中国医科大学学报  2018, Vol. 47 Issue (2): 132-136

文章信息

于婷, 王小梅
YU Ting, WANG Xiaomei
通心络对高糖培养下心肌成纤维细胞增殖和凋亡的影响
Effects of Tongxinluo on High Glucose-induced Proliferation and Apoptosis of Cardiac Fibroblasts
中国医科大学学报, 2018, 47(2): 132-136
Journal of China Medical University, 2018, 47(2): 132-136

文章历史

收稿日期:2017-06-10
网络出版时间:2018-01-08 10:54
通心络对高糖培养下心肌成纤维细胞增殖和凋亡的影响
于婷1 , 王小梅2     
1. 锦州医科大学研究生学院, 辽宁 锦州 121001;
2. 锦州医科大学附属第一医院老年医学科特需病房, 辽宁 锦州 121001
摘要目的 观察通心络对高糖培养下心肌成纤维细胞增殖和凋亡的影响,探讨其抑制心肌纤维化的可能机制。方法 原代和传代培养SD大鼠乳鼠的心肌成纤维细胞,并用免疫荧光染色法鉴定。细胞分为对照组(低糖DMEM培养)、模型组(高糖DMEM培养)和通心络处理组(高糖DMEM+通心络20、80、320 μg/mL培养)。MTT检测各组细胞的增殖活力;ELISA检测各组Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的分泌;Western blotting检测各组bax和bcl-2蛋白的表达。结果 模型组细胞的增殖活力及分泌的Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白均高于对照组,而通心络处理组细胞的增殖活力和分泌的胶原蛋白明显低于模型组;与对照组相比,模型组的bcl-2表达明显增多,bax表达减少;与模型组相比,通心络处理组的bcl-2表达减少,bax表达增加。结论 通心络可以减弱高糖培养下心肌成纤维细胞的增殖,并抑制其过度分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白,同时还可通过减少bcl-2、增加bax的表达诱导心肌成纤维细胞凋亡,从而发挥其治疗心肌纤维化的作用。
关键词心肌成纤维细胞    高糖    通心络    增殖    凋亡    
Effects of Tongxinluo on High Glucose-induced Proliferation and Apoptosis of Cardiac Fibroblasts
YU Ting1 , WANG Xiaomei2     
1. Graduate School of Jinzhou Medical University, Jinzhou 121001, China;
2. Special Needs Ward, Geriatrics Department, The First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University, Jinzhou 121001, China
Abstract: Objective This study investigated the effect of tongxinluo (TXL) on high glucose-induced proliferation and apoptosis of cardiac fibroblasts (CFs), to explore the possible mechanism by which TXL inhibits myocardial fibrosis.Methods Primary culture and subculture of neonatal SD rat CFs was carried out as follows. Immunofluorescence staining was performed to identify CFs. The CFs were divided into control group (cultured with low-glucose DMEM), model group (cultured with high-glucose DMEM), and TXL treatment groups (cultured with high-glucose DMEM+TXL at 20, 80, and 320 μg/mL). The proliferation of CFs in each group was detected by MTT assay. The expression of collagen types Ⅰ and Ⅲ in each group was detected by ELISA. Western blotting was used to detect the expression of bax and bcl-2 in each group.Results CFs Proliferation and collagen types Ⅰ and Ⅲ secretion were higher in the model group than in the control group. The CFs proliferation and collagen content in the TXL treatment groups were significantly lower than those in the model group. bcl-2 expression was significantly increased and bax expression was decreased in the model group, compared with the corresponding values in the control group. In comparison with the model group, bcl-2 expression was downregulated and bax expression was upregulated in the TXL treatment groups.Conclusion TXL can reduce the CFs proliferation and inhibit their collagen secretion under high glucose conditions. TXL also induces the CFs apoptosis by reducing bcl-2 expression and increasing bax expression. Thus, TXL can play a role in the treatment of myocardial fibrosis.
Keywords: cardiac fibroblasts    highglucose    tongxinluo    proliferation    apoptosis    

心肌纤维化(myocardial fibrosis,MF)是指心肌间质中的心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)过度增殖和细胞外基质过度沉积的病理变化。MF的发生机制较为复杂,糖尿病时体内的高糖环境是引起MF的一个重要原因[1]。CFs是MF的主要作用细胞,在某些因素刺激下可过度增殖并分泌大量胶原蛋白,从而引起MF [2]。因此,寻找能够抑制CFs过度增殖的药物对治疗MF的意义重大。据目前多项研究[3]表明,通心络(tongxinluo,TXL)在治疗MF方面效果显著。糖尿病MF大鼠经过TXL的治疗后,其心功能及心肌超微结构得到明显改善,心肌组织间的胶原纤维沉积显著降低,MF得到有效控制。但TXL对CFs的影响目前国内外少有研究。本研究旨在用高糖培养模拟诱发MF的病理内环境,观察TXL对高糖培养下CFs增殖和凋亡的影响,探讨TXL治疗MF的可能机制。

1 材料与方法 1.1 材料

1~3日龄的新生SD大鼠,雌雄不限(锦州医科大学实验动物中心提供);TXL超微粉(中国河北以岭药业提供),DMEM培养基(美国Hyclone公司),胎牛血清(美国Gibco公司),EDTA胰酶、MTT、DMSO(美国Sigma公司),鼠抗波形蛋白抗体(中国汉博士德生物工程有限公司),BCA蛋白定量试剂盒(美国Pierce公司),抗bax、Bcl-2、GAPDH多克隆抗体(英国Abcom公司),HRP结合的二抗(北京中杉公司);恒温CO2培养箱(美国Thermo Electron公司),离心机(德国Eppendorf公司),HJ-3数显恒温磁力搅拌器(巩义市子华仪器有限责任公司),显微镜(德国蔡司公司),酶标仪DNM-9602G,BIO-RAD电泳槽、Gel Doc凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 药物配制

称取0.1 g TXL超微粉溶于100 mL无血清的高糖DMEM培养基,超声促溶30 min,5 000 g离心10 min,收集上清液,0.22 μm微孔滤器过滤除菌,将所得所有沉淀于60 ℃加热烘干,计算实际溶于培养基的药物重量,制成TXL母液,分装后于-20 ℃贮存备用[4]

1.2.2 CFs的原代和传代培养

取生后1~3 d的新生SD大鼠,无菌开胸取心脏,D-Hank’s液洗3次后移至小烧杯,加适量0.08%胰酶后剪成1 mm3碎块,加入磁力搅拌子,置于恒温(37 ℃)磁力搅拌器上水浴消化。第1次消化10 min,弃上清;以后每次消化8 min,吸取上清至离心管(预加血清终止消化),1 000 r/min离心8 min。弃上清,留取所有离心沉淀,加入含15%胎牛血清的DMEM培养液重悬细胞,150目筛网过滤重悬,接种于斜颈培养瓶后置于37 ℃、5%CO2的恒温培养箱中差速贴壁1.5 h [5-6]。1.5 h后吸弃培养液(含有未贴壁的杂质细胞),更换含15%胎牛血清的新鲜培养液后于培养箱中继续培养,以后每2 d更换1次培养液,待细胞长满后传代培养。

1.2.3 CFs免疫荧光鉴别

波形蛋白正常情况下表达于成纤维细胞等间质细胞中,在心肌细胞和内皮细胞中不表达,所以可根据波形蛋白表达阳性来鉴别CFs[7]。取第2代CFs接种于放有无菌盖玻片的6孔培养板内,2 d后吸弃培养基,4%多聚甲醛固定,0.1% Triton X-100室温封闭30 min,5%BSA室温摇床封闭30 min。加1:200鼠抗波形蛋白抗体4 ℃过夜。加1:200 FITC标记的IgG二抗室温避光孵育30 min。荧光淬灭剂封片,于荧光显微镜下观察。

1.2.4 MTT检测CFs的增殖活力

1.2.4.1 高糖培养CFs作用时间的筛选

实验分为低糖组和高糖组,每组取对数生长期的CFs接种于96孔培养板中,低糖组用低糖DMEM(葡萄糖浓度5.5 mmol/L)分别培养6、12、24、48、72 h,高糖组用高糖DMEM(葡萄糖浓度25 mmol/L)培养至相同时间点,每组各时间点设3个复孔,各组到达相应处理时间点后,加入5 mg/mL的MTT 20 μL继续孵育,4 h后吸去培养液,加入100 μL DMSO于摇床振荡10 min,在酶标仪490 nm波长下测定各孔吸光度(optical density,OD),筛选出高糖培养CFs的最佳作用时间。

1.2.4.2 TXL作用于高糖培养CFs的增殖活力检测

按文献[8]筛选出TXL最佳作用浓度,以最佳作用时间干预,分组如下:对照组(低糖DMEM培养)、模型组(高糖DMEM培养)、20 μg/mL TXL组(高糖DMEM+20 μg/mLTXL培养)、80 μg/mL TXL组(高糖DMEM+80 μg/mLTXL培养)、320 μg/mL TXL组(高糖DMEM+320 μg/mLTXL培养),每组设3个复孔,MTT法检测每组CFs相应时间点的OD值,操作过程同上。

1.2.5 ELISA检测各组上清中Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的含量

CFs以适宜浓度接种于24孔培养板,低糖DMEM培养。待细胞长至70%~80%时,分组并更换各组相应条件培养基,作用24 h后收集各组上清液,按照试剂盒说明用ELISA检测各组上清液中Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的含量。

1.2.6 Western blotting检测bax和bcl-2蛋白的表达

各组细胞相应条件培养24 h后分别于冰上裂解30 min,4 ℃、12 000 r/min离心10 min,取上清液,BCA法测定蛋白质含量;取适量上清加入上样缓冲液充分混合,煮沸10 min,进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。转膜1 h,封闭1 h。一抗孵育过夜,TBS-T缓冲液洗脱3次。加入二抗于摇床上室温孵育1 h,TBS-T缓冲液洗脱3次。ECL显色,GAPDH为内参,凝胶分析软件分析各蛋白条带的OD值。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行数据分析,计量资料以x± s表示,多组间比较采用单因素方差分析,多组间两两比较采用LSD-t检验,P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 CFs的一般形态学观察

大部分CFs培养1.5 h后贴壁,细胞成梭形或三角形,均匀散在分布。CFs生长迅速,约2~3 d即呈现融合状态,细胞增多,胞体增大,细胞排列密集,未见细胞搏动。见图 1

A-C, cardiac fibroblasts with differential adhesion at 1.5 h; D-F, primary cultured cardiac fibroblasts at 48 h; G-I, primary cultured cardiac fibroblasts at 96 h. A, D, G×100; B, E, H×200; C, F, I×400. 图 1 不同时间原代培养的CFs Fig.1 Primary cultured cardiac fibroblasts at different time points

2.2 CFs的免疫荧光鉴定结果

对第2代CFs进行波形蛋白免疫荧光染色,可见波形蛋白抗原表达呈阳性,符合实验要求。见图 2

Green fluorescence is the positive expression of vimentin. 图 2 CFs免疫荧光鉴定×200 Fig.2 CFs identification using immunofluorescence ×200

2.3 高糖培养CFs作用时间的筛选结果

MTT测得的OD值可以反映CFs的增殖活力。组内比较显示,低糖组和高糖组的OD值均随时间逐渐升高,但低糖组于48 h达峰值;而高糖组于24 h达峰值。2组间比较显示,高糖组各时间点的OD值均高于低糖组,且以24 h最为明显。说明高糖环境可以增强CFs的增殖活力,且以作用24 h时的增殖活力最强。见表 1

表 1 低糖组和高糖组各时间点OD值(x± s) Tab.1 OD values for the low-and high-glucose groups at each time point (x± s)
Group n 6 h 12 h 24 h 48 h 72 h
Low-glucose group 3 0.242 1±0.014 93), 4), 5) 0.289 9±0.021 03), 4), 5) 0.348 6±0.023 31), 2), 4) 0.438 5±0.021 91), 2), 3), 5) 0.353 8±0.009 81), 2), 4)
High-glucose group 3 0.296 1±0.023 52), 3), 4), 6) 0.412 6±0.035 31), 3), 4), 6) 0.616 0±0.035 11), 2), 4), 5), 6) 0.502 6±0.043 41), 2), 3), 5), 6) 0.406 8±0.056 51), 3), 4)
1) compared with the 6 h OD in each group, P < 0.05; 2) compared with the 12 h OD in each group, P < 0.05; 3) compared with the 24 h OD in each group, P < 0.05; 4) compared with the 48 h OD in each group, P < 0.05; 5) compared with the 72 h OD in each group, P < 0.05; 6) compared with the low glucose group at the same time point, P < 0.05.

2.4 TXL作用于高糖培养CFs的增殖活力检测结果

模型组OD值与对照组相比显著升高(P < 0.05),差异有统计学意义;TXL浓度分别为80 μg/mL和320 μg/mL的TXL处理组OD值与模型组相比均显著下降(P均 < 0.05),差异有统计学意义。见表 2

表 2 各组CFs的OD值比较(x± s) Tab.2 OD values for each group (x± s)
Group n OD
Control group 3 0.346 4±0.023 42), 3), 4), 5)
Model group 3 0.619 9±0.020 41), 4), 5)
20 μg/mL TXL group 3 0.574 3±0.044 11), 4), 5)
80 μg/mL TXL group 3 0.509 8±0.009 31), 2), 3), 5)
320 μg/mL TXL group 3 0.459 8±0.013 31), 2), 3), 4)
1) compared with the control group, P < 0.05; 2) compared with the model group, P < 0.05; 3) compared with the 20 µg/mL TXL group, P < 0.05; 4) compared with the 80 µg/mL TXL group, P < 0.05; 5) compared with the 320 µg/mL TXL group, P < 0.05.

2.5 ELISA检测各组Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白的含量结果

模型组Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白含量明显高于对照组(P < 0.05),差异有统计学意义;而TXL浓度分别为20、80、320 μg/mL的TXL处理组的Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白含量与模型组相比均显著降低(P均 < 0.05),差异有统计学意义。见表 3

表 3 ELISA检测各组Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白的含量(x± s) Tab.3 Collagen types Ⅰ and Ⅲ content in each group, detected by ELISA (x± s)
Group n TypeⅠcollagen (μg/L) Type Ⅲ collagen (ng/L)
Control group 3 0.774 5±0.247 52), 3), 4) 184.288 2±24.668 52), 3), 4), 5)
Model group 3 6.999 0±0.429 31), 3), 4), 5) 783.407 9±16.847 41), 3), 4), 5)
20 μg/mL TXL group 3 3.879 5±0.388 21), 2), 4), 5) 541.959 0±12.655 51), 2), 4), 5)
80 μg/mL TXL group 3 2.200 3±0.357 01), 2), 3), 5) 438.438 7±10.653 11), 2), 3), 5)
320 μg/mL TXL group 3 1.403 3±0.412 32), 3), 4) 318.448 7±13.637 11), 2), 3), 4)
Compared with control group, 1) P < 0.05; compared with model group, 2) P < 0.05; compared with 20 μg/mL TXL group, 3) P < 0.05; compared with 80 μg/mL TXL group, 4) P < 0.05; compared with 320 μg/mL TXL group, 5) P < 0.05.

2.6 Western blotting检测各组bax和bcl-2的表达

与对照组相比,模型组促凋亡的bax表达减少、抗凋亡的bcl-2表达显著增加。TXL浓度分别为20、80、320 μg/mL的TXL处理组与模型组相比,bax的表达明显上调、bcl-2表达显著下调。见图 3

1, control group; 2, model group; 3, 20 μg/mL TXL group; 4, 80 μg/mL TXL group; 5, 320 μg/mL TXL group. 图 3 Western blotting检测各组bax和bcl-2蛋白表达水平 Fig.3 Detection of bax and bcl-2 protein expression by Western blotting

3 讨论

TXL是由人参、赤芍、水蛭、全蝎、土鳖虫、蝉蜕、蜈蚣、冰片组成的复方制剂。人参皂甙可以促进葡萄糖的有氧氧化和胰岛素的释放,还可通过减少组织内氧自由基、保护线粒体等作用来调控凋亡相关蛋白bcl-2和bax的表达[9];赤芍、水蛭、全蝎、土鳖虫具有抗凝、抑制血栓形成的功能;蝉蜕、蜈蚣、冰片则具有活血散瘀、通经祛风等功效。近年来,TXL在治疗心血管疾病尤其是MF、糖尿病微血管病变等方面已取得良好成效。

链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠在TXL治疗后,心脏病变有了明显改善。心脏的重量指数明显降低,左心室收缩压显著升高,左心室舒张末压显著降低,左心室内压最大上升速率和左心室内压最大下降速率都升高,且左心室内压最大下降速率比左心室内压最大上升速率升高明显,表明TXL可以改善糖尿病心肌病大鼠心脏舒缩功能障碍,尤其是舒张功能[10]。TXL还能通过调节转化生长因子β、基质金属蛋白酶9、组织金属蛋白抑制因子1三者的平衡以及TGF-β/Smad信号通路防治糖尿病大鼠的MF [11]

本研究是在已有的动物实验的基础上,将TXL直接作用于与MF的发展密切相关的CFs,从细胞学角度进一步探究TXL防治MF的可能机制。CFs在某些病理因素的刺激下可过度增殖并转化为肌成纤维细胞[12],后者可分泌大量的Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白以增加心脏的僵硬度,进而影响心脏的舒缩功能,最终导致MF [13]。糖尿病时体内所形成的高糖环境是诱发MF的主要因素之一,其机制主要与氧化应激、晚期糖基化终产物的积累和激活蛋白激酶C有关[14-15]。本研究以高糖培养CFs模拟诱发MF的病理内环境,以低糖培养CFs作对照,对比观察不同剂量TXL干预后CFs的增殖和分泌情况,结果发现,高糖培养可以诱导CFs增殖并增强其分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的能力,而TXL可以抑制CFs在高糖环境中的增殖,还能减弱胶原蛋白的分泌。CFs的过度增殖也意味着其凋亡程序的减弱,因此,CFs凋亡的减少有可能也是构成MF的重要原因。Bcl-2家族是最重要的凋亡调控基因之一,既含有抗凋亡的bcl-2,又含有促进凋亡的bax,两者共同调控细胞的凋亡[16]。本研究发现,CFs在高糖环境中bcl-2表达增加、bax表达减少,凋亡减弱;而TXL具有通过降低bcl-2的表达、上调bax的表达未诱导CFs凋亡的作用。

目前,TXL治疗MF方面的实验研究大多以动物实验为主,而TXL对CFs的作用国内外实验少有研究和报道。本研究从细胞实验的角度证实了TXL可以通过抑制高糖环境中CFs的增殖和分泌,诱导CFs凋亡等途径发挥防治MF的作用,这不仅为TXL治疗MF提供了新的理论依据,更为糖尿病MF的治疗提供了新的思路。

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