文章信息
- 孟坤, 何庆瑜, 王通, 卢少华.
- MENG Kun, HE Qing-yu, WANG Tong, LU Shao-hua.
- 基于C6流式细胞仪平台应用FRET技术在活细胞中研究蛋白质相互作用
- The Study of Protein-protein Interactions Using a Flow Cytometry-based FRET Technology in Living Cells
- 中国生物工程杂志, 2017, 37(5): 45-51
- China Biotechnology, 2017, 37(5): 45-51
- http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20170506
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文章历史
- 收稿日期: 2016-10-10
- 修回日期: 2017-02-08
蛋白质是生命中几乎所有生理过程的实际执行者,控制机体细胞中诸多的生命活动。虽然有一部分蛋白质以单体形式发挥作用,但是更多的蛋白质往往是通过蛋白质之间或者与核酸之间相互作用参与到细胞中的生命活动[1]。因此,只有了解了蛋白质的相互作用才能更好的了解细胞的功能。目前研究蛋白质相互作用的主要方法有酵母双杂交技术、免疫共沉淀技术(co-IP)以及近几年新发展起来的串联亲和纯化技术及荧光共振能量转移技术等[2]。
荧光共振能量转移(FRET)技术近年来被广泛应用于检测生物活体中大分子的相互作用、蛋白酶活性检测、细胞生理研究、免疫分析等方面,是一种无创检测技术[3-4]。FRET的工作原理是供体分子和受体分子的距离小于或等于10纳米(≤10nm),且供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱会发生重叠,产生一种非放射性的能量转移现象,使得供体的荧光强度减弱或猝灭,而受体的荧光发射强度却大大增强,即FRET现象[5]。根据FRET的这一原理,将两个目标蛋白质分别与可以发生FRET的两个荧光蛋白融合后共转染细胞,如果可以发生FRET现象,则表明两个目标蛋白质的距离≤10nm,进而可以推论两个目标蛋白质有相互作用[6-7]。
传统检测FRET效率的手段有荧光显微镜平台及活细胞工作站,这两种检测方法只能检测单细胞中的FRET荧光效率,而对细胞群体的FRET荧光水平检测无能为力。FACS-FRET技术的运用,实现了在整体细胞水平检测FRET效率,并且可以进行定量分析[8-9]。常用的FRET对荧光基团有CFP-YFP、CFP-dsRED、BFP-GFP、Cy3-Cy5、YFP-TRITC、YFP-Cy3等。这些FRET荧光基团会对流式细胞仪要求具备有433nm或445nm的激光器,然而,目前国内的C6流式细胞仪没有此段波长的激光器,因此FRET实验只能在如FACSAriaTMⅡspecial order system型号等大型流式细胞仪上做,此类流式细胞仪价格非常昂贵,并不是每个实验室都能承担。本研究成功构建了EGFP-mCherry作为新的FRET荧光基团,使得在C6流式细胞仪(473nm或488nm和552nm的激发波长)即可应用FRET技术研究活细胞中的蛋白质相互作用,过程更简单,操作更方便,从而促进FRET技术的发展。
1 材料与方法 1.1 实验材料真核表达载体pEGFP-N1和pmCherry-N1购自Clontech公司;克隆构建用菌株DH5α由本实验室保存;克隆构建所用分子生物学工具酶购自TaKaRa公司;引物合成和测序服务均由睿博兴科生物技术有限公司完成;质粒提取试剂盒购自Magen公司;Lipofectamine2000试剂盒购自Life公司;HBE细胞和293t细胞由本实验室保存。
1.2 分子克隆构建使用PCR方法获得两端含有酶切位点的目的基因片段,限制内切酶对目的基因和质粒载体进行双酶切后,用T4连接酶进行连接。连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态菌株,37℃培养12h。挑选3~5个单克隆进行DNA测序分析鉴定,筛选正确的单克隆。各个质粒的PCR引物及所需内切酶见表 1。
Name | Primer sequences | 内切酶 |
mCherry | Forward:5′-CCCAAGCTTGGGCGGTCATGGTGAGCAAGG Reverse: 5′-CGGGGTACCCGCTTGTACAGCTCGTCCATGC |
Hind Ⅲ Kpn Ⅰ |
p53 | Forward:5′-CCCAAGCTTGGGCTTGTGCCCTGACTTTCAAC Reverse:5′-CGGGGTACCCGGGCTGTCAGTGGGGAAC |
Hind Ⅲ Kpn Ⅰ |
MDM2 | Forward:5′-ATAAAACTCGAGATGGTGAGGAGCAGGCAAATGTG Reverse:5′-ATAAAAGAATTCGGGGGAAATAAGTTAGCACAATC |
Xho Ⅰ EcoR Ⅰ |
1.3 细胞转染实验
293t细胞按80%密度种于6孔板中。12h后,用Lipofectamine2000试剂转染,转染步骤根据试剂盒操作说明进行。实验分组为:MOCK组、单质粒转染的EGFP组、单质粒转染的mCherry组、双质粒转染的EGFP+mCherry组和单质粒转染的EGFP-mCherry融合质粒组,以及双质粒转染的EGFP-p53+mCherry组、mCherry-p53+EGFP组、EGFP-MDM2+mCherry组、mCherry-MDM2+EGFP组、EGFP-p53+mCherry-MDM2组和EGFP-MDM2+mCherry-p53组。转染48h后用胰酶消化收集细胞,用PBS重悬,置于冰上,用于流式细胞仪检测。
1.4 用于FRET测定的C6流式细胞仪分析条件采用BD公司的Accuri C6流式细胞仪平台,根据所用荧光蛋白的荧光特性,采用473nm和552nm的激发通道。在473nm激发通道中,利用带通540/30和685/35分别检测EGFP荧光信号(FL2) 和EGFP到mCherry的FRET信号(FL4);在552nm激发通道中,用带通585/40检测mCherry荧光信号(FL1)。
1.5 FRET信号测定为验证实验中设计的EGFP-mCherry荧光集团可以作为FRET对,本研究设计了MOCK组作为空白对照,且用于圈门确定所分析的细胞群体;接着利用EGFP组和mCherry组调节通道补偿,并且画门,确定双阳性细胞群;其次,利用EGFP组、mCherry组、EGFP+mCherry组和EGFP-mCherry组圈门,去除mCherry收到473nm激光激发产生的假FRET信号;最后,利用EGFP-mCherry组圈门确定FRET阳性细胞比例。
1.6 数据分析与处理流式细胞仪测定的结果均使用BD Accuri C6 Software官方流式分析软件进行后续分析,结果统计及作图使用GraphPad Prism 6统计软件进行统计做图分析,所有结果均采用平均数±标准误(Mean±SEM)表示,采用Unpaired t test检验,P < 0.05认为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 表达质粒的克隆构建EGFP-mCherry、EGFP-p53、EGFP-MDM2、mCherry-p53和mCherry-MDM2融合表达质粒使用常规PCR及DNA测序方法进行验证,PCR结果经过2%琼脂糖凝胶电泳实验表明目的片段插入成功;测序结果与NCBI数据库匹对,结果显示完全匹对,表明5个融合质粒均构建成功(图 1)。
2.2 FRET阳性信号的检测结果在MOCK组圈门P1,确定所分析的细胞群体,如图 2(a)显示,90.8%的细胞状态良好。而图 2(b)显示,在用EGFP组和mCherry组调节通道补偿后,可以圈出R1门,确定双阳性细胞群;为了排除mCherry红光收到473nm激光激发产生的假FRET信号,故圈出P2门,见图 2(c); 最后,在EGFP-mCherry组中圈出P3门,确定FRET阳性细胞比例为99.9%,相比其他对照组,其FRET阳性信号显著升高(P < 0.000 1)[图 2(d)、(e)],表明本实验设计的FRET荧光基团EGFP-mCherry可以成功的在C6流式细胞仪上应用。
2.3 EGFP-mCherry荧光基团作为FRET对在实例中的应用结果为了检验EGFP-mCherry荧光基团是否能真正在C6细胞仪中用于检测活细胞中蛋白质的相互作用,我们在已经明确有相互作用的p53蛋白和MDM2蛋白中做验证。结果如图 3(a)所示,p53蛋白与MDM2蛋白,不管是融合在pEGFP-N1载体上还是融合在pmCherry-N1载体上,其相互作用关系仍然存在,表现在其检测到的FRET信号均达到90%以上。此外,为了排除载体本身就对p53和MDM2融合蛋白的影响,本实验还设计了EGFP-p53+mCherry组、mCherry-p53+EGFP组、EGFP-MDM2+mCherry组和mCherry-MDM2+EGFP组。结果均显示载体对融合蛋白没有影响,其FRET信号均为0%[图 3(b)]。通过统计分析发现,EGFP-p53+mCherry-MDM2组和EGFP-MDM2+mCherry-p53组其FRET阳性信号强度与其他对照组相比,明显升高(P < 0.000 1)[图 3(c)]。此结果表明,本实验研究构建的EGFP-mCherry荧光基团的确能够在C6细胞仪中用于检测活细胞中蛋白质的相互作用,并且可以对有相互作用的阳性细胞进行统计分析。
2.4 传统激光共聚焦显微镜技术检测蛋白质相互作用的局限性为了突出本研究构建的EGFP-mCherry荧光基团可以更好的检测蛋白质相互作用的特点,我们使用激光共聚焦技术对上述5个实验组做重复实验,结果检测到EGFP蛋白和mCherry蛋白存在很好的共定位,事实上,EGFP蛋白和mCherry是不存在相互作用的。而p53蛋白和MDM2蛋白之间已经明确有相互作用但却检测不到很好的共定位现象,由此说明使用激光共聚焦显微镜技术来判断蛋白质是否存在相互作用具有一定的局限性(图 4)。
3 讨论高通量筛选蛋白质之间的相互作用是目前蛋白质组学研究的技术瓶颈,而荧光共振能量转移(FRET)是一种可以在生物体内进行定量、定性和无损伤研究蛋白质相互作用、蛋白激酶活性等的新技术,与传统研究蛋白质相互作用的方法如亲和层析、酵母双杂交、免疫共沉淀、荧光光谱等相比,FRET技术的这些特点成为前面几种方法无可比拟的优点,因此受到广大科研工作者的推崇[6, 11]。虽然近年来FRET技术发展很快,但是其主要的局限性仍然存在。由于供体荧光分子的光谱与受体荧光分子的光谱重叠,使得很难检测到清晰的FRET信号,另外需要大量的对照实验以及复杂的软件算法才能完成一个FRET实验[12-13]。流式细胞术(FACS)是一种无创、灵敏、可定量以及可以检测细胞群体的技术,因此,基于流式细胞术平台的FRET技术应用(FACS-FRET),有可能成为解决这些限制从而实现FRET信号的检测和定量的方法[14]。
本研究构建了一对新的荧光基团EGFP-mCherry用于FACS-FRET技术在活细胞中检测蛋白质的相互作用,重要的是,相比国内外的其他研究[14-19],本研究还设计了合理的对照组,简化了实验操作步骤,使用最常见的pEGFP-N1和pmCherry-N1载体以及在普通的小型流式细胞仪C6即可运用FRET技术研究蛋白质的相互作用并实现定量统计分析,免去了复杂的软件计算。实验结果显示载体构建难度非常低,成功率高(图 1)。C6流式细胞仪检测到EGFP-mCherry融合基因的FRET信号强度很高,高达99.9%,定量结果非常直观,易于统计分析,而过程只需要简单几个步骤确定双阳性细胞及排除信号干扰(图 2)。另外,本研究还运用新构建成功的FRET荧光对在明确已知具有相互作用的p53蛋白和MDM2蛋白中做验证,同样取得非常好的效果,FRET信号强度高达90%以上,与其他的对照组相比具有显著差异(P < 0.000 1)(图 3),很好的验证了p53蛋白和MDM2蛋白的相互作用关系。相比传统的检测FRET信号需要对目标细胞处理后进行激光共聚焦拍摄,再对其荧光强度进行捕获后,使用复杂的公式计算出FRET信号,本研究的方法显得更加简便,避免了众多可变因素如荧光筛选、荧光基团的空间方位以及融合蛋白的分子质量大小等对FRET信号捕获的影响[20],并且不需要在昂贵的大型流式细胞仪中做检测[19],解决了大部分影响FRET技术发展的主要局限性问题。因此,本研究的成果促进了FACS-FRET技术的进一步发展,使得FACS-FRET技术的应用更加广泛。
值得注意的是,在本研究中还运用了激光共聚焦显微镜的方法对本实验结果进行验证,结果发现明确已知具有相互作用的p53蛋白和MDM2蛋白其共定位情况比较差,而没有相互作用的EGFP蛋白和mCherry蛋白却有非常好的共定位,与实际情况不符。这一结果说明使用激光共聚焦显微镜检测两个蛋白质是否具有共定位,从而推论其是否存在相互作用关系的方法也有一定的局限性和不准确性,容易出现假阴性和假阳性,并且只能检测单个细胞中两个蛋白质的相互作用情况,而对整个细胞群体的FRET信号检测无能为力。相比之下,FACS-FRET技术显得更准确,并且可以对整个细胞群体的FRET信号进行检测以及定量统计分析。然而,我们应该知道,要检测两个蛋白质是否有相互作用,应该结合多种方法进行检测和验证,并且需要进行生物学实验的验证,才能准确的下结论。
总之,FACS-FRET技术与现有的其他技术相比有着显著的优势,它可以在所有细胞群体甚至各种细胞组分中检测蛋白质之间的相互作用,并且是无创的、可以快速定量进行统计分析的。而本研究构建成功的新的FRET对荧光基团EGFP-mCherry,对FACS-FRET技术的发展起到一定的促进作用,改善了FACS-FRET技术在活细胞中鉴定蛋白质相互作用的应用前景。
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