2017, Vol. 46文章信息
- 孟雪, 齐晓宇, 刘维贤, 王瑶, 王秋旭
- MENG Xue, QI Xiaoyu, LIU Weixian, WANG Yao, WANG Qiuxu
- 乙肝病毒X蛋白结合蛋白对腺样囊性癌细胞株ACC-2生物学行为的影响
- Effect of HBXIP Expression on the Biological Behavior of the Adenoid Cystic Carcinoma Cell Line ACC-2
- 中国医科大学学报, 2017, 46(12): 1082-1086
- Journal of China Medical University, 2017, 46(12): 1082-1086
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文章历史
- 收稿日期：2017-03-31
- 网络出版时间：2017-11-30 18:05
引用本文 |
2. 辽宁省铁法煤业集团总医院口腔科, 辽宁 铁岭 112000;
3. 沈阳农业大学畜牧兽医学院预防兽医学教研室, 沈阳 110866
2. Department of Stomatology, Liaoning Province Tiefa Coal Group General Hospital, Tieling 112000, China;
3. Teaching & Research Section of Preventive Veterinary Medicine, College of Animal Science & Veterinary Medicine, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China
腺样囊性癌（adenoid cystic carcinoma，ACC）是最常见的唾液腺恶性肿瘤之一，约占所有唾液腺恶性肿瘤的22%[1]，早期即侵犯神经和血管，容易发生远处肺部转移[2]。目前ACC的治疗多采用手术联合放化疗，但效果不佳。乙肝病毒X蛋白结合蛋白（hepatitis B X-interacting protein，HBXIP）通过与乙肝病毒X（hepatitis B-virus X，HBX）蛋白C末端特异性结合降低其活性，从而影响乙肝病毒的复制周期[3-4]。HBX蛋白被认为是一种多功能癌蛋白，既可以激活信号转导通路，又可以直接作用于细胞转录因子，抑制肝癌细胞凋亡[5]。研究[6]发现，在唾液腺恶性肿瘤细胞中，HBX的表达水平升高，乙型肝炎病毒与唾液腺恶性肿瘤存在相关性。目前尚无文献报道HBXIP与唾液腺ACC的相关性，因此，本研究拟探讨HBXIP对唾液腺ACC细胞株ACC-2[7]增殖、迁移和侵袭功能的影响及其可能的作用机制。
1 材料与方法 1.1 材料真核表达载体HBXIP-siRNA由沈阳万类科技有限公司构建，ACC-2细胞株购自武汉大学细胞保藏中心。主要试剂：DMEM培养基（美国Gibco公司），胎牛血清（美国Hyclone公司），Super M-MLV反转录酶（中国BioTeke公司），RNA simple Total RNA Kit和总RNA提取试剂盒（中国TIANGEN公司），MTT试剂（美国Sigma公司），NP-40裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、PMSF（中国碧云天生物技术有限公司），ECL发光液（中国七海复泰生物科技有限公司）和脂质体2000（美国Invitrogen公司）。
引物设计：针对HBXIP的核酸序列（NM_006402）设计引物，HBXIP-F，GGAGCAGCACTTGGAAGACA；HBXIP-R，TCAGTGGGGTCAGAGGTTAG。β-actin-F，CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG；β-actin-R，CTGTCACCTTCACCGTTCCAGTTT。引物均由沈阳万类科技有限公司合成。
1.2 方法 1.2.1 细胞株的培养及传代用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养ACC-2细胞，在37 ℃、5%CO2条件下培养，细胞生长至90%融合时传代，接种密度为1:3，每2 d传代1次，最后接种于T25培养瓶中（4×105/瓶），待细胞密度达90%，收集细胞。
1.2.2 细胞分组及处理将ACC-2细胞随机分为实验组（瞬时转染HBXIP-siRNA质粒），阴性对照组（转染无意义序列，NC组）和未转染组（空白细胞），后2组为对照组。转染方法参照Lipofectamine2000说明书，转染前24 h将细胞传代，待细胞密度至50%~60%，更换为无血清的基础培养基处理1 h后进行转染。应用电镜及免疫荧光方法检测细胞是否转染成功。转染48 h后分别收集6孔培养板中各组细胞，进行基因和蛋白的检测。
1.2.3 反转录PCR用Trizol法分别提取3组细胞的总RNA，用SuperM-MLV反转录酶合成cDNA第一链，以此为模板进行PCR反应。取PCR产物行琼脂糖凝胶电泳，Gold View染料混匀染色，利用凝胶成像系统拍照。实验重复3次，Quantity One软件分析电泳条带灰度，比较3组细胞中HBXIP mRNA和蛋白的表达情况。
1.2.4 MTT实验转染24 h后，计数3组细胞并接种于96孔培养板中（2×103/孔）。每组设计5个复孔，同时加入调零孔（只加培养基、MTT、DMSO）。置于37 ℃、5% CO2培养箱中分别培养24、48、72、96 h后，加入0.2 mg/mL MTT，置于37 ℃培养箱中孵育4 h，弃上清，加入200 μL DMSO，在酶标仪上测定其在490 nm处OD值。重复5次，取平均值。
1.2.5 划痕实验细胞转染24 h后，计数3组细胞并接种于6孔培养板中（2×103/孔）。每组设3个复孔，200 μL枪头垂直划痕，加入无血清培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养16 h。于划痕前（0 h）和划痕后16 h分别照相、测距，重复3次，取平均值。
1.2.6 transwell小室实验转染24 h后，计数实验组（转染组）和对照组（NC组，未转染组）细胞，用无血清培养液1:10稀释，24孔板的transwell小室每个孔铺100 μL胶，加入100 μL细胞悬液，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h后，擦去膜上层细胞，将膜取下并进行检测。实验重复5次，取平均值。
1.2.7 Western blotting向3组细胞中加入相应体积的NP-40裂解液，吹散至单细胞悬液，置于冰上静置5 min，4 ℃下12 000 r/min离心10 min，收集上清行定量分析。取40 μg总蛋白行10%SDS-PAGE电泳，电转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭，室温培育2 h。加入一抗，4 ℃培育过夜，TTBS洗膜，分别加入驴抗山羊IgG-HRP（HBXIP）和羊抗兔IgG-HRP（Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K及S100A4），37 ℃孵育45 min，TTBS洗膜，应用增强型ECL显色剂，试剂盒于暗室曝光显影，实验均重复3次，扫描胶片，用凝胶图像处理系统（Gel-Pro-Analyzer软件）分析目标条带的光密度值。
1.3 统计学分析采用SPSS 18.0统计软件进行分析，数据以x±s表示，组间比较采用Student’s-t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 3组细胞中HBXIP的表达细胞成功转染48 h后，实时PCR和Western blotting结果显示，3组细胞中均可检测到HBXIP mRNA和蛋白表达，且实验组表达水平较对照组明显下降，差异有统计学意义（P < 0.01），见图 1、2。
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| A, β-actin expression in each group; B, HBXIP expression in each group; C, the histogram of HBXIP gene expression in each group. ACC-2:control group (non transfection group); NC:blank control group (nonsense sequence group, negative control); HBXIP-siRNA:experimental group (transfection group). 图 1 实时PCR检测3组中HBXIP基因的表达 Fig.1 Expression of the HBXIP gene in experimental and control groups measured via RT-PCR |
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| 图 2 蛋白印迹法检测3组HBXIP蛋白的表达 Fig.2 Expression of HBXIP protein in experimental and control groups measured via Western blotting |
2.2 siRNA-HBXIP对ACC-2细胞增殖的影响
MTT结果显示，转染24、48、72、96 h后，实验组OD值（0.355±0.062，0.697±0.071，1.020±0.111，1.086±0.122）低于未转染组（0.402±0.068，0.907±0.112，1.354±0.138，1.414±0.144）和NC组（0.407±0.046，0.893±0.092，1.313±0.133，1.363±0.143）。在这4个时间点，实验组细胞增殖率（100.000±17.359，196.282±19.914，287.211±31.313，305.915±34.506）较对照组降低，在48、72、96 h时差异有统计学意义（P < 0.05），见图 3。
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| *P < 0.05 vs NC group and ACC-2 group. 图 3 MTT法检测3组细胞的增殖情况 Fig.3 Proliferation of cells in the experimental and control groups measured via MTT method |
2.3 siRNA-HBXIP对ACC-2迁移的影响
划痕实验结果显示，划痕后16 h，实验组、NC组和未转染组细胞迁移率分别为17.00%±2.00%，30.72%±3.37%，33.01%±3.93%，差异有统计学意义（P < 0.01），见图 4、5。
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| *P < 0.01 vs NC group and ACC-2 group. 图 4 划痕实验法检测16 h时3组细胞的迁移率 Fig.4 Migration rate of cells in the experimental and control groups over 16 h measured via the scratch test |
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| A and B, experimental group (transfected with plasmid); C and D, blank control group (transfected with nonsense sequence plasmid); E and F, control group (non-transfected). A, C, E, 0 h; B, D, F, 16 h. 图 5 光镜下实验组及对照组迁移情况的比较×100 Fig.5 Comparison of cell migration patterns between the experimental and control groups under the microscope ×100 |
2.4 siRNA-HBXIP对ACC-2侵袭能力的影响
transwell检测结果提示，观察24 h后，实验组、NC组、未转染组细胞侵袭数分别为45.00±4.64，81.00±9.03，83.60±8.35，差异有统计学意义（P < 0.01）。
2.5 siRNA-HBXIP对PI3K/Akt通路的影响Western blotting结果显示，HBXIP基因沉默后，实验组HBXIP蛋白的相对表达量（0.30±0.04）明显低于NC组（0.97±0.02）和未转染组（1.00±0.01）。HBXIP基因沉默后，实验组中p-Akt、p-PI3K和S100A4蛋白的表达降低（0.64±0.02，0.40±0.01，0.64±0.02），差异有统计学意义（P < 0.05），见图 6。
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| 图 6 Western blotting法检测3组细胞中p-Akt、Akt、p-PI3K、PI3K及S100A4蛋白的表达情况 Fig.6 Expression of p-Akt, Akt, p-PI3K, PI3K and S100A4 protein in the three groups measured via Western blotting |
3 讨论
癌基因蛋白HBXIP是一种调节蛋白，可在动物肌肉组织以及恶性肿瘤组织中过表达。近年来，也有研究[5]发现它能与人体多种蛋白结合。在唾液腺恶性肿瘤细胞中可检测到HBX的表达，表达阳性率高于对照组，提示乙型肝炎病毒与唾液腺恶性肿瘤存在相关性[7]。HBXIP还可促进乳腺癌细胞和肝癌细胞的增殖及迁移[8-11]，也能够刺激Skp2基因启动子的活性，并通过转录因子Sp1促进卵巢癌细胞迁移[12]。最新研究[13]发现，HBXIP过度表达与宫颈癌进展有关联，并可能作为早期诊断宫颈癌的生物标志物。
PI3K/Akt信号通路是新发现的一条酪氨酸激酶级联信号通路，是国内外学者公认的癌细胞存活的重要通路，在恶性肿瘤的发生、发展中发挥重要作用。该信号通路可以在多种恶性肿瘤中过度活化[14]。有研究[15]发现HBXIP能诱导HepG2细胞增殖，激活PI3K/Akt信号通路。LIU等[16]发现过表达HBXIP可激活PI3K/Akt通路，HBXIP可能通过PI3K/Akt通路间接促进S100A4的表达，从而促进乳腺癌细胞的生长和迁移。也有研究[17]发现，HBXIP可下调PCK1的表达，通过下调肝癌细胞转录因子FOXO1和上调miR-135a，抑制靶向细胞中FOXO1 mRNA的3’UTR端，通过激活PI3K/Akt通路FOXO1蛋白的磷酸化水平，导致该蛋白从细胞核向细胞质转移。
本研究组在前期实验中对ACC细胞ACC-2中HBXIP蛋白的表达情况进行了检测，发现其在ACC-2中有较多表达，为进一步阐明HBXIP对ACC细胞株ACC-2的影响，选择对HBXIP基因沉默，并研究其对ACC-2增殖、迁移和侵袭以及PI3K/Akt信号通路的影响。
RNA干涉（RNA intergerence，RNAi）是指在进化过程中高度保守的、双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象，它能诱导序列特异的目标基因沉默，是由FIRE等[18]于1998年发现的迄今最有效的封闭基因表达方法之一。siRNA是RNAi途径的中间产物，在RNA沉默通路中起核心作用，因此，本研究中构建了siRNA-HBXIP真核表达载体。本研究结果显示，HBXIP基因沉默能够抑制ACC细胞株ACC-2的增殖、迁移和侵袭，并有可能是通过抑制S100A4蛋白的表达及PI3K和Akt磷酸化来实现的。本研究中所用HBXIP抑制剂有可能成为有效的化疗药物，其可能的机制是通过下调PI3K/Akt信号通路PI3K和Akt靶点蛋白的磷酸化和S100A4的蛋白表达，从而抑制唾液腺细胞的恶性转化，同时抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。
总之，HBXIP可能通过激活PI3K/AKT信号通路关键蛋白，在ACC细胞株ACC-2的增殖、迁移和侵袭中发挥重要作用，有关具体途径和机制有待进一步研究。
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