文章信息
- 于婷, 王小梅
- YU Ting, WANG Xiaomei
- 通心络对高糖培养下心肌成纤维细胞增殖和凋亡的影响
- Effects of Tongxinluo on High Glucose-induced Proliferation and Apoptosis of Cardiac Fibroblasts
- 中国医科大学学报, 2018, 47(2): 132-136
- Journal of China Medical University, 2018, 47(2): 132-136
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文章历史
- 收稿日期:2017-06-10
- 网络出版时间:2018-01-08 10:54
2. 锦州医科大学附属第一医院老年医学科特需病房, 辽宁 锦州 121001
2. Special Needs Ward, Geriatrics Department, The First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University, Jinzhou 121001, China
心肌纤维化(myocardial fibrosis,MF)是指心肌间质中的心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)过度增殖和细胞外基质过度沉积的病理变化。MF的发生机制较为复杂,糖尿病时体内的高糖环境是引起MF的一个重要原因[1]。CFs是MF的主要作用细胞,在某些因素刺激下可过度增殖并分泌大量胶原蛋白,从而引起MF [2]。因此,寻找能够抑制CFs过度增殖的药物对治疗MF的意义重大。据目前多项研究[3]表明,通心络(tongxinluo,TXL)在治疗MF方面效果显著。糖尿病MF大鼠经过TXL的治疗后,其心功能及心肌超微结构得到明显改善,心肌组织间的胶原纤维沉积显著降低,MF得到有效控制。但TXL对CFs的影响目前国内外少有研究。本研究旨在用高糖培养模拟诱发MF的病理内环境,观察TXL对高糖培养下CFs增殖和凋亡的影响,探讨TXL治疗MF的可能机制。
1 材料与方法 1.1 材料1~3日龄的新生SD大鼠,雌雄不限(锦州医科大学实验动物中心提供);TXL超微粉(中国河北以岭药业提供),DMEM培养基(美国Hyclone公司),胎牛血清(美国Gibco公司),EDTA胰酶、MTT、DMSO(美国Sigma公司),鼠抗波形蛋白抗体(中国汉博士德生物工程有限公司),BCA蛋白定量试剂盒(美国Pierce公司),抗bax、Bcl-2、GAPDH多克隆抗体(英国Abcom公司),HRP结合的二抗(北京中杉公司);恒温CO2培养箱(美国Thermo Electron公司),离心机(德国Eppendorf公司),HJ-3数显恒温磁力搅拌器(巩义市子华仪器有限责任公司),显微镜(德国蔡司公司),酶标仪DNM-9602G,BIO-RAD电泳槽、Gel Doc凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad公司)。
1.2 方法 1.2.1 药物配制称取0.1 g TXL超微粉溶于100 mL无血清的高糖DMEM培养基,超声促溶30 min,5 000 g离心10 min,收集上清液,0.22 μm微孔滤器过滤除菌,将所得所有沉淀于60 ℃加热烘干,计算实际溶于培养基的药物重量,制成TXL母液,分装后于-20 ℃贮存备用[4]。
1.2.2 CFs的原代和传代培养取生后1~3 d的新生SD大鼠,无菌开胸取心脏,D-Hank’s液洗3次后移至小烧杯,加适量0.08%胰酶后剪成1 mm3碎块,加入磁力搅拌子,置于恒温(37 ℃)磁力搅拌器上水浴消化。第1次消化10 min,弃上清;以后每次消化8 min,吸取上清至离心管(预加血清终止消化),1 000 r/min离心8 min。弃上清,留取所有离心沉淀,加入含15%胎牛血清的DMEM培养液重悬细胞,150目筛网过滤重悬,接种于斜颈培养瓶后置于37 ℃、5%CO2的恒温培养箱中差速贴壁1.5 h [5-6]。1.5 h后吸弃培养液(含有未贴壁的杂质细胞),更换含15%胎牛血清的新鲜培养液后于培养箱中继续培养,以后每2 d更换1次培养液,待细胞长满后传代培养。
1.2.3 CFs免疫荧光鉴别波形蛋白正常情况下表达于成纤维细胞等间质细胞中,在心肌细胞和内皮细胞中不表达,所以可根据波形蛋白表达阳性来鉴别CFs[7]。取第2代CFs接种于放有无菌盖玻片的6孔培养板内,2 d后吸弃培养基,4%多聚甲醛固定,0.1% Triton X-100室温封闭30 min,5%BSA室温摇床封闭30 min。加1:200鼠抗波形蛋白抗体4 ℃过夜。加1:200 FITC标记的IgG二抗室温避光孵育30 min。荧光淬灭剂封片,于荧光显微镜下观察。
1.2.4 MTT检测CFs的增殖活力 1.2.4.1 高糖培养CFs作用时间的筛选实验分为低糖组和高糖组,每组取对数生长期的CFs接种于96孔培养板中,低糖组用低糖DMEM(葡萄糖浓度5.5 mmol/L)分别培养6、12、24、48、72 h,高糖组用高糖DMEM(葡萄糖浓度25 mmol/L)培养至相同时间点,每组各时间点设3个复孔,各组到达相应处理时间点后,加入5 mg/mL的MTT 20 μL继续孵育,4 h后吸去培养液,加入100 μL DMSO于摇床振荡10 min,在酶标仪490 nm波长下测定各孔吸光度(optical density,OD),筛选出高糖培养CFs的最佳作用时间。
1.2.4.2 TXL作用于高糖培养CFs的增殖活力检测按文献[8]筛选出TXL最佳作用浓度,以最佳作用时间干预,分组如下:对照组(低糖DMEM培养)、模型组(高糖DMEM培养)、20 μg/mL TXL组(高糖DMEM+20 μg/mLTXL培养)、80 μg/mL TXL组(高糖DMEM+80 μg/mLTXL培养)、320 μg/mL TXL组(高糖DMEM+320 μg/mLTXL培养),每组设3个复孔,MTT法检测每组CFs相应时间点的OD值,操作过程同上。
1.2.5 ELISA检测各组上清中Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的含量CFs以适宜浓度接种于24孔培养板,低糖DMEM培养。待细胞长至70%~80%时,分组并更换各组相应条件培养基,作用24 h后收集各组上清液,按照试剂盒说明用ELISA检测各组上清液中Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的含量。
1.2.6 Western blotting检测bax和bcl-2蛋白的表达各组细胞相应条件培养24 h后分别于冰上裂解30 min,4 ℃、12 000 r/min离心10 min,取上清液,BCA法测定蛋白质含量;取适量上清加入上样缓冲液充分混合,煮沸10 min,进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。转膜1 h,封闭1 h。一抗孵育过夜,TBS-T缓冲液洗脱3次。加入二抗于摇床上室温孵育1 h,TBS-T缓冲液洗脱3次。ECL显色,GAPDH为内参,凝胶分析软件分析各蛋白条带的OD值。
1.3 统计学分析采用SPSS 17.0软件进行数据分析,计量资料以x± s表示,多组间比较采用单因素方差分析,多组间两两比较采用LSD-t检验,P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 CFs的一般形态学观察大部分CFs培养1.5 h后贴壁,细胞成梭形或三角形,均匀散在分布。CFs生长迅速,约2~3 d即呈现融合状态,细胞增多,胞体增大,细胞排列密集,未见细胞搏动。见图 1。
2.2 CFs的免疫荧光鉴定结果
对第2代CFs进行波形蛋白免疫荧光染色,可见波形蛋白抗原表达呈阳性,符合实验要求。见图 2。
2.3 高糖培养CFs作用时间的筛选结果
MTT测得的OD值可以反映CFs的增殖活力。组内比较显示,低糖组和高糖组的OD值均随时间逐渐升高,但低糖组于48 h达峰值;而高糖组于24 h达峰值。2组间比较显示,高糖组各时间点的OD值均高于低糖组,且以24 h最为明显。说明高糖环境可以增强CFs的增殖活力,且以作用24 h时的增殖活力最强。见表 1。
Group | n | 6 h | 12 h | 24 h | 48 h | 72 h |
Low-glucose group | 3 | 0.242 1±0.014 93), 4), 5) | 0.289 9±0.021 03), 4), 5) | 0.348 6±0.023 31), 2), 4) | 0.438 5±0.021 91), 2), 3), 5) | 0.353 8±0.009 81), 2), 4) |
High-glucose group | 3 | 0.296 1±0.023 52), 3), 4), 6) | 0.412 6±0.035 31), 3), 4), 6) | 0.616 0±0.035 11), 2), 4), 5), 6) | 0.502 6±0.043 41), 2), 3), 5), 6) | 0.406 8±0.056 51), 3), 4) |
1) compared with the 6 h OD in each group, P < 0.05; 2) compared with the 12 h OD in each group, P < 0.05; 3) compared with the 24 h OD in each group, P < 0.05; 4) compared with the 48 h OD in each group, P < 0.05; 5) compared with the 72 h OD in each group, P < 0.05; 6) compared with the low glucose group at the same time point, P < 0.05. |
2.4 TXL作用于高糖培养CFs的增殖活力检测结果
模型组OD值与对照组相比显著升高(P < 0.05),差异有统计学意义;TXL浓度分别为80 μg/mL和320 μg/mL的TXL处理组OD值与模型组相比均显著下降(P均 < 0.05),差异有统计学意义。见表 2。
Group | n | OD |
Control group | 3 | 0.346 4±0.023 42), 3), 4), 5) |
Model group | 3 | 0.619 9±0.020 41), 4), 5) |
20 μg/mL TXL group | 3 | 0.574 3±0.044 11), 4), 5) |
80 μg/mL TXL group | 3 | 0.509 8±0.009 31), 2), 3), 5) |
320 μg/mL TXL group | 3 | 0.459 8±0.013 31), 2), 3), 4) |
1) compared with the control group, P < 0.05; 2) compared with the model group, P < 0.05; 3) compared with the 20 µg/mL TXL group, P < 0.05; 4) compared with the 80 µg/mL TXL group, P < 0.05; 5) compared with the 320 µg/mL TXL group, P < 0.05. |
2.5 ELISA检测各组Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白的含量结果
模型组Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白含量明显高于对照组(P < 0.05),差异有统计学意义;而TXL浓度分别为20、80、320 μg/mL的TXL处理组的Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白含量与模型组相比均显著降低(P均 < 0.05),差异有统计学意义。见表 3。
Group | n | TypeⅠcollagen (μg/L) | Type Ⅲ collagen (ng/L) |
Control group | 3 | 0.774 5±0.247 52), 3), 4) | 184.288 2±24.668 52), 3), 4), 5) |
Model group | 3 | 6.999 0±0.429 31), 3), 4), 5) | 783.407 9±16.847 41), 3), 4), 5) |
20 μg/mL TXL group | 3 | 3.879 5±0.388 21), 2), 4), 5) | 541.959 0±12.655 51), 2), 4), 5) |
80 μg/mL TXL group | 3 | 2.200 3±0.357 01), 2), 3), 5) | 438.438 7±10.653 11), 2), 3), 5) |
320 μg/mL TXL group | 3 | 1.403 3±0.412 32), 3), 4) | 318.448 7±13.637 11), 2), 3), 4) |
Compared with control group, 1) P < 0.05; compared with model group, 2) P < 0.05; compared with 20 μg/mL TXL group, 3) P < 0.05; compared with 80 μg/mL TXL group, 4) P < 0.05; compared with 320 μg/mL TXL group, 5) P < 0.05. |
2.6 Western blotting检测各组bax和bcl-2的表达
与对照组相比,模型组促凋亡的bax表达减少、抗凋亡的bcl-2表达显著增加。TXL浓度分别为20、80、320 μg/mL的TXL处理组与模型组相比,bax的表达明显上调、bcl-2表达显著下调。见图 3。
3 讨论
TXL是由人参、赤芍、水蛭、全蝎、土鳖虫、蝉蜕、蜈蚣、冰片组成的复方制剂。人参皂甙可以促进葡萄糖的有氧氧化和胰岛素的释放,还可通过减少组织内氧自由基、保护线粒体等作用来调控凋亡相关蛋白bcl-2和bax的表达[9];赤芍、水蛭、全蝎、土鳖虫具有抗凝、抑制血栓形成的功能;蝉蜕、蜈蚣、冰片则具有活血散瘀、通经祛风等功效。近年来,TXL在治疗心血管疾病尤其是MF、糖尿病微血管病变等方面已取得良好成效。
链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠在TXL治疗后,心脏病变有了明显改善。心脏的重量指数明显降低,左心室收缩压显著升高,左心室舒张末压显著降低,左心室内压最大上升速率和左心室内压最大下降速率都升高,且左心室内压最大下降速率比左心室内压最大上升速率升高明显,表明TXL可以改善糖尿病心肌病大鼠心脏舒缩功能障碍,尤其是舒张功能[10]。TXL还能通过调节转化生长因子β、基质金属蛋白酶9、组织金属蛋白抑制因子1三者的平衡以及TGF-β/Smad信号通路防治糖尿病大鼠的MF [11]。
本研究是在已有的动物实验的基础上,将TXL直接作用于与MF的发展密切相关的CFs,从细胞学角度进一步探究TXL防治MF的可能机制。CFs在某些病理因素的刺激下可过度增殖并转化为肌成纤维细胞[12],后者可分泌大量的Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白以增加心脏的僵硬度,进而影响心脏的舒缩功能,最终导致MF [13]。糖尿病时体内所形成的高糖环境是诱发MF的主要因素之一,其机制主要与氧化应激、晚期糖基化终产物的积累和激活蛋白激酶C有关[14-15]。本研究以高糖培养CFs模拟诱发MF的病理内环境,以低糖培养CFs作对照,对比观察不同剂量TXL干预后CFs的增殖和分泌情况,结果发现,高糖培养可以诱导CFs增殖并增强其分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的能力,而TXL可以抑制CFs在高糖环境中的增殖,还能减弱胶原蛋白的分泌。CFs的过度增殖也意味着其凋亡程序的减弱,因此,CFs凋亡的减少有可能也是构成MF的重要原因。Bcl-2家族是最重要的凋亡调控基因之一,既含有抗凋亡的bcl-2,又含有促进凋亡的bax,两者共同调控细胞的凋亡[16]。本研究发现,CFs在高糖环境中bcl-2表达增加、bax表达减少,凋亡减弱;而TXL具有通过降低bcl-2的表达、上调bax的表达未诱导CFs凋亡的作用。
目前,TXL治疗MF方面的实验研究大多以动物实验为主,而TXL对CFs的作用国内外实验少有研究和报道。本研究从细胞实验的角度证实了TXL可以通过抑制高糖环境中CFs的增殖和分泌,诱导CFs凋亡等途径发挥防治MF的作用,这不仅为TXL治疗MF提供了新的理论依据,更为糖尿病MF的治疗提供了新的思路。
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