神经母细胞瘤是最常见的一种小儿恶性肿瘤，占小儿肿瘤患者死因的15%^[1-3]。目前，神经母细胞瘤主要治疗方法有手术、化疗和放疗。神经母细胞瘤异质性较强，一些患者对化疗不敏感，愈后较差^[4-6]。因此有待开发更有效的治疗药物。神经元限制性沉默因子（repressor element-1 silencing transcription factor，REST）基因在神经母细胞瘤中为致癌基因，前期研究^[2-3]表明REST高表达与神经母细胞瘤的异型性和预后有关。

榄香烯从天然姜科植物温郁金中提取获得，是以β-榄香烯为主要成分的榄香烯类化合物，具有高效、毒性低、能通过血脑屏障等特点^[7-9]。大量研究^[7-11]表明榄香烯对多种肿瘤具有细胞毒性作用，对多耐药基因高表达的肿瘤细胞杀伤作用尤为明显。目前榄香烯在神经母细胞瘤中作用的研究甚少，本研究通过体外实验检测榄香烯对神经母细胞瘤细胞株的作用及其机制。

1 材料与方法 1.1 细胞与试剂

人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH来自中国医学科学院肿瘤医院。细胞培养于含10%胎牛血清（Gibco公司）的Sigma DMEM培养基。培养箱条件为37 ℃、5%CO₂。在倒置显微镜下观察细胞密度为80%~90%时，用0.25%胰蛋白酶（Gibco公司），取对数生长期细胞用于后续实验研究。榄香烯乳注射液由大连华立金港药业有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 MTT法测定细胞生长抑制率

SK-N-SH细胞3 000/孔接种在96孔板中，含0.2 mL培养液，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养。24 h后加入不同浓度的榄香烯（30、60、90 μg/mL），每种药液浓度设4个复孔，另设溶剂对照4个复孔。随后于24、48、72 h每孔加入20 μL MTT（5 g/L），37 ℃孵箱继续培养4 h，去除上清，每孔加入150 μL DMSO，震荡15 min。酶标仪检测490 nm波长的吸光度值，计算抑制率^[12]。

1.2.2 实时qPCR

SK-N-SH细胞以1×10⁴/500 μL接种在24孔板中，培养24 h后加入不同浓度的榄香烯（30、60、90 μg/mL），继续培养12 h后去除上清，回收细胞。应用RNeasy Mini Kit试剂盒进行细胞总mRNA提取，实时试剂盒进行逆转录。以β-actin为内参，对REST、CCND1和CCNE1 mRNA表达量进行qPCR检测，所用的引物序列为：β-actin，上游引物5’-GCTCGTCGTCGACAACGGCTC-3’，下游引物5’-CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC-3’；REST，上游引物5’-GCATTTGCTTCCAACTTTTGTTGA-3’，下游引物5’-ACTGCTGGTAAACAGCCCTC-3’；CCND1，上游引物5’-CTCCTCTCCGGAGCATTTTGATA-3’，下游引物5’-TTAAAGACAGTTTTTGGGTAATCT-3’；CCNE1，上游引物5’-AGCGGTAAGAAGCAGAGCAG-3’，下游引物5’-TTTGATGCCATCCACAGAAA-3’。PCR参数：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，50个循环^[13]。

1.2.3 Western blotting检测

分别收集对照组和加入不同浓度榄香烯（30、60、90 μg/mL）48 h后的SK-N-SH细胞，用M-PER哺乳动物蛋白提取剂（Thermo Fisher Scientific公司）回收蛋白。用BCA法对蛋白进行定量。制备SDS凝胶，电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，封闭一抗：兔抗人REST多克隆抗体及β-actin单抗，4 ℃冰箱过夜，洗膜3×5 min；封闭二抗，室温1 h，洗膜3×5 min，用增强化学发光剂（enhanced chemiluminescence，ECL）显影^[13]。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0进行统计分析，所得数据用x±s表示，采用One-Way AVONA分析^[12-13]，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 榄香烯对神经母细胞瘤细胞增殖的抑制作用

结果显示，榄香烯能有效抑制SK-N-SH细胞的增殖，与对照组相比，加入榄香烯（30 μg/mL）24 h后SK-N-SH细胞数明显减少，榄香烯（60 μg/mL）处理24 h后SK-N-SH细胞数进一步减少，同时细胞形态也出现改变，90 μg/mL榄香烯作用较60 μg/mL更强（图 1）。MTT检测结果显示榄香烯对SK-N-SH细胞的生长有抑制作用，细胞株的增殖抑制率随浓度增加和时间的增长而增高（P = 0.001 16），表现浓度和时间依赖性（图 2）。

2.2 榄香烯对神经母细胞瘤细胞中REST基因表达的影响

通过实时qPCR检测结果发现，与对照组相比，加入榄香烯后SK-N-SH细胞中REST mRNA表达量明显受到抑制（P = 0.000 38）。Western blotting检测结果进一步显示，与对照组相比，SK-N-SH细胞中REST蛋白表达量明显受榄香烯的抑制（P = 0.003 39）。实时qPCR和Western blotting的结果表明榄香烯可以抑制REST的表达，并且表现为浓度依赖性（图 3）。

2.3 榄香烯对神经母细胞瘤细胞中CCND1和CCNE1基因表达的影响

研究^[14]表明，敲除胶质瘤的REST基因后细胞周期的相关基因CCND1和CCNE1的表达受到抑制，本研究进一步研究了榄香烯对CCND1和CCNE1基因表达的调节作用。通过实时qPCR检测发现，与对照组相比，榄香烯对SK-N-SH细胞中CCND1的表达有明显的抑制作用（P = 0.001 91），对CCNE1的表达也有明显的抑制作用（P = 0.000 15），榄香烯的浓度越高对CCND1和CCNE1的抑制越明显（图 4）。

3 讨论

神经母细胞瘤是小儿死亡率最高的实体肿瘤，恶性度高预后差^[1-3]，有较强的异质性，放化疗效果差异较大，其中一些患者对放化疗不敏感，病情恶化迅速。化疗药物的应用是延长患者生存时间必不可少的手段，开发新的疗效好、不良反应少的药物是患者生命延续的希望^[4-6]。

大量研究^[7-9]证实，榄香烯对多种肿瘤具有较强的抑制和杀伤作用，并和其他化疗药物有协同作用。在抗肿瘤的同时，榄香烯还具有保护机体免疫力，缓解疼痛，升高白细胞，降低骨髓抑制作用。研究表明榄香烯不良反应小，无明显肝毒性和肾毒性。本研究体外实验证明榄香烯对神经母细胞瘤有抑制作用，并且抑制作用与榄香烯的剂量和作用时间显著相关。

REST基因是一种存在于各种细胞中的重要转录负调控因子，现已知其调控的基因超过2 000种^[14]。研究^[14]表明REST基因与肺癌、乳腺癌和大肠癌的发生发展有密切关系。前期研究^[4-5]表明神经母细胞瘤中REST基因为致癌基因，REST基因的表达和神经母细胞瘤的临床表现有关。在胶质瘤中降低REST的表达后可以抑制胶质瘤增殖，并且降低CCND1和CCNE1的表达。本研究表明榄香烯可以抑制神经母细胞瘤中REST的表达，并对细胞周期相关基因CCND1和CCNE1的表达也起下调作用，与以往研究结果一致^[15]。

本研究通过体外实验阐述了榄香烯对神经母细胞瘤增殖有明显的抑制作用，其作用机制为榄香烯抑制神经系统中致癌基因REST的表达，降低细胞周期基因CCND1和CCNE1的表达。今后将检测REST、CCND1或CCNE1过表达是否会削弱榄香烯对神经母细胞瘤的抑制作用，进一步探讨榄香烯其他可能作用机制。

综上所述，本研究为神经母细胞瘤的治疗提供了新的方向，也为寻找榄香烯抗肿瘤作用的靶点提供了新的线索。