2017, Vol. 37文章信息
- 陈静, 康赐明, 罗文新.
- CHEN Jing, KANG Ci-ming, LUO Wen-xin.
- 治疗性抗体半衰期改造研究进展
- Advance in Research on Antibody Half-Life Related Engineering
- 中国生物工程杂志, 2017, 37(5): 87-96
- China Biotechnology, 2017, 37(5): 87-96
- http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20170511
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文章历史
- 收稿日期: 2016-11-20
- 修回日期: 2017-01-16
2. 厦门大学公共卫生学院 厦门 361102
2. School of Public Health, Xiamen University, Xiamen 361102, China
治疗性抗体已经成为医疗领域中不可或缺的一类药物，其在包括肿瘤[1]、传染性疾病[2]以及自身免疫性疾病[3]等中均具有良好的治疗效果，并且其治疗潜力仍在不断被开发。治疗性抗体所占的药物市场份额逐年攀升，成为各大制药公司的研发热点。抗体药物市场竞争日益激烈促进了抗体相关研究的蓬勃发展。研究者们的关注焦点不再局限于抗体新药的发现，基于亲本抗体的相关基因工程改造技术获得的下一代抗体受到越来越多的重视，这些改造包括改善抗原结合性质、调节抗体Fc效应功能和药物代谢动力学性质等[4]。
抗体半衰期是抗体药物代谢动力学的关键性质。长期以来，治疗性抗体药物不可避免的高研发成本所产生的昂贵售价并不亲民，并且频繁的注射给药也给患者带来诸多不便。因此，近年来，延长抗体半衰期成为抗体工程改造的重点。抗体半衰期的延长不仅可以提高药效, 减少给药频率, 并且可以降低治疗费用[5]。绝大多数已经获批或处于临床试验阶段的治疗性抗体属于IgG型，本文将以IgG型抗体为例，从抗体半衰期的影响因素、抗体半衰期的改造方法及其相关原理和临床研究进行综述。
1 抗体半衰期的影响因素IgG是血清中含量最高的免疫球蛋白，平均浓度为11~14mg/ml[6]。同时，IgG也是免疫球蛋白中半衰期最长的，能够达到1~3周，而其他型别的抗体均少于1周[7]。这也是研究者倾向于使用IgG型别的抗体作为治疗性抗体的主要原因之一。IgG的高血清滴度和相对较长的半衰期源于新生儿受体(FcRn)介导的代谢调控。IgG的Fc部分能够特异性的同FcRn进行pH依赖性结合，当IgG被血液中的造血细胞或血管内皮细胞通过胞饮作用吞噬时，在内含体酸性pH(pH6.0) 条件下IgG会被FcRn受体结合捕获，使其免于被溶酶体降解，从而循环到细胞表面，在中性pH(pH7.4) 条件下被FcRn释放到血液中[8-10]。
IgG抗体在体内的清除主要通过两种途径：非特异性清除和抗原介导的特异性清除[6]。一方面，在非特异性清除过程中，大部分IgG通过FcRn介导的回收途径在血液中循环，而未结合FcRn的IgG则会被降解。此外，抗体自身的理化性质，包括抗体分子的带电性质[11-12]、疏水性[13-14]、Fab性质[15-16]以及翻译后修饰(甲硫氨酸氧化[17-18]和糖基化修饰[19])等，也会影响抗体的非特异性清除。另一方面，当IgG与抗原形成复合物时，通过抗体的效应作用，该复合物会被相关免疫细胞吞噬并降解，即抗原介导的特异性清除。
基于以上原因，影响治疗性抗体半衰期的因素主要有Fc-FcRn相互作用、抗体-抗原相互作用以及抗体本身的理化性质。此外，给药途径对治疗性抗体的半衰期也有一定的影响[20]。
2 抗体半衰期的改造途径和研究进展目前，关于延长抗体半衰期的改造主要有4种途径，分别是改善FcRn结合活性相关的Fc改造、抗体等电点改造、pH依赖性抗原结合改造以及钙离子依赖性抗原结合改造。除了Fc改造位于抗体恒定区的Fc片段，另外3种途径均针对抗体可变区(图 1)。
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| 图 1 抗体半衰期的改造途径 Figure 1 Engineering pathways of antibody half-life |
20世纪90年代，随着大鼠FcRn与Fc复合物晶体结构的解析[21]及FcRn调控体内IgG型抗体水平[22]这一重要功能的发现，研究者开始尝试利用Fc片段的改造以延长治疗性IgG型抗体在血液中的存在时间。IgG上的FcRn结合位点位于Fc上CH2和CH3的交界区域，通过突变Fc上的氨基酸来增强其与FcRn在pH6.0条件下的结合能力，同时保持pH依赖效果，从而提高抗体半衰期[23][如图 2(a)]。1997年，首次有文献报道运用噬菌体展示技术筛选获得带有FcRn-IgG相互作用位点附近氨基酸突变的Fc片段(小鼠IgG1来源)，其中的一个突变片段(T252L/T254S/T256F)在pH 6.0条件下同鼠FcRn的亲和力约为野生型的3.5倍，而在小鼠体内的半衰期提高了约1.6倍[24]。由于IgG与FcRn的结合活性存在种属差异，鼠源IgG同人FcRn的结合能力很弱，而人源IgG同鼠FcRn的亲和力高于人FcRn[25]。因此，鼠源抗体的Fc改造位点无法直接运用到人源抗体的Fc上，并且普通小鼠不能作为人源Fc改造抗体的动物评价模型。2000年以后，改善FcRn结合活性相关的Fc改造对象集中在人源IgG抗体上，同时，相关的研究团队发展了人hFcRn转基因小鼠[26-27]以及非人灵长类动物作为改造效果的评估模型。
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| 图 2 抗体半衰期的改造原理 Figure 2 Engineering principles of antibody half-life (a) Fc engineering (b) Isoelectric engineering of antibody (c)Engineering of pH-dependent antigen binding (d)Engineering of calcium-dependent antigen binding |
Fc改造方法主要有4种，分别是丙氨酸扫描[28]、定向诱变[23, 29]、分子模拟[30-32]以及随机突变[33]。丙氨酸扫描是将抗体Fc内所有表面亲水氨基酸分别单一突变成丙氨酸，其中，N434A是所有丙氨酸单点扫描中FcRn结合活性提高最显著的[28]，该变体在pH6.0条件下同人FcRn的亲和力与野生型相比有4倍的提高，并且在食蟹猴体内半衰期提高了1.6倍[29]。单点突变能够最大限度保持Fc片段的保守性和稳定性，但是受限于单一的一种点突变，该方法并不能得到最优的改造变体。随后的突变改造大部分是通过定点诱变和分子模拟以获得能够提高FcRn结合活性的Fc突变组合。定向诱变和分子模拟均以FcRn分子晶体结构为基础，替换包括FcRn结合位点在内以及邻近的一个至多个氨基酸。例如，Hinton等[31]利用定向诱变获得T250Q/M428L变体，在pH6.0条件下同人FcRn亲和力提高了28倍，而且在恒河猴体内半衰期同比野生型提高了1.8倍。Zalevsky等[32]利用分子模拟得到M428L/N434S等多个变体，其中M428L/N434S变体同人FcRn在pH6.0下的亲和力提高了11倍，食蟹猴体内半衰期延长达3.2倍之多。定向诱变和分子模拟都是利用结构指导功能改善的方法，仍然存在突变区域和氨基酸个数的局限。近年来，研究者尝试采用随机突变的方法，在Fc范围内进行任意突变，以获得更多提高FcRn结合能力的突变组合。这种方法可以筛选到远离FcRn结合位点并且能够远距离影响FcRn结合效果的突变氨基酸[33]。例如，Monnet等[34]利用随机突变的方法得到了一个可以提高FcRn结合能力并且适应不同效应功能需要的改造抗体池。由于Fc片段属于抗体保守的恒定区部分，随机突变相较于其它三种方法而言，在氨基酸替换个数增加的同时，需要考虑突变组合中无效突变的存在[34]以及突变位点对抗体整体稳定性和免疫原性的影响。
在过去的15年间，研究人员虽然成功地利用Fc改造达到延长治疗性抗体半衰期的目的，但是，FcRn亲和力的增加和抗体半衰期的改善程度之间的关系一直伴随着研究的进行被探讨。两者之间的关系存在两个问题：其一是通过FcRn亲和力的增加，抗体半衰期能够延长到什么程度？Fc改造不仅需要提高pH6.0时FcRn的结合活性，而且还要维持pH依赖效果，即在pH7.4条件下的低亲和力，使抗体能够顺利释放到中性pH的胞外。然而，改善IgG和FcRn在pH 6.0的亲和力往往伴随中性pH时亲和力的增加[23, 29, 35]。基于这个原因，Fc改造延长治疗性抗体半衰期的程度是有限的，这也能说明单纯以pH6.0时的结合强度作为筛选条件并不一定得到体内半衰期延长效果最好的变体。在2015年的一篇报道中，研究人员尝试界定中性pH条件下亲和力提高的阈值，从而使pH6.0时亲和力的提高能达到延长半衰期的效果[35]。研究结果显示，该阈值为400~900nmol/L[35]。由于这一阈值的存在，Fc改造需要平衡两个pH之间的亲和力提升程度，因此，通过Fc改造途径，目前抗体体内半衰期的最大延长空间大概在4倍左右。
其二是为何体外FcRn亲和力的提升程度和体内半衰期的延长效果不一致？从历年的Fc改造结果(表 1)不难发现FcRn亲和力的提高倍数和血清半衰期的增加倍数之间存在差距，主要原因有以下几点：首先，如上所述，酸性pH亲和力提高的同时会引起中性pH亲和力不同程度的提高，从而影响抗体半衰期；其次，不同研究团队评价FcRn-IgG体外结合活性的方法存在差异，以表面等离子共振(SPR)的亲和力测定为例，芯片包被策略就有三种，包括偶联改造抗体、抗原以及FcRn受体，不同策略测得的亲和力并不一致[36]。此外，对于一些抗体，胞内环境(盐浓度、温度等)会使其同FcRn相互作用的结果与体外实验条件下的效果出现偏差[37]。最后，抗体理化性质也是不可忽略的重要因素。因此，近年来，研究人员开始探索新的改造途径以进一步延长治疗性抗体的半衰期。
| 氨基酸突变位点 | IgG亚型 | 靶向抗原 | FcRn亲和力 (pH6.0时)提高倍数 | 血清半衰期 提高倍数 | 清除倍数 | 年份 |
| M428L | IgG2 | HBV | 7(H)①; 8(R)② | 1.8(R) | 0.56(R) | 2004[30] |
| T250Q/M428L | IgG2 | HBV | 28(H); 27(R) | 1.8(R) | 0.36(R) | 2004[30] |
| M252Y/S254T/T256E | IgG1 | RSV | 11(H); 9(R) | 3.5 (C)③ | N.A.④ | 2006[38] |
| T250Q/M428L | IgG1 | HBV | 29(H); 37(R) | 2.5 (R) | 0.42 (R) | 2006[31] |
| P257I/N434H | IgG1 | TNFa | 16(H); 52(C) | 0.8(C) | 1.1(C) | 2007[39] |
| D376V/N434H | IgG1 | TNFa | 15(H); 52(C) | 0.7(C) | 1.3(C) | 2007[39] |
| T250Q/M428L | IgG1 | TNFa | 40(C) | 0.9(C) | 1.1(C) | 2007[40] |
| P257I/Q311I | IgG1 | TNFa | 19(H); 80(C) | 0.8(C) | 0.8(C) | 2007[40] |
| N434A | IgG1 | hBSR | 4 (H) | 1.6 (C) | 0.54(C) | 2009[29] |
| N434W | IgG1 | hBSR | 80(H) | 1.0 (C) | 1.2(C) | 2009[29] |
| M428L/N434S | IgG1 | VEGF | 11(H) | 3.2 (C) | 0.32 (C) | 2010[32] |
| V259I/V308F | IgG1 | VEGF | 6(H) | 1.7 (C) | 0.63 (C) | 2010[32] |
| M252Y/S254T/T256E | IgG1 | VEGF | 7(H) | 2.5(C) | 0.42(C) | 2010[32] |
| V259I/V308F/M428L | IgG1 | VEGF | 20(H) | 2.6(C) | 0.39(C) | 2010[32] |
| M428L/N434S | IgG1 | EGFR | 11(H) | 3.1(C) | 0.31(C) | 2010[32] |
| N434H | IgG1 | VEGF | 4(H); 5(C) | 1.6(C) | 0.62(C) | 2010[41] |
| T307Q/N434A | IgG1 | VEGF | 10(H); 12(C) | 2.0(C) | 0.49(C) | 2010[41] |
| T307Q/N434S | IgG1 | VEGF | 4(H); 5(C) | 1.6(C) | 1.6(C) | 2010[41] |
| T307Q/E380A/N434A | IgG1 | VEGF | 13(H); 15(C) | 1.9(C) | 0.75(C) | 2010[41] |
| V308P/N434A | IgG1 | VEGF | 26(H); 34(C) | 1.8(C) | 0.57(C) | 2010[41] |
| N434H | IgG1 | CD4 | 3(H); 3(B) 5) | N.A. | 0.50 (B) | 2011[42] |
| V308P | IgG4 | 5种抗原 | 40~390(C) | 2.0~3.3(C) | 0.22~0.74(C) | 2012[43] |
| T250Q/M428L | IgG4 | 5种抗原 | 11~110(C) | 0.9~2.6(C) | 0.31~0.89(C) | 2012[43] |
| M252Y/S254T/T256E | IgG1 | RSV | N.A. | 2-4(H) | N.A. | 2013[44] |
| M252Y/S254T/T256E | IgG1 | CD20 | 1.9(H) | 2.7(M) 6) | 0.56(M) | 2014[33] |
| N315D/A330V/N361D/ A378V/N434Y | IgG1 | CD20 | 7.4(H) | 2.3(M) | 0.57(M) | 2014[33] |
| E294D/T307P/N434Y | IgG1 | CD20 | 5.2(H) | 2.8(M) | 0.32(M) | 2014[33] |
| V259I/N315D/N434Y | IgG1 | CD20 | 6.1(H) | 2.3(M) | 0.59(M) | 2014[33] |
| T307A/N315D/A330V/ E382V/N389T/N434Y | IgG1 | CD20 | 4.2(H) | 2.3(M) | 0.68(M) | 2014[33] |
| Y31-M252Y/S254T/T256E | IgG1 | RSV | 25.5(H); 25.3(C) | 5(M); 1.8(C) | 0.40(M); 0.54(C) | 2015[35] |
| N434A | IgG1 | Lewis Y | 28(H) | 1.6(M) | 0.48(M) | 2016[45] |
| Note: ① H: Human; ② R: Rhesus macaque; ③ C: Cynomolgus macaque; ④ N.A.: No available data; ⑤ B: Baboon; ⑥ M: hFcRn mice | ||||||
2.2 抗体等电点改造
如上所述，随着对Fc改造效果认识的不断深入，从2010年左右开始，非IgG-FcRn相互作用的因素逐渐受到重视，并成为新的改造思路。多篇文献报道发现，带有相同Fc片段的不同抗体的半衰期和清除速率均存在显著差异[11, 15-16, 46-49]。此外，有相当一部分抗体分子在实验动物体内表现出快速的清除速率[13-14, 50]。显然，这是可变区的差异所致。进一步的研究表明抗体的带电性质是其中的关键因素。等电点(isoelectric point, pI)作为抗体重要的理化参数，可以反映抗体在不同pH溶液环境中表面净电荷的大小。在细胞外环境(中性pH)中，抗体的pI越低所带正电荷越少，越不容易被带负电荷的细胞表面吸引，从而减少抗体的入胞速率以及随后被溶酶体降解的概率[图 2(b)]。Igawa等[46]通过抗体可变区表面氨基酸点突变的方式将pI从9.3降低到6.9和5.5，最终在食蟹猴体内的抗体清除速率分别降低了2.0倍和3.1倍。后续的报道也表明抗体等电点1个单位以上的波动可以影响抗体半衰期[51]。Li等[11]发现将一株抗HCV人源化抗体的轻链可变区模板由Kappa 1替换成Kappa 4可以显著减少抗体的体内清除，并通过对模板为Kappa 1的抗体进行等电点改造证实这一结果源于抗体等电点的下调。此外，抗体可变区表面电荷的分布差异也会引起抗体和细胞或其他蛋白质的非特异性结合的变化，影响抗体的清除速率[12, 49]。在最近一篇关于双特异性抗体多维度改造的研究报道中，研究人员发现人源化后的双特异性抗体hBS106在小鼠体内高于正常水平的清除速率源于其中一个Fv臂表面存在一个正电荷簇，通过在附近引入一个带负电荷的氨基酸突变点(Tyr30Glu)平衡正电荷簇后，新的变体hBS128的体内清除速率下降为原来的4倍；经过进一步的等电点改造(约1.5个单位的降低)，清除速率又改善了近2倍[52]。最终的改造分子hBS910在食蟹猴体内的半衰期达到3周，而改造前的抗体仅为2周[53]。大幅降低等电点的策略往往会产生抗原特异性结合能力以及抗体稳定性减弱等风险，并不适用于所有抗体半衰期改造。因此，对于一些由于等电点较高导致体内清除过快的候选治疗性抗体分子，可以通过平衡可变区的电荷分布以减少抗体同体内组织细胞的非特异性结合，使其恢复正常的代谢水平。同时，这种改造方式对抗体的等电点和氨基酸变动较小，有利于保持野生型的功能活性。例如，在无法大幅降低pI的情况下，Datta-Mannan等[47]运用分子表面模拟指导CDR区点突变以平衡表面正电荷的区域分布，从而使一株人源化IgG4型抗体的血浆代谢达到接近7倍的改善。
2.3 pH依赖性抗原结合改造抗体的治疗作用体现在特异性介导体内病原体的清除，当抗体结合上抗原后，二者形成的免疫复合物随即被降解。长期以来，抗原介导的抗体清除虽然是影响抗体半衰期的另一关键因素，却往往因其为治疗性抗体的“使命”而被忽视。2010年，Igawa等[54]首次利用组氨酸替换将抗体可变区改造成具有抗原pH依赖性结合的特性。由于侧链咪唑基团的存在，组氨酸的酸度系数(pKa)大约为6，通过在抗体可变区某些位点引入组氨酸，当外围环境pH由中性变为酸性时，组氨酸的质子化可导致抗原-抗体相互作用减弱，加速抗原-抗体复合物的分离[55]。如图 2(c)所示，改造抗体在血液中性pH(pH7.4) 条件下结合捕获抗原，在细胞内含体酸性pH(pH6.0) 条件下释放抗原，使得抗原被降解，而抗体则通过FcRn介导的相反的pH依赖性结合途径，循环回血液中[4, 54-56]。pH依赖性抗原结合改造不仅突破每个抗体结合抗原的次数限制，而且降低了抗体介导的抗原血浆浓度的累积[55]。此后其他团队也成功运用该途径延长抗体的半衰期[57-58]。例如，Chaparro-Riggers等[57]通过组氨酸扫描改造出的抗PCSK9(proprotein convertase substilisin kexin type 9) 抗体J17在食蟹猴体内的半衰期为7.4天，而野生型抗体J16的半衰期仅为0.9天。
目前，pH依赖性抗原结合改造方法主要有4种，包括组氨酸突变、重组组氨酸抗体文库、直接识别以及从富含组氨酸的合成文库筛选[55-56]。起初的改造针对的是非pH依赖性抗原结合的抗体，研究者主要利用定点突变的方法在CDR或FR区引入多个组氨酸，从而改变野生型抗体在酸性pH条件下同抗原的结合活性[54]。这种方法的突变组合有限，无法获得最佳突变组合的同时仍要耗费较多的时间和研究成本，而且会出现中性pH条件下抗原亲和力减少的问题。中性pH时的抗原亲和力对抗体的生物活性至关重要，需要额外的亲和力成熟改造进行回复。随后，研究者采用构建重组组氨酸扫描文库的方法，通过噬菌体[59]或酵母[60]展示实现抗原高亲和力和pH依赖结合活性的同步筛选。这种方法通量大，效率高，适用范围更广[59]。即便采用重组组氨酸扫描文库筛选，抗原在中性pH时的亲和力和野生型相比依然有所下降[59-60]，而且pH6.0时的亲和力降低水平同样有限。这是因为改造对象本身不具有pH依赖性抗原结合活性，并且往往经过特异性的筛选(高亲和力，强中和活性)，其序列以及CDR信息并不适合进一步的pH依赖改造的整合[61]。这个问题可以通过直接从免疫过的动物体内或人的抗体cDNA文库中高通量筛选出pH依赖性抗体的方法解决，但是pH依赖性抗体在抗原特异性抗体中所占的比例通常不到5%[56]，因为组氨酸在天然抗体的CDR中出现的频率很低(0.5%~0.6%)[55, 61]。基于以上因素，2015年的一篇报道采用从头合成富含组氨酸的抗体库的方法，从中筛选到了一株在pH7.2时的抗原亲和力达到纳摩尔(nmol/L)水平，同时在pH6.0时检测不到抗原结合活性的改造抗体[61]。
2.4 钙离子依赖性抗原结合改造考虑到对于一些在酸性pH环境中带负电荷或成为质子受体的表位，组氨酸介导的改造可能会失去pH依赖效果，研究者尝试利用钙离子在细胞内含体以及血浆的浓度差异，将抗体可变区改造成具有钙离子依赖性抗原结合的特性，以替代pH依赖性抗原结合改造[62]。如图 2(d)所示，改造抗体在含有较高浓度钙离子(1.2~2mmol/L)的血浆中结合抗原，在细胞内涵体低浓度钙离子(3~30μmol/L)的环境中释放抗原，游离的抗原在溶酶体中降解，而改造抗体则被FcRn捕获并循环回血液[56, 62]。基于该原理，2015年，Igawa等[62]成功改造出钙离子依赖性的抗白细胞介素6受体(anti-interleukin-6R)的抗体，并且证实该改造加速了抗原从血浆中的清除。相比于血浆与内涵体之间50倍的质子浓度差异，钙离子的浓度差异达到了650倍[62]。因此，钙离子依赖性抗原结合改造能够产生更大的亲和力落差，更有利于抗原-抗体复合物在内涵体中的分离[55]。
3 前景与展望相比于小分子药物，单克隆抗体药物以其能够高度靶向结合抗原，从而引发机体针对抗原的强效免疫反应、不良反应小以及血清半衰期长的优势，成为新世纪治疗性药物开发的热点。随着抗体药物的飞速发展，研究者已不再局限于抗体新药的研发，以提高治疗性抗体药物代谢动力学性质等相关的抗体基因工程改造成为重要的研究领域。通过改善已上市抗体的半衰期、效应功能以及抗原结合能力，可以进一步提高改造抗体的药效，相比于筛选新的治疗性抗体，具有研发周期短、成本低等潜在优势。
在延长治疗性抗体半衰期相关的改造技术中，改善FcRn结合活性相关的Fc改造技术最为成熟，目前已有近20年的研究历史，而且已经应用到临床研究。抗RSV的YTE改造抗体(motavizumab)已证实在健康人体内能够延长超过4倍的半衰期[44]。Fc改造抗体往往不会影响抗原特异性，而且报道过的改造抗体基本没有出现严重免疫原性。对于优秀的人源抗体或者已经经过亲和力成熟改造的人源化抗体而言，Fc改造较为容易。由于影响抗体半衰期的因素有很多，同一Fc的有效突变改造对于不同可变区的抗体，半衰期的延长效果也会有差异[43]。因此，可以建立一个Fc改造抗体库，从中选出效果最优的改造突变体作为候选抗体进入后期的临床研究。此外，最近已经有研究者开始尝试将改造的Fc融合到治疗性多肽或蛋白质药物以进一步提高其半衰期[63]。
近几年，一些在动物体内药物代谢动力学性质异常(半衰期短、清除速率远高于正常水平)的治疗性抗体候选分子受到更多的关注[11, 14, 48]。造成异常的主要原因在于这些抗体存在组织或细胞的非特异性结合，导致非特异性的组织清除[49]。进一步的研究表明，非特异性结合的分子机制很可能在于抗体带电荷性质的差异，包括等电点大小以及表明电荷的分布情况[11-12, 49]。这也能解释为什么不同抗体分子在同一Fc改造条件下半衰期的改善程度会存在差别。基于抗体带电性质的改造(本文统称为“抗体等电点改造”)可以有效恢复抗体的正常代谢水平，甚至提升半衰期[52]。此外，抗体的疏水性也是影响抗体非特异性清除的潜在因素[13-14, 49]，也可能成为未来抗体半衰期改造的方向之一。最近的一篇研究报道了通过对抗体偶联药物的疏水性改造可以使其半衰期恢复到野生型抗体的水平[64]。因此，在Fc改造前，有必要对候选治疗性抗体分子进行理化性质的分析，确保这些性质在正常的水平范围内，才能确保改造达到理想的效果[12]。
Fc改造以及抗体等电点改造针对的是降低治疗性抗体在体内的非特异性清除，从而延长血清半衰期。然而，当靶向抗原为膜型抗原或高浓度游离抗原时，抗原介导的特异性清除成为影响抗体半衰期的主导因素[56]。pH依赖性以及钙离子依赖性抗原结合改造能够使抗体分子多次结合并降解抗原，降低抗原介导的特异性清除，从而获得低剂量治疗性抗体中和体内持续产生或大量存在的抗原的效果[54, 62]。近年来，Igawa团队陆续提出了“循环抗体”(recycling antibody)[54, 56]及“清道夫抗体”(sweeping antibody)[55-56, 65]的概念，把Fc改造和pH依赖性抗原结合改造相结合，使抗原的清除效率以及抗体半衰期得到了同步提升。尽管针对可变区的改造以延长抗体半衰期的技术具有一定的发展潜力，但它们的适用性不及传统的恒定区Fc改造，技术水平要求更高。不仅需要维持抗原亲和力，而且更容易增加免疫原性，降低抗体蛋白的稳定性。此外，对于pH依赖性或钙离子依赖性的抗原结合改造，其临床前评估难度更大，因为抗原的异源性很容易干扰抗体的改造效果[56]。
综上所述，抗体半衰期相关改造技术各有优劣，而抗体的多样性带来抗原特异性和高亲和力的同时，也使得抗体具有高度的异质性。因此，治疗性抗体半衰期改造并没有固定的策略，对于现有的临床前候选抗体分子，需要根据抗体自身以及相应抗原的特性进行设计，从而达到最理想的效果。从治疗性抗体的研发角度，这20年来半衰期相关改造技术的发展可以提供一定的指导。在未来的研发思路中，应该将影响抗体半衰期的因素考虑到最初的抗体筛选阶段或者将相应的改造整合进去，这样可以避免后期的改造不及预期，缩短抗体药物的研发周期。
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