中国医科大学学报  2018, Vol. 47 Issue (12): 1102-1106

文章信息

窦磊, 庞晓燕, 李奇, 尚海, 张颐
DOU Lei, PANG Xiaoyan, LI Qi, SHANG Hai, ZHANG Yi
去酰基化ghrelin抑制上皮性卵巢癌细胞的增殖
Des-Acyl Ghrelin Inhibits the Proliferation of Ovarian Epithelial Carcinoma Cells
中国医科大学学报, 2018, 47(12): 1102-1106
Journal of China Medical University, 2018, 47(12): 1102-1106

文章历史

收稿日期:2018-09-30
网络出版时间:2018-11-28 16:48
去酰基化ghrelin抑制上皮性卵巢癌细胞的增殖
窦磊1 , 庞晓燕1 , 李奇1 , 尚海2 , 张颐1     
1. 中国医科大学附属第一医院妇科, 沈阳 110001;
2. 辽宁省肿瘤医院肝胆胰外科, 沈阳 110042
摘要目的 探讨去酰基化ghrelin(DAG)对上皮性卵巢癌细胞增殖的作用及其相关分子机制。方法 培养上皮性卵巢癌细胞SKOV3,以DAG处理,并予以激动剂干预哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和经典Wnt信号途径,采用CCK-8法测定细胞增殖。结果 DAG呈剂量依赖性抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖。DAG抑制mTOR信号途径,抑制经典Wnt信号转录活性以及下游靶基因的mRNA水平,mTOR和Wnt信号激活可在一定程度上翻转DAG对SKOV3细胞增殖的抑制作用。结论 DAG通过抑制mTOR和经典Wnt信号通路发挥其抑制卵巢癌细胞增殖的作用,为卵巢癌防治提供新思路。
关键词去酰基化ghrelin    上皮性卵巢癌    增殖    mTOR信号途径    Wnt信号途径    
Des-Acyl Ghrelin Inhibits the Proliferation of Ovarian Epithelial Carcinoma Cells
DOU Lei1 , PANG Xiaoyan1 , LI Qi1 , SHANG Hai2 , ZHANG Yi1     
1. Department of Gynecology, The First Hospital, China Medical University, Shenyang 110001, China;
2. Department of Hepatobiliary Surgery, Liaoning Tumor Hospital & Institute, Shenyang 110042, China
Abstract: Objective To assess the effect of des-acyl ghrelin (DAG) on the proliferation of ovarian epithelial carcinoma cells and the related mechanism. Methods SKOV3 ovarian epithelial carcinoma cells were cultured and treated with DAG, with or without mammalian target of rapamycin (mTOR) and Wnt signaling pathway activator. Cell proliferation was measured by the CCK-8 assay. Results DAG inhibited the proliferation and growth of SKOV3 cells in a dose-dependent manner. DAG exposure induced the inhibition of the mTOR and Wnt signaling pathways. Activation of these two pathways blocked the inhibition of SKOV3 cell proliferation by DAG. Conclusion DAG inhibits the proliferation of SKOV3 ovarian epithelial carcinoma cells through the mTOR and Wnt signaling pathways, and may contribute to prevention and therapy of ovarian epithelial carcinoma.

卵巢癌是女性常见恶性肿瘤,其发病率高,死亡率占各类妇科肿瘤首位。由于就诊时卵巢癌患者多为晚期,卵巢癌5年生存率仅约30%。尽管近年化疗取得重要进展,但卵巢癌5年生存率无明显提高[1]。目前认为上皮性卵巢癌的组织学起源具有多样性,遗传因素和环境因素等导致的基因突变,机体内分泌激素、生长因子等的异常分泌,均可导致上皮性卵巢癌[2]。因此,研究导致上皮性卵巢癌发生的致病因素和分子机制,可为卵巢癌的早期诊断和有效治疗提供理论依据。

多种细胞因子参与了卵巢癌的发生和发展。本课题组的前期研究[3]表明,酰基化的胃肠激素ghrelin可抑制上皮性卵巢癌细胞的增殖。ghrelin主要由胃黏膜X/A样细胞分泌,由28个氨基酸组成,在人体其他组织如下丘脑、垂体、海马、大脑皮质、小肠、胰腺及胎盘中,也都有少量的合成[4]。ghrelin存在独特的翻译后修饰,即第3位丝氨酸残基在ghrelin酰基化酶的作用下发生酰基化(主要为辛酰化)[4-5],形成酰基化ghrelin(acyl ghrelin,AG),这种酰基化对ghrelin结合并激活其受体——生长激素促泌素受体1a(growth hormone secretagogue receptor 1a,GHSR1a)十分关键[4]。AG可以通过作用于这种G蛋白耦联受体,发挥刺激垂体生长激素释放、刺激摄食、调节能量代谢等作用。因此长期以来,人们认为AG是ghrelin的活性形式,而在血液中占较大比例(90%)的去酰基化ghrelin(des-acyl ghrelin,DAG)并无生物学活性。然而越来越多的临床证据表明,虽然不能激活GHSR1a,DAG仍然具有生物学功能。本研究通过观察DAG对卵巢癌细胞增殖的影响,旨在为分子生物靶向治疗卵巢癌提供新的思路。

1 材料与方法 1.1 试剂

DAG(美国Phoenix Pharmaceuticals公司),亮氨酸(美国Santa Cruz公司),Wnt通路激动剂SKL2001(美国Sigma公司),CCK-8细胞增殖检测试剂盒(日本同仁化学公司);Trizol、RNA提取及逆转录试剂盒、萤光素酶报告基因检测试剂盒(美国Promega公司),Taq酶(北京天根公司),Evergreen荧光染料(美国Biotium公司),兔抗总核糖体蛋白S6和磷酸化S6(美国Cell Signaling Technology公司),Wnt信号通路活性检测FOPF质粒(美国Millipore公司),jetPEI转染试剂(美国Polyplus-transfection公司)。其他试剂均购于美国Sigma公司。

1.2 细胞培养及CCK-8检测细胞增殖

上皮性卵巢癌SKOV3细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基,达到对数生长期后接种于96孔板(1×104/孔)。12 h待贴壁后更换含不同浓度(10-10,10-9,10-8,10-7 mol/L)DAG的RPMI 1640培养液,以不含DAG的相同胎牛血清浓度的RPMI 1640完全培养液作为对照,或者加入亮氨酸、SKL2001处理48 h后收样,每孔加入10 μL CCK-8试剂,孵箱内37 ℃放置1~4 h后,使用酶标仪测定450 nm波长的光吸收值[6-8]

1.3 RNA提取

SKOV3细胞接种于6孔板,依上述处理后,弃去培养液,PBS洗涤,加入1 mL Trizol试剂晃动并吹打,待细胞全部裂解后移入EP管,室温放置10 min;加入氯仿0.2 mL,剧烈颠倒混匀抽提15 s,室温放置5 min,4 ℃下12 000 g离心15 min;上层水相转移到新EP管中,加入等体积异丙醇充分混匀,置于-70 ℃沉淀2 h,4 ℃下12 000 g离心10 min;弃上清,用预冷的1 mL 75%乙醇洗涤沉淀后,4 ℃下12 000 g离心10 min;弃上清后瞬时离心,吸去残液。晾干5~10 min后加20~50 μL去RNA酶纯水溶解并定量[6-8]

1.4 实时定量PCR

使用Promega公司的逆转录试剂盒进行cDNA第一链的合成,RNA逆转录反应为20 μL反应体系,2 μg RNA起始量,依照试剂盒说明书进行[6-8]。实时定量PCR为25 μL反应体系,以逆转录反应混合物1 μL为模板。扩增条件:94 ℃预变性5 min,94 ℃变性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,40个循环后72 ℃延伸5 min[6-8]。采用Stratagene Mx3000软件进行分析。引物序列:人增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)上游5’-TGTTGGAGGCACTCAAGGAC-3’,下游5’-TCATTGCCGGCGCATTTTAG-3’;人c-myc上游5’-TGCTCCATGAGGAGACACC-3’,下游5’-CTTTTCCACAGAAACAACATCG-3’;人cyclinD1上游5’-GAAGATCGTCGCCACCTG-3’,下游5’-GACCTCCTCCTCGCACTTCT-3’;人β-actin上游5’-ATCTGGCACCACACCTTC-3’,下游5’-AGCCAGGTCCAGACGCA-3’ [6-8]

1.5 荧光素酶活性测定

SKOV3细胞种植于12孔板中,以jetPEI试剂转染0.5 μg质粒6 h后,给予DAG处理,孵育24 h后弃去培养液,PBS洗涤后匀浆,采用Promega公司的Dual-LuciferaseTM Reporter Assay System检测荧光素酶活性[7, 9]

1.6 统计学分析

采用Prism软件进行分析和作图。数据以x±s表示,多组间比较采用单因素方差分析,进一步组间两两比较采用Student-Newman-Keuls法。2组间比较采用组间t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 DAG呈剂量依赖性抑制SKOV3细胞增殖

本研究首先探讨了DAG对SKOV3细胞增殖的直接作用。CCK-8检测结果显示,10-10~10-7 mol/L的DAG作用SKOV3细胞48 h可以显著抑制细胞增殖(P < 0.05,图 1B),且随着胎牛血清浓度的增加,这种抑制作用仍然存在(图 1A)。实时定量PCR结果亦显示,DAG组PCNA mRNA表达水平仅为对照组的50.4%,提示DAG组PCNA的表达显著被抑制。

A,SKOV3 cells were untreated(control)or treated with DAG(10-7 mol/L)using increasing amounts of fetal bovine serum for 48 h,and cell numbers were assessed;B,SKOV3 cells were treated with different concentrations(10-10,10-9,10-8,and 10-7 mol/L)of DAG for 48 h,and cell viability was detected using the CCK-8 assay. * P < 0.05 vs control group. # P < 0.05 vs 0 mol/L DAG group. 图 1 CCK-8检测DAG对SKOV3细胞增殖的抑制作用 Fig.1 DAG inhibition of SKOV3 cell proliferation as detected by the CCK-8 assay

2.2 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号途径参与DAG对SKOV3细胞增殖的抑制作用

本研究进一步探讨了DAG抑制SKOV3细胞增殖的可能机制。结果发现,10-7 nmol/L的DAG可显著抑制SKOV3细胞中mTOR下游靶分子核糖体蛋白S6的磷酸化激活水平(图 2),而以支链氨基酸亮氨酸激活mTOR信号途径后,可以翻转DAG对SKOV3细胞增殖的抑制作用(图 3)。

图 2 Western blotting检测mTOR下游靶分子S6的磷酸化水平 Fig.2 Phosphorylation level of the target molecule S6 downstream of mTOR as detected by western blotting

* P < 0.05 vs control group;# P < 0.05 vs DAG group. 图 3 CCK-8检测mTOR激动剂亮氨酸翻转DAG对SKOV3细胞增殖的抑制作用 Fig.3 Inhibition of SKOV3 cell proliferation by the mTOR agonist, leucine-flipped DAG, as detected by the CCK-8 assay

2.3 DAG抑制SKOV3细胞经典Wnt信号通路

FOPF质粒是一种测定细胞内β-catenin介导的转录活性的方法,本研究以TOPFlash为报告质粒、FOPFlash为阴性对照,以pRL-TK质粒为内参,SKOV3细胞jetPEI试剂转染6 h后,10-7 mol/L的DAG处理24 h后进行双荧光素酶活性检测,结果显示DAG刺激下TOPFlash/FOPFlash比值明显低于对照组(P < 0.05,图 4A),经典Wnt信号传导通路下游靶基因c-myc与cyclinD1 mRNA水平明显下调(P < 0.05,图 4B)。说明DAG可抑制经典Wnt信号通路,使下游转录活性明显降低。而以经典Wnt通路激动剂SKL2001处理后,可以翻转DAG对SKOV3细胞增殖的抑制作用(图 5)。

A,cells were transfected with TOPFlash/FOPFlash and pRL-TK plasmids for 6 h,then incubated with DAG(10-7 mol/L)or remained untreated. After 24 h,the cells were then lysed and luciferase activity was measured;B,cells were untreated(control)or treated with DAG(10-7 mol/L)for 24 h,and expressions of c-myc and cyclinD1,the downstream targets of the Wnt signaling pathway,were detected by RT-PCR. * P < 0.05 vs FOPFlash. # P < 0.05 vs control group. 图 4 DAG抑制经典Wnt信号通路 Fig.4 DAG inhibits the classical Wnt signaling pathway

* P < 0.05 vs control group;# P < 0.05 vs DAG group. 图 5 Wnt信号通路激动剂SKL2001翻转DAG对SKOV3细胞增殖的抑制作用 Fig.5 Inhibition of SKOV3 cell proliferation by the Wnt signaling pathway activator, SKL2001, and DAG turnover

3 讨论

本研究首次证实了DAG可通过mTOR信号途径和经典Wnt信号途径抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖。依据如下:(1)DAG处理卵巢癌SKOV3细胞可抑制其增殖(图 1);(2)DAG可抑制mTOR信号通路(图 2)和经典Wnt信号转录活性及下游靶基因mRNA水平(图 4);(3)激活mTOR(图 3)和Wnt信号途径(图 5)可在一定程度上翻转由DAG抑制的卵巢癌SKOV3细胞增殖。

DAG与AG具有相同的氨基酸序列,只是其第3位氨基酸(丝氨酸3)没有辛酰化[10]。起初,尽管DAG占据循环中总ghrelin的90%以上,但其长期以来被认为是AG的一种降解产物,并且没有生物学活性[11]。因其在生理学浓度范围内不能结合激活GHSR1a,所以在研究领域并未受到应有的重视[4, 12]。2004年,BROGLIO等[13]扭转了普遍观点,提出DAG也是一种激素。经实验证实,DAG可以拮抗AG某些生物学活性[14-15],中枢或腹腔内注射时,可以抑制AG的促食欲作用[16];或者作为一种与AG完全无关的多肽而存在[17-18]。DAG与AG也可能存在相同的作用。总体来说,就外周作用而言,DAG在调节葡萄糖或胰岛素代谢[19-21]、能量平衡[22]、胃肠蠕动[23]等方面存在与AG相反的作用,而在心血管方面的作用[12]则类似于AG。本研究发现,在卵巢癌细胞增殖方面,DAG与AG起到协同作用,均可抑制肿瘤细胞的增殖。

mTOR可感受细胞内外能量水平,通过调节蛋白转录和翻译从而调节细胞和组织的存活、生长、增殖和分化[24]。mTOR的抑制剂雷帕霉素则可以抑制mTOR下游S6核糖体蛋白,抑制PCNA基因的转录,调节细胞周期和分化。本研究阐明了DAG可以抑制mTOR及其下游靶分子S6的磷酸化激活,进而抑制PCNA基因的转录,从而抑制卵巢癌细胞的增殖。

Wnt信号通路最初由小鼠乳腺癌中发现,经典途径激活过程中,胞质β-catenin降解受抑制,异常蓄积,之后β-catenin进入细胞核,与T细胞因子或淋巴增强因子形成转录因子复合体,调控cyclinD1c-myc等下游靶基因的转录表达[25-26],在肿瘤细胞的增殖和去分化过程中起着非常重要的作用。研究[27]表明,β-catenin在正常卵巢、良性卵巢肿瘤、交界性卵巢肿瘤及卵巢癌组织中的异常表达依次呈上升趋势,这种异常分布与肿瘤的浸润程度和淋巴结转移均相关;Wnt信号通路还可参与肝癌细胞的增殖[7]。本研究表明,DAG可抑制β-catenin介导的转录活性;并且Wnt的下游靶基因cyclinD1c-myc转录表达水平亦明显下降。本研究结果表明,DAG可能通过抑制Wnt信号通路,抑制了卵巢癌SKOV3细胞的增殖。

综上所述,本研究发现,DAG可通过抑制mTOR信号通路和经典Wnt信号通路抑制卵巢癌细胞的增殖,从而为卵巢癌的治疗提出新的思路。

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