结肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤，随着医疗水平的进步，结肠癌治疗取得了很大的进展，但复发率始终居高不下，Ⅲ~Ⅳ期大肠癌患者的5年生存率较低^[1-3]。因此，结肠癌的早期诊断和特异性治疗尤为重要。

microRNA (miRNAs)是一组非编码RNA。miRNAs参与多种生理活动和病理进程。很多miRNAs在结肠癌中异常表达，miR-31和miR-182在结肠癌中低表达，对结肠癌细胞的生长迁移有一定的抑制作用^[4]。在SW480细胞中过表达miR-143或miR-145可以促进细胞程序化死亡^[5]。结肠癌细胞中过表达miR-126可以降低细胞的增殖率^[4]。所有研究均提示miRNAs可能成为结肠癌治疗的潜在靶点^[6]。实验研究^[7]表明miR-98在结肠癌中可以调节Warburg效应，抑制乳酸生成，但是具体机制尚不清楚。

本研究分析40例结肠癌患者癌组织标本miR-98表达情况，MTT实验和Hochest 33258染色判断miR-98对HCT116细胞增殖、凋亡的影响，旨在探讨结肠癌组织中miR-98的表达及作用机制。

1 材料与方法 1.1 材料

选取辽宁中医药大学附属医院2010年至2015年40例术前未接受过放化疗的结肠癌患者的肿瘤组织及癌旁组织，组织取下后置于-180 ℃液氮中备用。其中 < 60岁7例，≥60岁33例；TNM分期Ⅰ期7例、Ⅱ期25例、Ⅲ期8例。其他材料包括HCT116细胞(实验室冻存)，DMEM培养基(美国HyClone公司)，胎牛血清(天津灏洋公司)，四甲基偶氮唑蓝、MTT、DMSO (上海碧云天公司)，Trizol、异丙醇、氯仿(上海生工公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

使用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基培养HCT116细胞，置37 ℃5%CO₂培养箱中培养。

1.2.2 MTT实验

将处于对数生长期的细胞以1×10⁴/孔的密度接种于96孔板中，细胞培养12 h后分别转染miR-98 mimic或miR-98 inhibitor (广州锐博生物公司)，每组每个时间点设3个复孔。转染后分别在0，12，24，36，48 h添加MTT (5 mg/mL) 10 μL，孵育4 h，弃去培养基，使用100 μL DMSO溶解MTT-甲臜结晶，15 min后在490 nm处记录吸光度(optical density，OD)值。

1.2.3 Hochest 33258染色

将处于对数生长期的细胞以1×10⁵/孔的密度接种于6孔板中，细胞培养12 h后分别转染miR-98 mimic或miR-98 inhibitor，每组设3个复孔。转染24 h后分别添加PBS洗3次后，Hochest 33258染色20 min，PBS清洗3次，荧光显微镜下观察。

1.2.4 实时PCR检测

1 mL Trizol裂解组织后，加0.2 mL氯仿，振摇15 s，室温静置2~3 min。离心15 min。吸取上层水相，加入0.5 mL异丙醇，混匀。离心10 min弃上清。加入75 %乙醇，振摇。离心5 min干燥后，用DEPC处理水溶解沉淀，55~60 ℃孵育10~15 min。所用引物为miR-98，F，5’-ACACTCCCUAUACAACUUAC-3’；R，5’-GGGAAAGUAGUGAGGCCTCAG-3’；U6，F，5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；R，5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.2.5 细胞周期分析

将对数生长期的细胞制成1×10⁶/L浓度的细胞悬液接种于6孔板中，贴壁培养24 h后，加入不同处理因素。作用24 h后收集细胞，PBS洗涤后胰酶消化，制成单细胞悬液。70%的冰乙醇4 ℃固定1 h，PI染液避光染色30 min，流式细胞仪测定细胞周期。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，OD值比较采用非配对t检验；40例肠癌组织与相应癌旁组织比较采用非配对t检验，利用对数秩检验理论对数据进行生存分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 miR-98在结肠癌中的表达

实时PCR结果显示，结肠癌组织与癌旁组织中miR-98的含量分别为（1.064±0.052）和（0.645±0.039），癌组织中表达明显低于癌旁组织，差异有统计学意义（P = 0.022）。miR-98的表达与患者的生存期密切相关，miR-98高表达患者的生存期更长，见图 1。

2.2 miR-98对结肠癌细胞生长的影响

在HCT116细胞中分别过表达或低表达miR-98后，通过MTT实验检测细胞的增殖情况，结果发现转染24 h后可以显著抑制HCT116细胞增殖；miR-98抑制24 h后HCT116细胞增殖开始显著增加，见图 2。

在HCT116细胞中分别过表达或低表达miR-98后，通过流式分析技术检测了细胞周期，结果发现miR-98过表达可以抑制G₁-S期的转化；miR-98受到抑制后G₁向S期进程加快，见表 1。

在HCT116细胞中分别过表达或低表达miR-98后，通过Hochest 33258实验检测细胞的凋亡情况，结果发现miR-98过表达可以促进HCT116细胞凋亡；miR-98受到抑制后HCT116细胞凋亡亦受到抑制，见图 3。

3 讨论

结肠癌发病率以每年超过100万的新增病例迅速增长，在我国也呈现逐年上升的趋势^[8]。因此有必要寻找更好的能够诊疗结肠癌的靶点。多种miRNAs在肿瘤的发生发展中发挥重要的调控作用^[9]。在结肠癌中有多重miRNAs异常表达的现象。miR-34在肠癌中表达降低可以抑制肠癌细胞的生长与迁移；miR-200可能通过调节细胞周期相关蛋白抑制肠癌细胞的增殖^[10]。在肠癌患者的血浆中，miR-92、miR-17-3p、miR-29a表达明显上调，切除肿瘤后，它们的含量下降^[11]，说明这些miRNA可能会作为肠癌的诊断依据。已经有报道^[12]称miR-98可以通过抑制无氧酵解来抑制结肠癌的进展。

本研究发现miR-98在结肠癌组织中的表达显著低于癌旁组织。数据显示miR-98高表达患者的5年生存期较好，这说明miR-98与患者预后密切相关。结肠癌患者的预后与其细胞的增殖及迁移能力密切相关。研究表明miR-98可以抑制HCT116细胞的增殖。细胞周期的进程是调节细胞增殖的关键因素，进一步检测miR-98对细胞周期的调节作用发现，当miR-98过表达时细胞周期G₁向S期转化的过程受到阻滞，这说明在一定程度上miR-98是通过对细胞周期阻滞来实现细胞增殖的抑制作用。细胞凋亡也是影响细胞增殖的关键因素，本研究发现miR-98可以促进细胞凋亡。由此可见miR-98不仅与结肠癌的预后相关，也可以抑制结肠癌细胞的增殖。

综上所述，miR-98在肿瘤组织中低表达，miR-98表达可抑制结肠癌细胞增殖、促进结肠癌细胞凋亡。miR-98表达可以抑制结肠癌的发生发展，这为结肠癌的治疗提供了新的方向。