense mutants[J]. Circ Res, 2014, 114(7): 1114-1124. DOI:10.1161/CIRCRESAHA.114.303391 |