文章信息
- 郭晓青, 王秀娟, 孙爱丽, 李德祥, 史西志.
- GUO Xiao-qing, WANG Xiu-juan, SUN Ai-li, LI De-xiang, SHI Xi-zhi.
- 环境中拟除虫菊酯类农药微生物降解技术研究进展
- Advances of Studies on Microbial Degradation of Pyrethroid Insecticides
- 中国生物工程杂志, 2017, 37(5): 126-132
- China Biotechnology, 2017, 37(5): 126-132
- http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20170516
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文章历史
- 收稿日期: 2016-11-07
- 修回日期: 2017-02-15
在过去几十年里,农药的开发、利用为农业生产中病虫害的防治、农作物产量增加等发挥了十分重要的作用。尤其是,拟除虫菊酯类农药因其高效广谱的杀虫活性和较低的哺乳动物毒性等特点被广泛应用于农业生产,在世界范围内使用量逐年增加。然而,由于大量农药的不合理使用,导致土壤、水质等受到污染,引发了各种环境和食品安全问题,直接或间接威胁人类健康。因此,开展农药污染环境生物修复研究,解决农药对环境及食品的污染问题受到越来越广泛关注,其中,微生物在自然环境中农药的降解和转化过程中起着重要的作用,被认为是一种有效的农药污染“绿色”解决方案。目前,研究表明,微生物降解主要分为三个水平,即菌体水平、酶(蛋白质)水平和基因水平,研究内容主要集中在4个方面:① 降解菌的筛选、鉴定、降解特性的研究及应用;② 降解酶特性的研究;③ 降解机制的研究;④ 基于微生物降解的污染环境修复应用研究[1-3]。
1 降解菌的筛选、鉴定及降解特性研究 1.1 降解菌的筛选、鉴定农药污染修复主要有物理、化学及生物修复,其中微生物修复由于具有种类丰富、分布广泛、适应性强、代谢途径多样等方面的优势受到了广泛关注。目前已经报道的降解拟除虫菊酯类农药的微生物有细菌、真菌、放线菌及藻类等,主要包括假单胞菌杆菌属、微球菌属、芽孢杆菌属、气单胞菌属等17属的各种细菌,毛链孢霉属、白腐菌霉、镰孢霉属等5属的真菌,以及链轮丝菌属、诺卡氏菌属等5属的放线菌[4],大多数源于污染土壤、农药厂污泥或从环境中分离得到,其中,细菌由于具有较强的适应能力和易诱变形成突变菌株而在生物修复中占有重要地位(表 1),真菌和放线菌报道较少。
分离来源 | 可降解的菊酯类农药 | 代谢方式 | 降解菌株 | 参考文献 |
— | 可降解第二、三代拟除虫菊酯 | 蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus SM3) | [6] | |
农药厂污泥 | 氰戊菊酯、溴氰菊酯、三氟氯氰菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯、氯菊酯 | — | 产碱菌属(Alcaligenes) | [5] |
土壤 | 氯氰菊酯 | 荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens) | [4] | |
氰戊菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯 | — | 地衣芽孢杆菌(Bacillius licheniformis) | [7] | |
茶叶 | 联苯菊酯、氯氰菊酯、甲氰菊酯 | 唯一碳源 | 阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacap) | [8] |
— | β-氟氯氰菊酯 | 唯一碳源 | 真菌-黑曲霉(Aspergillus niger)、(Aspergillus terricola)、绿色木霉(Trichoderma viride)等 | [9] |
— | 高效氯氰菊酯、三氟氯氢菊酯、溴氰菊酯、联苯菊酯 | 唯一碳源 | 4-D菌株-不动杆菌属(Acinetobacter sp.) | [10] |
丙烯菊酯 | 唯一碳源 | 酸单胞菌(Acidomonas sp.) | [11] | |
活性污泥 | 氯氰菊酯 | 唯一碳源 | 克雷伯氏菌(Klebsiella sp. J-2) | [12] |
污染土壤- | 氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯等 | 唯一碳源 | 降解菌CPN1-微球菌(Micrococcus sp.) | [13] |
活性污泥 | 联苯菊酯 | 共代谢 | 琼胶酶产生菌(Stenotrophomonas sp. strain) | [14] |
茶园土壤 | 氯氰菊酯 | 唯一碳源 | 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) | [15] |
农药厂土壤 | 联苯菊酯 | 唯一碳源 | 醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus) | [16] |
菜地土壤 | 氟氯氰菊酯 | — | 巨大芽孢菌(Bacillus megaterium) | [17] |
茶园土壤 | 联苯菊酯 | 唯一碳源 | 克雷伯氏菌(Klebsiella sp.) | [18] |
1.2 降解菌的降解特性研究
细菌由于对环境具有较强的适应能力,并易形成对农药具有较强降解能力的突变菌株,在降解农药的生物中占有重要的位置。Maloney等[6]从土壤中筛选分离到蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和无色菌(Aclwomobacter ceeeus)三株高效降解菌,研究表明,三株菌对拟除虫菊酯类农药具有较高的降解活性;虞云龙等[5]从农药厂的废水中分离得到一株广谱农药降解菌,对氰戊菊酯、溴氰菊酯、甲基对硫磷和对硫磷等具有降解功效;Lee等[19]对从污染农药的沉积物中分离获得的农药高效降解菌进行了研究,表明其中6株可以降解联苯菊酯和氯菊酯。在分离获得高效降解菌的基础上,通过紫外线、微波、亚硝基胍等对降解菌诱变,结果表明,可显著增强降解菌的降解能力,提高其降解效率。王兆守等[8]对分离获得的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacap)菌株通过紫外线进行诱变后,发现其对联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的降解率分别达70.4%、84.04%和70.87%,与诱变前相比降解率提高了20%。但是,研究表明:① 大部分降解菌只能分解拟除虫菊酯类农药,而不能将其彻底矿化,尤其是部分降解产物甚至具有更大的环境危害性。② 目前筛选获得的拟除虫菊酯类农药降解菌,主要是针对单一种类农药残留,由于其较低的降解谱,限制了其在生产实践中的广泛应用。③ 环境中农药残留的降解主要是不同微生物之间的协同作用,单一微生物往往不具备降解、矿化所需酶系的全部遗传信息。例如,Chen等[20]研究表明,利用蜡状芽孢杆菌(Bacillus cefeus ZH-3) 和金色链霉菌(Streptomyces)构成的复合体系可完全代谢氯氰菊酯,与单一菌株相比,其降解效果显著提高。因此,鉴于当前农药残留微生物降解存在的问题,筛选具有矿化能力且具有广谱降解能力的降解菌(群),或构建多菌株复合体系,是今后重要的发展方向。
2 拟除虫菊酯类农药降解酶研究 2.1 降解酶的分离、纯化及降解特性研究目前,微生物对农药的降解及应用研究已取得了较好的进展,但是在自然条件下,微生物的应用易受环境条件的限制,相比之下,降解酶更能适应恶劣的环境,保持良好的降解活性,尤其是对于低浓度农药具有较好的降解作用。因此,对于降解酶的分离、纯化及应用也得到了快速发展。例如,Maloney等[6]首次从蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus SM3) 中通过层析技术分离获得羧酸酯酶-氯菊酯酶(permethrinase),为丝氨酸酶类,并获得了该酶的最佳降解条件;虞云龙等[21]获得了降解菌Alcaligenes sp. YF11的粗酶液,并对其降解条件进行了优化,结果表明,在最优的酶活性条件下,该酶液可高效降解氰戊菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、甲氰菊酯、三氟氯氰菊酯和氯菊酯等;Sogorb和Vilanova[22]发现,降解酶可通过催化酯键的水解来降解拟除虫菊酯类农药;林淦和黄升谋[23]从恶臭假单胞菌CP-1中提取粗酶,并通过离子交换层析对酯酶进行了分离纯化,获得的酯酶对甲氰菊酯具有较好的降解能力,但对参与具体降解步骤的酶的种类及特性尚未阐明;Wu等[24]从菌株Klebsiella sp. ZD112中克隆并纯化到拟除虫菊酯类农药水解酯酶EstP,发现该酶对农药具有广谱降解特性;罗源华等[25]从农药厂污泥中筛选、分离获得一株可高效降解甲氰菊酯(fenpropathrin)的光合细菌(红假单胞菌属,Rhodopseudomonas sp.),并采用超声波破碎法提取该菌降解酶,在30%~60% (NH4)2SO4沉淀出的粗蛋白活性为38.27U/L。目前研究表明,大多数拟除虫菊酯类农药降解酶为胞内酶,而徐莲等[26]研究发现芽孢杆菌GF-3对功夫菊酯的降解酶属于胞外酶;董园等[27]筛选获得一株氯氰菊酯高效降解菌——铜绿假单胞菌GF31,并研究了胞外粗酶液对氯氰菊酯的动力学特征等降解特性。
2.2 降解酶应用研究与降解菌相比,降解酶具有安全、无毒、较强的环境耐受力和较高的降解效率等优点。林淦等[28]通过研究阴沟肠杆菌w10j15降解酶对氯氰菊酯的降解性能表明,与降解菌相比,降解酶具有更好的热稳定性和更宽的pH适应范围,并且较菌株本身有更好的降解效果;Tang等[29]在污染的土壤中分离得到可降解β-氯氰菊酯的菌株Pseudomonas aeruginosa strain GF31,其胞外酶在60℃下保持生物活性,与降解菌相比具有更强的环境耐受力,且在25℃下储存20天后仍可以保持50%以上的活性,表明其具有良好的储存稳定性。因此,越来越多的研究表明,与微生物制剂相比,降解酶制剂具有更广泛的应用前景。虽然国内外在拟除虫菊酯类农药残留的降解酶特性方面开展了大量的研究,但是缺乏对酶催化机制的研究,限制了拟除虫菊酯类农药污染的生物修复技术的应用。
3 微生物对拟除虫菊酯类农药的降解机制研究 3.1 微生物对拟除虫菊酯类农药的降解途径研究国内外学者在进行拟除虫菊酯类农药降解微生物、降解酶分离、筛选的同时,对其降解机制也进行了深入研究。总体研究表明,微生物对农药的降解反应主要为酶促降解反应,在各种酶的作用下,通过氧化、还原、水解、缩合、脱羧、异构化等生理、生化过程,将农药完全降解或分解成小分子化合物。然而,由于不同的拟除虫菊酯类农药含有的氨基、苯环、卤素等基团的种类和数量的差异,决定了其不同的降解方式。研究表明,拟除虫菊酯类杀虫剂的代谢途径比较复杂,主要是通过酶的生物化学过程特异地切断羧酸酯键,使原农药分子生成羧酸和醇,然后再经过氧化、共轭等进一步代谢作用,转化生成毒性更小或无毒的化合物[30]。Zhang等[31]从农药厂活性污泥中分离获得了两株高效氯氰菊酯降解菌,通过薄层色谱法(TLC)和高效液相色谱法(HPLC)分析表明,其主要通过酯键水解,产生苯氧基苯甲酸和苯酚。丁海涛等[7]通过对氰戊菊酯分子结构的研究,推测其中间代谢产物为3-苯甲基苯甲醛,并在此基础上进一步阐明了氰戊菊酯的代谢途径;Saikia等[9]研究发现,施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri S1) 主要通过酯键的水解降解高效氟氯氰菊酯,产物为4-氟-3-苯氧基苄醇和3-(2, 2-二氯乙烯)-2, 2-二甲基环丙烷羧酸;另外可通过醚键水解产生α-氰基-4-氟-3-苯氧基苄基-3-(2, 2-二氯乙烯)-2, 2-二甲基环丙烷羧酸酯,高效氯氰菊酯在羧酸酯酶的作用下催化羧酸酯键断裂,生成DV菊酸和3-苯氧基苯甲酸(3-PBA),并进一步降解成原儿茶酸和苯酚。Tallur等[13]对氯氰菊酯降解菌Micrococcu sp.的研究表明,在氯氰菊酯选择压力下,细胞内酯酶、间苯氧基苯甲醛脱氢酶、3-苯氧基苯甲酸双加氧酶、苯酚羟化酶、原儿茶酸-3、4-双加氧酶、儿茶酸-2, 3-双加氧酶等具有活性,且中间代谢产物为3-苯氧基苯甲酸、原儿茶酸、苯酚和儿茶酸。陈少华等[32]首次报道了能够完全降解溴氰菊酯的无色杆菌Achromobacter sp. P-01,并对其降解途径进行了分析,结果表明,溴氰菊酯通过酯键断裂被降解成3-苯氧基苯甲醛和α-羟基-3-苯氧基苯乙腈,进而氧化分解生成邻苯二甲酸单酯和2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮。Chen等[14]研究表明氰戊菊酯主要通过羧酸酯酶降解,产生中间产物3-PBA,然后进一步完全矿化;Pankaj等[33]通过探究菌株Bacillus sp.对氯氰菊酯的降解发现,酯键在羧酸酯酶作用下发生水解,产生α-羟基-3-苯氧基-苯乙腈和3-(2, 2-二氯乙烯基)-2, 2-二甲基环丙烷羧酸酯两种主要化合物,其中α-羟基-3-苯氧基-苯乙腈不稳定并自发转化得到3-苯氧基苯甲醛,随后3-苯氧基苯甲醛转化为4-丙基苯甲醛,再转化为4-羟基苯甲酸。总体来讲,大多数拟除虫菊酯类农药可被微生物降解,其中,基于羧酸酯酶对酯键的酶促降解是最重要的反应。
3.2 拟除虫菊酯类农药微生物降解影响因素分析微生物降解农药的效率同时受农药自身的特性、微生物活性和降解环境条件(温度、pH、通气状况、碳源、氮源)等多种因素的影响,对大多数降解菌株,适量的碳源、氮源通常可以增强其降解作用,但是过量则通常会显著影响菌株的降解能力,Xie等[34]研究表明,氮源的用量会影响微生物代谢方式,通过加入适量的氮源,可以使微生物脱氢酶的活性增强,使氯氰菊酯的降解增加,但过量会因代谢方式的转变而降低降解效率;农药浓度作为影响降解菌降解效率的重要因素,过高的农药浓度通常会导致降解菌的降解作用降低,而过低的浓度往往无法达到降解菌/酶所需的底物浓度,从而导致降解效率较低。总体来讲,单一菌株在降解效果明显低于复合菌系,且单一菌株的降解过程中会有毒性中间产物的积累。而由于微生物的群体作用,从而使其可抵抗降解中间产物的毒性,表现出对多种农药较强的分解能力,较快和较彻底的解除产物的反馈抑制,在高效降解多种拟除虫菊酯类农药方面具有较大的优势,但是目前对其具体的降解机制报道较少。因此,加强对拟除虫菊酯类农药微生物降解机制研究,对提高其降解效率具有重要的意义。
4 农药降解菌的应用技术研究在加强对降解菌、降解酶和降解途径研究的基础上,鉴于降解酶的良好性能,近年来,随着基因工程等技术的快速发展,降解酶基因的克隆和表达方面有了较大发展,具有广谱高效降解能力的农药降解工程菌的构建得到了高度重视,为环境污染修复开辟了新的途径。梁卫驱等[12]从降解氯氰菊酯的克雷伯菌属菌株J-2中克隆获得了降解基因ay995176,研究表明该基因与肠道沙门菌的预测蛋白SCl71同源性为88%;肖红利[10]从不动杆菌属菌株4-D中克隆了氯氰菊酯降解片段(约5kb),与Rhs家族蛋白同源性为59%;拟除虫菊酯类农药水解酶基因estP和pye3已被克隆,并在大肠杆菌E.coli BL21中进行了表达[30, 35]。Wei等[36]在菌株Sulfolobus tokodaii中克隆得到降解基因st2026,并在大肠杆菌中得到表达,结果表明,获得的重组酶可以有效地水解合成拟除虫菊酯类农药,包括氯菊酯、氯氰菊酯、氯氟氰菊酯、溴氰菊酯和联苯菊酯等;段晓芹等[37]分离得到一株高效降解3-苯氧基苯甲酸(3-PBA)的菌株Sphingobium sp. BA3,并将pytH基因导入其中,成功构建了能快速降解菊酯类农药及其中间产物3-PBA的基因工程菌,且降解效率高于原菌株;Ruan等[38]在Ochrobactrum anthropi YZ-1中分离出拟除虫菊酯降解酯酶基因pytY,通过表达、纯化和表征,揭示PytY酶是一种广谱降解酶,可以降解多种拟除虫菊酯,且酶活性不需要辅因子;刘娜等[39]以拟除虫菊酯降解基因estA构建重组表达载体,进而对重组基因工程菌可溶性原核表达诱导条件进行优化,在大肠杆菌宿主菌中成功表达并获得酯酶活性;梁俊仕和许雷[40]通过构建4-D菌(Acinetobacter sp.)基因组文库,得到降解3-PBA的关键酶基因,在对大肠杆菌BL21(DE3) 诱导表达后,对3-PBA降解率达到18.7%。研究表明,通过基因改良技术,将获得的高效降解酶基因在适宜的菌株中高效表达,可显著提高其降解性能。
5 展望近年来,广大科研工作者在农药残留污染修复方面的研究取得了较好的研究进展。但是,鉴于拟除虫菊酯类农药在农业生产中的重要作用,为保证农业生产安全,其大量使用不可避免,因此,为有效保障水生生态系统、水产品安全及人类健康,基于微生物降解的拟除虫菊酯类农药残留污染修复技术研究受到了高度重视,并在以下几方面期待得到深入研究。
① 充分利用我国丰富的微生物资源,分离、筛选高效拟除虫菊酯类农药降解菌,建立农药降解菌微生物种资源库;② 针对新农药品种,分离、筛选对其具有较高降解性能的微生物资源,分析其中间代谢产物和代谢途径,阐明其代谢机制;③ 利用分子生物学和基因工程技术,对降解酶基因资源进行克隆、表达,并通过构建高效降解菌,进一步拓展其应用范围;④ 深入开展微生物修复工艺技术研究,针对不同环境形成标准化的操作规范,为建立有效地去除养殖环境中拟除虫菊酯类农药残留的微生物修复技术,保护近海环境、治理养殖环境农药残留污染和保障食品安全提供理论支持。
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