中国生物工程杂志  2017, Vol. 37 Issue (5): 97-106

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徐云巧, 李婷婷, 吴彩娥, 范龚健, 李佟.
XU Yun-qiao, LI Ting-ting, WU Cai-e, FAN Gong-jian, LI Tong.
糖蛋白的去糖基化方法研究进展
Research Progress on the Methods of Deglycosylation of Glycoproteins
中国生物工程杂志, 2017, 37(5): 97-106
China Biotechnology, 2017, 37(5): 97-106
http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20170512

文章历史

收稿日期: 2016-12-02
修回日期: 2017-03-06
糖蛋白的去糖基化方法研究进展
徐云巧, 李婷婷, 吴彩娥, 范龚健, 李佟     
南京林业大学轻工科学与工程学院 南京 210037
摘要: 糖组学是继基因组学及蛋白质组学后的新兴研究领域,糖基化是非常重要的一种蛋白质翻译后修饰,在多种生物过程中扮演着重要角色,异常糖基化与一些疾病的发生发展密切相关,因此糖基化的研究已成为研究热点。去糖基化后能够影响糖蛋白的活性、分泌等物化性质,而且去糖基化也是糖基化研究的主要技术手段,因此综述了各种去糖基化的方法,各种方法的优缺点和适用范围及去糖基化后的结构检测方法等,为研究去糖基化对大分子物质的构效关系提供参考。
关键词: 糖基化     糖蛋白     去糖基化     技术手段     构效关系    
Research Progress on the Methods of Deglycosylation of Glycoproteins
XU Yun-qiao, LI Ting-ting, WU Cai-e, FAN Gong-jian, LI Tong     
College of Light Industry Science and Engineering, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China
Abstract: Glycomics is emerging after genomics and proteomics research, glycosylation is an important post-translation modification of proteins which plays an significant role in many biological processes, abnormal glycosylation is closely related to the occurrence of some diseases development, therefore, glycosylation research has become a hot research topic. Deglycosylation can affect the activity, secretion and other physical and chemical properties of glycoprotein, and deglycosylation is also the main technical means of glycosylation research, various methods of deglycosylation, the advantages and disadvantages of various methods and the applicable scope as well as the detection methods of the deglycosylation were summarized, and provided a reference for the study of structure-activity macromolecules.
Key words: Glycosylation     Glycoprotein     Deglycosylation     Technical means     Structure-activity    

随着蛋白质组学和糖组学研究的迅速发展,糖蛋白已成为众多研究的热点。糖蛋白是由寡糖链与蛋白质以共价键相连构成的结合蛋白,且以酶、凝集素、免疫球蛋白、膜蛋白等形式广泛的存在于动物、植物和微生物中。许多文献报道糖蛋白具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖、增强免疫、抗辐射等功效[1]。糖蛋白中的寡糖链经由共转译修饰或后转译修饰过程中的糖基化作用而连结在蛋白质上,根据糖链在肽链上的连接位点,有N-连接糖链、O-连接糖链、糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白(GPI)和C-连接糖链,目前研究最多的是N-、O-连接糖蛋白。糖蛋白有糖链和肽链相连接,其结构庞大而复杂,因此尝试以切除糖蛋白中糖链的方式,即通过酶法、化学法、糖基化抑制剂、重组DNA技术和某些糖基步骤缺陷的突变细胞将寡糖链从糖蛋白上切除,是研究糖蛋白结构和功能的重要途径,目前应用最多的去糖基化方法是酶法和化学法。

近年来,人们发现对糖缀化合物去糖基后,结构的改变使其功能发生相应的变化。有些糖链去糖基后会导致糖蛋白活性降低。Newrzella和Stoffel[2]发现,酸性鞘磷脂酶在去除糖基化位点N333/N393位点时展示了只有40%的酶活性,去除位点N518位点时,其展示了低于20%的酶活性;有些糖蛋白的糖链去糖基后反而能增强其活性。Hoshida等[3]将地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因转入44个酵母突变体中,从免疫印迹试验中发现N-连接糖基化α-淀粉酶结构不稳定且抑制其在酵母中的分泌,去糖基化后的α-淀粉酶的活性是未去糖基化的3倍;有些糖蛋白切除糖链或去除糖基化位点后并不影响其活性。Byatt等[4]酶解去除胎盘催乳素的O-连接位点时,生长激素放射受体结合活性并没有受到去糖基影响。因此,基于去糖基处理对糖蛋白的活性有着不同的影响,可以借鉴去糖基处理的方式对糖蛋白的构效进行研究。本文对去糖基化的方法、各类去糖基化方法的优缺点和适用范围以及去糖基化后的结构分析等方面进行综述,为糖蛋白去糖基化后的结构和功能研究提供参考。

1 去糖基化方法

不同糖蛋白所用去糖基化处理的方法不同,总结国内外文献报道,目前去糖基化的方法主要有酶法、化学法和辅助去糖基法等,该三类方法的具体特性阐述如下。

1.1 酶法去糖基

依据糖蛋白中糖肽链的类型,糖蛋白可分成N-连接糖链、O-连接糖链,酶法去糖基化处理时,需要根据不同的糖肽链来选择不同的糖苷酶。对N-连接的糖肽,普遍使用的酶是肽N-糖苷酶A(PNGase A)、肽N-糖苷酶F(PNGase F)、糖苷内切酶F(Endo F)、糖苷内切酶H(Endo H)。PNGase A和PNGase F酶都水解GlcNAc-Asn键,如图 1所示[5]。PNGase F酶去除高甘露糖型、复合型、杂合型糖链,但是不能去除岩藻糖型糖链。而PNGase A可以去除岩藻糖型糖链,所以二者常常联合使用以达到完全去糖基化的效果[6]。Endo F和Endo H酶切N-糖链五糖核心Manα1-6(Manα1-3) Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc中相邻的两个GlcNAc间的糖苷键,释放出含有一个GlcNAc的肽段,且去除高甘露糖型、复合型糖链、二天线和三天线结构。因为以上糖苷内切酶无法直接作用于O-连接糖肽,所以对于O-连接的糖肽,首先需要一系列外切糖苷(exoglycosidase)从糖链的非还原末端释放寡糖,如β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、唾液酸苷酶等先一一水解,当只剩下蛋白核心1(Gal β1-3 GalNAC-Thr/Ser)和核心3(GlcNAC β1-3 GalNAC-Thr/Ser)时,再用O-糖苷酶作用于GalNAc-Ser/Thr键[7]

图 1 PNGase F酶和PNGase A酶水解GlcNAc-Asn[5] Figure 1 PNGase F enzyme and PNGase A enzyme hydrolysis GlcNAc-Asn

1.1.1 糖苷内切酶去糖基

糖苷内切酶有PNGase F、PNGase A、Endo F、Endo H和O-糖苷酶。由于这些酶对糖蛋白的特异性不同,因此是目前去糖基化工程中应用最多的酶,可应用于生物学的多个领域。

PNGase F,几乎可以水解糖蛋白中所有N-连接糖[8]。Hirani等[9]以血清结合珠蛋白(由肝脏合成的一种糖蛋白)为原料,用PNGase F酶在不同条件下对其去糖基。50μg结合珠蛋白溶于200mmol/L、pH 8.6的磷酸缓冲液中(含有1%SDS和1%巯基乙醇)煮沸5min。再加入10% NP40煮沸5min,加入5μl PNGase F酶和50%甘油,在37℃下培养,电泳分析后发现结合珠蛋白只能部分去糖基。Man等[10]在其基础上,从缓冲溶液类型、浓度、pH、SDS浓度以及NP 40和TX-100浓度对去糖基化实验进行优化,50μg结合珠蛋白在PNGase F酶条件下,溶于50mmol/L、pH 8.6的甲酸铵缓冲液中(含有0.4%SDS和1%巯基乙醇),加入1%NP40和0.5%TX-100可以达到完全去糖基。天然糖蛋白中,只有一部分糖链可以被清除,虽然只使用SDS可以完全去糖基,但是提高其浓度会抑制酶的活性,所以样品在一定浓度的SDS处理后,再加入Mega-10作为进一步洗涤剂可以达到完全去糖基化。Nuck[11]以5个α1-酸性糖蛋白为实验材料,研究了不同的洗涤剂在酶反应中的影响,通过使用60mU/ml PNGase F酶在0.25mol/L pH 8.6磷酸钠盐缓冲液(含0.2%SDS和20mmol/L巯基乙醇和0.5%Mega-10) 中可以达到完全去糖基化。

PNGase A,可以有效的清除海藻型糖蛋白[12]。Yagi等[13]使用PNGase A酶释放N-糖链,2-AP标记糖链,用DEAE、HPLC分离后分析N-糖链。Kim等[14]使用PNGase A酶释放朝鲜槐素白细胞凝集素的N-糖链,2-AB标记糖链的还原末端,释放的糖链先经连有荧光检测器的高效液相色谱分析,再经基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析,结果显示N-糖链存在8种聚糖、2种α1, 3-海藻化-低甘露糖型糖链和6种高甘露糖型糖链。

Endo F对蛋白质特异性较弱,Endo F1能够对N-糖蛋白中的高甘露糖和杂合型糖蛋白进行切割,Endo F2和F3能够对N-糖蛋白中的二天线和三天线糖蛋白进行切割,但是Endo F3酶对于杂合型和低聚甘露糖型糖蛋白不起作用。岩藻糖化糖蛋白限制Endo F2的酶的活性,但是促进Endo F3酶的活性。Duan等[15]研究了人体转铁蛋白的去糖基化,Endo F2先固定在溴化氰亲和层析凝胶4B上,再放入低压柱内使用,上样浓度为1mg/ml,缓冲液为10mmol/L pH 4.5的乙酸钠溶液(含100mmol/L NaCl),在37℃下培养3d,从电泳图可以看出糖链全部去除。

Endo H能够对N-糖蛋白中的低聚甘露糖和某些杂合型寡聚糖的壳二糖核心结构进行切割。Marcus和Bowles[16]利用14C-氨基酸标记的脉冲追踪实验研究凝集素前体在细胞中的情况,将Endo H酶加入到样品中,37℃下培养18h,再在SDS-PAGE上分析,发现多肽分子质量减少到可以忽略的水平,说明其自身在生物合成中已经去糖基化了。

O-糖苷酶即内切-α-N-乙酰半乳糖胺酶,催化移除糖蛋白核心1(Galβ1-3 GalNAC-Thr/Ser)和核心3(GlcNACβ1-3 GalNAC-Thr/Ser)的O-连接二糖单位。Koutsioulis等[17]研究内切-N乙酰半乳糖胺酶广泛的底物特异性,从肠杆菌、痤疮丙酸杆菌、产气荚膜梭菌、肺炎双球菌和产碱杆菌属中提取内切-N乙酰半乳糖胺酶,用内切-N乙酰半乳糖胺酶水解天然糖蛋白,释放的寡糖由比色法检测和薄层色谱法分析,发现核心1可以最快的被所有酶水解,然而核心3只能被从肠杆菌、痤疮丙酸杆菌提取的内切-N乙酰半乳糖胺酶水解。Ishii-Karakasa等[18]用来源于链霉菌属培养基的内切-N乙酰半乳糖胺酶水解胎球蛋白的GalNAC-Ser/Thr的O-连接糖苷键。释放的寡糖吡啶基胺化后,由反向高效液相色谱和1H NMR来分析释放的寡糖,其结构是NeuAc α2-3Galβ1-3GalNAc。

1.1.2 糖苷外切酶去糖基

糖苷外切酶是研究最早的一类作用于糖蛋白糖链的酶。例如,唾液酸酶、β-半乳糖苷酶、β-N-乙酰氨基葡萄苷酶、α-L-果糖苷酶、α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶等,通过这些酶的联合作用能专一性的释放糖蛋白的糖基。不同的去糖基化程度对应着不同的功能活性,在促红细胞生成素的去糖基化过程中,当末端的糖即半乳糖、唾液酸、乙酰氨基葡萄糖被专一性的外切酶去掉时,在体外测其活性逐渐提高,进一步切去内部糖链则会导致活性丧失[19]

唾液酸苷酶和β-半乳糖苷酶可以分别缓慢地水解出糖蛋白中的唾液酸残基和半乳糖残基。Hamid等[20]从健康人和乳腺癌患者血清中获得的N-糖蛋白,先将唾液酸苷酶和β-半乳糖苷酶溶于50mmol/L pH 5.5乙酸钠缓冲液中,在37℃下培养16h,再结合带荧光检测器高效液相色谱法和质谱检测。他们发现与正常的人血清相比,含有α-1, 3连接岩藻糖的三唾液酸三天线型糖在乳腺癌患者血清中增加了2倍以上。通过连续的糖苷外切酶切与HPLC的检测后他们验证了这一结果。杜先锋等[21]尝试用酶法去除绵羊颌下腺糖蛋白OSM的糖基侧链,在乙酸钠缓冲溶液中,将唾液酸苷酶和OSM在37℃下一起保温24h,然后对水进行透析,从而将半乳糖相连的唾液酸出去,第二步将除去的唾液酸的OSM与N-乙酰氨基半乳糖胺酶在二甲基砷酸钠溶液中37℃下一起保温24h,透析,所得的结果显示多肽链侧链上的糖基已完全去除。

α-甘露糖苷酶是一种高特异性糖苷外切酶,如α1-2, 3甘露糖苷酶催化寡糖α1-2和α1-3-D-吡喃甘露糖残基水解,α1-6甘露糖苷酶催化寡糖未分支的α1-6糖苷键,两种酶混合使用时,α1-6甘露糖苷酶可以催化分支的α1-6糖苷键。Rajesh等[22]发现源于天蓝色链球菌的α-甘露糖苷酶,对其重组后发现α-甘露糖苷酶可以释放卵清蛋白部分的糖链。

1.1.3 混合酶酶切去糖基

由于糖的不均一性尤其在唾液酸糖基化或者二等分N-乙酰葡萄糖胺存在时,单一酶去糖基化并不能达到完全去除糖基,所以需要多种酶的混合使用。Quaranta等[23]先用链霉亲和素珠选择性的捕获转铁蛋白,同时使用PNGase F和神经酸氨酶释放转铁蛋白的N-连接糖,在碳柱上重新捕获释放的糖,选择性洗脱聚糖,在MALDI-TOF MS上分析,结果显示消除了由于唾液酸形成的复杂性及敏感性。Rehm[24]酶解眼镜蛇毒素-蛋白质,经电泳发现,蛇毒素-蛋白质有两个条带M1和M2,分子质量分别为90kDa和38kDa。M1经唾液酸酶处理后,分子质量变为70kDa,再经PNGase F酶处理后,分子质量变为65kDa。M2经唾液酸酶处理再经PNGase F酶处理后,分子质量并没有发生变化,说明M1是唾液酸型N-连接糖链。

1.2 化学法去糖基

化学法是在不破坏糖链和蛋白质结构的完整性条件下使用化学试剂从而有效的释放糖链,如肼解法、高碘酸氧化-β消除法、三氟乙酸法、三氟甲磺酸法等。对N-连接糖肽,肼解法可以有效的释放N-糖链,肼解是糖链的还原末端的醛基和肼基形成的Schiff base结构,与蛋白相连的N-乙酰氨基葡萄糖胺均因酰胺键水解而脱乙酰化。对O-连接糖肽,高碘酸氧化-β消除法和三氟乙酸法可以有效的释放O-连接糖链。O-连接的糖苷键对碱很敏感,一般采用高碘酸氧化-β消除法,碱性条件下Ser/Thr的O-糖基发生β-消除形成不饱和键,双键很容易被亲核试剂攻击加成。三氟乙酸通过转氨基作用断裂肽链,从而释放糖链。三氟甲磺酸法适合所有糖链,但糖链去除不够彻底,如三氟甲磺酸法在温和条件下(0℃)处理3h,有27%的葡萄糖胺仍附着于多肽链上。

1.2.1 肼解作用

肼解法是由Matsushima和Fuji于1957年提出,Mizuochi和Hounsell[25]使用此方法对N-糖链进行去糖基化,即取100mg糖蛋白于密封螺旋盖中干燥,加入1ml无水肼,100℃下加热10h。冷却后加入1ml冰饱和碳酸氢钠溶液,再加入10μl乙酸酐混合,在室温下培养10min,继续加入10μl乙酸酐3次,再加入20μl乙酸酐3次,每次间隔为10min,此反应过程需在冰上进行。最后用饱和碳酸氢钠中和至pH 8,多糖和蛋白质混合液再通过凝胶过滤或纸色谱进行分离。如图 3所示,糖蛋白经肼解后脱乙酰基从而释放糖链,为了避免肼对糖链的水解及脱乙酰作用,肼解后需对糖链进行还原和乙酰化[5]。Satake等[26]发现N连接的蛋白质在肼解条件下反应几个小时,17种氨基酸几乎完全稳定,ASN和Gln转换为酰肼类。Iwase等[27]以猪胃部黏液糖蛋白为原料,通过肼解释放O-连接糖链,结果显示反应结束后,虽然Ser/Thr比其他氨基酸难复原且半乳糖发生降解,但是去糖基化率可达77%。Brockhausen等[28]使用酶法和肼解法混合切除鸡卵类糖蛋白,先加入链霉蛋白酶在37℃下酶解48h,水解成糖肽,继续在肼解条件下反应25h,干燥后再加入β-半乳糖酶在37℃下反应24h,得到糖链,HPLC分析糖链。

图 2 肼解法[5] Figure 2 Hydrazinolysis method

1.2.2 高碘酸氧化-β消除法

采用高碘酸钠氧化-β消除法的关键是侧链糖基的C3位上不能有取代基,如果C3位有取代基,则需要磺酸三氟甲烷(TFMSA)在温和0℃条件下处理3h。如图 3所示,高碘酸氧化-β消除法反应的第一步是在N-乙酰氨基半乳糖C3、C4位上形成二醛,然后在碱性条件下,二醛衍生物发生β-消去反应[29]。丛莉和陈小平[30]对日本血吸虫可溶性糖蛋白(SjEA)进行研究,将2mg/ml SjEA溶于pH 4.6的50mmol/L乙酸钠缓冲溶液中,加入10mmol/L过碘酸钠反应15min,再加入50mmol/L硼氢化钠终止氧化反应。用离心超滤法洗涤数次获得d-SjEA,Bradford法进行蛋白质定量,用SDS-PAGE蛋白胶银染和扁豆凝集素亲和印记法(LCA)检测去糖基化效果。结果显示,d-SjEA蛋白成分保存完好,但与LCA结合的糖蛋白远远少于SjEA。SjEA去糖基化后对其诱导机体产生TH2免疫应答的能力无影响。Hong等[31]使用高碘酸氧化法去黏蛋白糖基,室温下组织切片在0.1mol/L NaOH皂化30min,4℃下用溶于100mmol/L pH4.5乙酸缓冲液中的100mmol/L NaIO4,过夜。第二天,活性醛在2%甘氨酸溶液中培养30min中和,再用0.1mol/L NaOH室温下发生β-消除反应。结果表明,去糖基改变了糖的特异性结构,导致更少的位阻和选择性的去除Tn和唾液酸化-Tn结构,部分暴露出黏蛋白前体的抗原表位,使黏蛋白前体更容易表达。

图 3 高碘酸氧化-β消除法[28] Figure 3 Periodate oxidation-β elimination method

1.2.3 三氟乙酸法

三氟乙酸法(TFA)通过转氨基作用断裂肽链,且N-三氟乙酸基取代氨基糖中N-乙酰基。除此之外,糖链的自由羟基也发生O-三氟乙酰化,且丝氨酸和苏氨酸与N-乙酰半乳糖胺键的O-糖苷键会发生断裂,半乳糖胺残基会发生部分裂解,同时糖链还原末端会有部分降解,存在去唾液酸的现象。无水三氟乙酸在0℃条件下反应75min,末端的果糖基本能去除,TFA仅去除一些中性糖侧链, 主链骨架仍然保持GalNAc-Ser/Thr的结构。如果糖蛋白在23℃下处理3h,多肽的侧链糖基基本上被清除[32]

1.2.4 三氟甲磺酸法

三氟甲基磺酸(TFMS)法可以切除与肽链直接相连的单糖以外的所有糖基。Yadav和Prasanna Kumari[33]使用三氟甲磺酸释放米林的糖基,1mg冻干的米林溶于150μl预冷的TFMS中,在-20℃培养30min,加入6%预冷吡啶调至中性,透析,电泳分析。Michand等[34]用三氟甲磺酸法使42kDa甜辣椒的分子质量减少到39kDa,从而得到两个糖链,一个是高甘露糖型糖链,另一个是复杂型糖链,分子质量分别为1kDa和2kDa。Levitskaya和Yunusov[35]采用TFMS法对曼陀罗中凝集素进行了研究,经圆二色谱发现,在220nm处有相当大的下降,表明其红细胞凝聚能力部分丧失,意味着糖链对天然构象的蛋白质是很重要的。Douglass等[36]采用三氟甲磺酸去糖基化处理四肽胃泌素和辣根过氧化酶糖蛋白,经色谱和质谱分析发现,TFMS法在甲基化作用、异构化作用、成环作用这三个方面影响肽链的结构。

1.3 物理法辅助去糖基

标准的酶法去糖基耗时长,且去糖基过程需要大量的酶。现在有文献报道压力循环技术、微波辅助技术及固定化酶技术辅助去糖基,可以大大的提高酶解速率以及减少酶用量。

1.3.1 压力循环技术(PCT)

高压辅助去糖基法利用多次的常压和超高压之间的压力快速循环,高压改变蛋白质构象和能使渗透水分子进入蛋白质内部,从而导致蛋白质展开。有些球状蛋白质的二硫键对必要的展开有反抗作用,所以在压力循环之前需加入巯基乙醇,从而达到更好的酶水解反应。Szabo等[37]提出了压力循环技术来提高酶切速率和减少酶用量,其以高压30kpsi从变性糖蛋白中几分钟内释放了N-糖链,传统酶解法的酶与底物的比值是1:250,运用压力循环技术后,酶与底物比为1:2 500,去糖基化程度用SDS-PAGE检测,释放的寡糖通过激光诱导荧光检测的毛细管电泳检测。在非还原性条件下,抗体分子不能够完全变性,二硫键的存在会导致蛋白质孵化期的延长且pH偏碱性,如果缩短时间和降低pH至中性会导致不完整的肽分裂,基于压力循环的酶解,并且对其进行优化,可以快速破坏二硫键,保证在短时间内酶解完成。Ying等[38]使用压力循环技术来快速和高效的促进非还原Lys-C水解单克隆抗体,经压力循环处理后能够产生高达10倍的信号,且二硫键减少至小于0.05%。

1.3.2 微波辅助技术

微波辅助酶解是将样品溶于磷酸缓冲液中,加入一定量的糖苷酶,放入微波炉内照射几分钟,几分钟内可以达到完全去糖基[39]。微波使糖蛋白中的蛋白质部分结构变松散,暴露出更多的蛋白质与酶作用位点,从而促进酶水解速率,水解过程中将常规的水浴加热用微波加热代替。Frisch等[40]比较了传统酶解法和微波辅助酶解法,结果发现,传统酶解时间为3h,而微波辅助酶解时间为30min,可以最大的去除血清中的N-糖链。微波辅助酶解糖蛋白后,可以获得完整的蛋白质从而减少蛋白质结构的不均一性。Wendy等[41]通过微波辅助酶技术移除糖蛋白的N-连接寡糖,以抗体和核糖核酸酶A为原料,微波辅助PNGase F酶,结果显示,在微波能存在的情况下,在30min之内可以完全去糖基,并且结构并没有因为微波能的原因发生变化。

酶活性随温度和时间的升高呈抛物线状,微波功率对反应溶液中的实际温度有不同程度的影响。通过条件优化,使得酶解反应在最优化的外界条件下进行,易于得到预期结果。Vesper等[42]在微波辅助酶解的试验中,从酶解时间、温度和缓冲液浓度三个方面优化实验条件,水解效率提高了20%。不同的溶剂系统在微波辐照期间也影响着酶的活性。Lin等[43]使用了相对高沸点溶剂如乙腈和甲醇,微波10min,乙腈在辐照期间增加酶活性而甲醇降低酶活性。

1.3.3 固定化酶技术

由于常规酶解法会引入新的蛋白质,所以采用固定化酶技术,用物理的或化学的方法使酶与不溶水的大分子载体结合或把酶包埋在其中,使得酶继续进行特定化反应。Szigeti等[44]设计和实施了固定化重组谷胱甘肽-S-转移酶标记PNGase F酶微型柱来快速高效的去除N-连接糖蛋白的糖链,比较了常规酶反应的水解率,使用PNGase F酶微型柱可以在10min内高效去除N-糖链。Krenkova等[45]使用固定于多孔聚合物的PNGase F酶的毛细管反应堆,可快速有效的释放N-糖链,常规酶解37℃下需24h,优化的毛细管反应堆实验在室温下只需要5.5min。

固定化酶的形式多样,依不同形式的载体有色谱粒子、自己组装的磁珠、开放式熔融石英毛细管材料、多孔材料等。依不同用途有颗粒、线条、薄膜和酶管等形状。Krenkova等[46]确定以单片为支持物固定PNGase F酶来快速有效的从糖蛋白中释放N-糖链。单片孔隙表面是通过琥珀酰亚胺-6-碘氨酸-己酸盐连接和谷胱甘肽-S-转移酶特定亲和力从而定向耦合。随后用MALDI/MS和CE-LIF分析释放的糖。结果显示固定化PNGase F酶具有更高的活性,并且使用流入式固定化微反应器在几秒钟内可以快速去糖基。

2 各种去糖基化方法的优缺点

酶法条件温和,不影响肽链结构。酶解可以在溶液条件下或胶内进行,应用十分方便。对N-连接糖肽,PNGase A酶和PNGase F酶对寡糖结构特异性较宽,对肽分子专一性较强,然而只能释放含3~40个氨基酸的糖肽分子的糖基,对肽中氨基酸序列有一定要求。PNGase F酶是酶法去糖基中应用最广泛的,其可耐受一定浓度的变性剂如TX-100及SDS等,但是这种方法的缺点是不能区分自发脱氨基和酶促去糖基,这两种反应都造成N向D的转化而自发脱氨现象。另外,PNGase F对于以α-1-3形式相连的海藻型糖链和β-1-2形式相连的木糖型糖链不起作用。PNGase A酶可以有效的清除海藻型糖蛋白,但不适用于含有唾液酸基的N-乙酰氨基葡萄糖胺糖蛋白。Endo H和Endo F由于都是从糖链内部专一性切开某个键,因此在糖链结构分析以及结构与功能关系研究中非常有用。二者对蛋白质的特异性较弱,且只能部分去除糖基,酶解后会留下GlcNAc残基在Asn上。对O-连接的糖肽,需要一系列外切糖苷酶释放寡糖,当只剩下蛋白核心1和核心3时,再用O-糖苷酶作用于GalNAc-Ser/Thr键,O-糖苷酶的缺点是作用位点有限。虽然酶法温和,但是在传统的酶法去糖基化过程中,脱糖基化过程一般会导致目标糖蛋白不可逆的变性,而且耗费较长时间,通常需要过夜反应。

化学法反应速率快,且可以达到完全去糖基化。肼解法用于释放GlcNAc-Asn相连的N-糖蛋白,该方法的缺点是:首先,N-乙酰氨基糖的乙酰基、唾液酸的乙酰基和乙醇酰基在肼解条件下会发生水解;其次,剩余的肼或氨基酸会和还原糖末端结合;再次,高反应温度会导致GlcNAc的损失;最后,此过程必须严格保持无水条件,且肼解法条件剧烈,会引起蛋白质变性,仅用于获取供结构分析用的糖链。但是只要谨慎使用,肼解是可以被商业化大量使用的。三氟甲磺酸法反应迅速,条件温和,对蛋白质构象无影响,适用于所有类型的糖链分析。该方法的缺点是如果糖链末端有唾液酸存在,反应的效率会受到影响,还会破坏糖链结构,造成所获得的糖链信息的不全面和不准确。另外,此法过程需保持严格无水。高碘酸氧化-β消除法被广泛应用于含GalNAc-Ser/Thr连接的O-糖蛋白,反应条件温和,对肽链影响不大且O-糖链去除较干净,所以是化学法里最理想的去糖基方法。O-连接的糖苷键对碱很敏感,该法在碱性条件下可以完全去除O-连接糖,对于N-连接糖,去除之后会有GlcNAc残基留在Asn上。三氟乙酸法适合于中性O-连接糖蛋白。该反应的缺点是丝氨酸和苏氨酸与N-乙酰半乳糖胺键的O-糖苷键会发生断裂,半乳糖胺残基发生部分裂解,且该反应释放的寡糖并不能定量回收,同时糖链还原末端会有部分降解。虽然化学法去除糖基速度快,但是化学法会释放有害化学物质,破坏蛋白质和糖链结构。而且化学法会导致不良副反应,如差向异构化作用、水化和羟基化。

压力循环辅助技术可以有效的缩短去糖基过程的时间以及酶的使用量,适合大规模去糖基化糖蛋白的制备。微波辅助技术可以保证蛋白质的完整性,有利于对蛋白质结构和功能的研究。固定化酶技术可以长期稳定进行、反应速率快、没有酶污染反应、酶可重复利用。辅助去糖基虽然效果好,但是操作复杂,成本高,目前只处于试验阶段,工业化发展有待进一步研究。

3 去糖基化后的结构分析方法

糖蛋白去糖基后,释放出寡糖,再结合核磁共振、质谱法、电泳等方法来检测分析结构变化,从而综合分析糖蛋白的结构特点。

3.1 核磁共振

核磁共振(NMR)将所测样品的实验谱图数据跟数据库信息对比可以用来确定糖类化合物的结构、分支、微观多样性等。Agrawal等[47]以酶法和化学法释放糖链后,使用一维和二维NMR技术来识别单体的糖残基、异头构象、内部糖苷键、序列和位点,建立天然寡糖和糖苷的结构。Mcalister等[48]用Endo H释放了CD5d1的糖链,去除了O-糖基化的C端残基,NMR测量其平移的自扩散系数和二维1H原子核奥佛好塞效应光谱实验,去除糖基后减少了CD5d1不均一性,改善其核磁共振图谱。Westerholm-Parvinen等[49]为了了解里式木属酪氨酸酶的反应机制,用胰蛋白酶对其水解,用EDMAN降解法对N端测序且用MALDI-TOF-MS、NMR分析。Rooijen等[50]用PNGase F酶法和碱解法分别释放人类羊水转铁蛋白italic>N-连接糖链和O-连接糖链,经凝胶过滤色谱分级,分级的样品经高pH阴离子交换色谱柱,再用500~600MHz 1H NMR分析,发现转铁蛋白有14个N-连接糖链和2个O-连接糖链。由于糖苷配体是可变因素,要想获得完整的结构信息,还要与红外分析、质谱、甲基化分析等方法相结合。

3.2 质谱

Merry等[51]采用肼解糖蛋白后,2-AP标记O-连接糖,用MS分析释放的寡糖。Yabu等[52]通过肼解释放血清的O-连接糖链,质谱检测到18种酸性和两种中性寡糖。由于糖蛋白的分子结构是不均一的,给糖蛋白的质谱测定带来了很大困难,如今应用最多的是基质辅助激光解吸质谱,其能耐受一定的盐浓度和洗涤剂,特别适合于混合多肽、蛋白质、多糖的精确质量数测定。Harvey等[53]探索了从血清中释放的糖链的结构和识别癌症生物标记,释放的糖链用ESI和MALDI-MS分析。Morelle和Michalski[54]使用PNGase F酶和PNGase A酶先去除N-连接糖链,再用β-消除法去除O-连接糖链,糖链经甲基化后进入C18纯化,再在MALDI-TOF-MS和nano-ESI-MS-MS进行分析。Ciolczyk-Wierzbicka等[55]利用SDS-PAGE将待分析的钙黏蛋白分离后,切割感兴趣的条带,进行还原反应和烷基化后,用PNGase F酶解胶上钙黏蛋白并释放糖链,然后利用MALDI-MS对糖链结构进行了分析,发现其是高甘露糖型、连有α2-6唾液酸的二天线复杂型糖链。Bunkenborg等[56]使用凝集素亲和层析对人体体液纯化后,胰蛋白酶水解成糖肽,糖肽由亲和作用色谱富集后,用MALDI MS和LC-MS/MS对其进行分析。

3.3 电泳

3.3.1 聚丙烯凝胶电泳

聚丙烯凝胶电泳中应用最多的是SDS-PAGE,适用于不易纯化或量少的样品,是糖组学糖蛋白糖链结构研究的有力工具。Hsieh和Chen[57]以糖蛋白为目标,在样品中加入洗涤剂和强还原剂煮沸3min,考与斯亮蓝染色,电泳3h,发现糖蛋白已去糖基。Sangadala等[58]先用TFMS和高碘酸钾去除黏蛋白糖基后,分离得到的多肽链再经含有12%的分离胶和4%的浓缩胶的电泳分析,由软件计算得到分子质量为63kDa。Bhattacharyya等[59]用化学法去糖基后,电泳只能检测到乙酰氨基半乳糖,大量亏损的唾液酸、岩藻糖、半乳糖和乙酰氨基葡萄糖检测不到,经高压液相色谱纯化后得到P1,发现P1有高水平的苏氨酸、丝氨酸和脯氨酸,其分子质量为97kDa。

3.3.2 毛细管电泳

毛细管电泳可以研究完整糖蛋白、糖肽及释放的寡糖链[60]。酶法或化学法释放出来的糖链,毛细管电泳在分析糖链时主要是测定糖链的分子质量、组成分析、纯度鉴定、结构归属及单糖残基差向异构体的分离等。Ma等[61]用PNGase F酶解重组免疫球蛋白,得到寡糖的结构特征。Nakano等[62]通过酶解或化学法释放N-糖链,从不同的荧光剂2-氨基吡啶(2-AP)、聚糖对氨基苯甲酸(2-AA)等和不同形式的电泳(毛细管区带电泳、毛细管亲和电泳等)来改善糖链的特异性,从而获得糖链的结构信息。

4 展望

酶法与化学法是糖蛋白质组学研究中不可或缺的研究方法,虽然现有的方法在去糖基方面取得了一定的进展,但也有缺点,尚有很大的发展空间,目前仅对转铁蛋白、核糖核酸酶B、免疫球蛋白等糖蛋白进行了相关研究。去糖基化不仅应用于糖蛋白,在其他含有糖基的活性成分的研究中也具有重要作用。例如,皂苷,Litvinenko和Makarov[63]碱解黄酮苷类,Park等[64]用β-糖苷酶去除人参皂苷中的糖基来研究生物转换机制。

辅助去糖基作为一种高效去除糖链的方法,在蛋白质生物制品研究领域显示了独特的优势,并得到了广泛的应用。随着新型电泳、质谱、核磁共振等检测方法的研究以及与它们的联合应用的进一步深入,去糖基化法和去糖基化程度的检测法都有了大幅度提高,可以预言,样品的制备将进入自动化控制程序, 从而确保样品分析的重复性和精确度。

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