2017, Vol. 37文章信息
- 胡昌武, 谢君, 朱乃硕.
- HU Chang-wu, XIE Jun, ZHU Nai-shuo.
- 7肽和12肽两种M13噬菌体展示库筛选肿瘤坏死因子alpha拮抗肽的比较
- Comparison of the Inhibitory Efficiency of M13 Based 7-mer and 12-mer Phage Display Libraries Derived Peptides as Tumor Necrosis Factor Alpha Antagonist
- 中国生物工程杂志, 2017, 37(5): 1-8
- China Biotechnology, 2017, 37(5): 1-8
- http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20170501
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文章历史
- 收稿日期: 2016-11-01
- 修回日期: 2017-02-08
肿瘤坏死因子alpha(tumor necrosis factor alpha, TNFα)最开始是在1975年由内毒素注射而诱导产生，被鉴定为可诱导移植到小鼠体内的肿瘤凋亡的血清活性因子，因此才被命名为肿瘤坏死因子。TNFα的主要来源是单核细胞和巨噬细胞，但是多种不同的免疫细胞或是非免疫细胞也能产生，包括T细胞、肥大细胞等[1]。TNFα有跨膜型和游离型两种结构，跨膜型TNFα的胞外部分能被基质金属蛋白酶(TACE)切割下来成为游离型，两种类型的TNFα都具备生物活性，而且发挥活性时均为同源三聚体的结构[2]。机体组织中低浓度的TNFα被认为是有益的，能诱发对感染、损伤等的抵抗反应，维持机体稳态；但是在高浓度的情况下，TNFα会诱导过于强烈的炎症反应从而导致器官损伤[3]。
TNFα的一些活动与多种疾病产生相似状况，如调节细胞招募、细胞分化、细胞死亡及免疫反应等，但是TNFα的某些特定活动结果甚至可以直接与一种特定的疾病联系起来。例如，风湿性关节炎(RA)表征：骨骼破坏、软骨降解及成纤维细胞增殖；银屑病(psoriasis)：角质细胞增殖、DC细胞迁移、T细胞增殖等[4]。这些现象均显示出TNFα作为治疗RA等炎症性自身免疫病的拮抗靶标的潜能，事实也证明使用anti-TNFα的抗体进行拮抗TNFα功能时能对其引发的病例状态产生缓解[5]，但是anti-TNFα抗体因其不良反应明显而使用受限，因单抗免疫原性强而产生的抗药物抗体，毫无疑问对药物的药代动力学及药效存在强烈的影响。但肽类药物因分子质量小而免疫原性低，与抗体类相比优点在于更少的激发免疫反应的可能、更强的组织器官渗透性、更低的生产成本、平均质量下更高的生物活性等[6]，与小分子类相比优点在于组织中累积少、更低的毒性、结构上更高的多样性、更好的特异性等[7]，因此肽类物是非常好的候选药物靶标。
噬菌体展示技术在药物发现中是一种强大的技术，特别是在发现并鉴定具有特定功能的分子配体上应用非常广泛[8]。高度多样性的随机肽表达库提供了更广的筛选范围，而表达于噬菌体表面的随机肽和DNA中随机肽的编码序列之间建立起了物理联系，更有利于对随机肽进行鉴定。利用噬菌体展示技术，选择不同长度的随机肽展示库以TNFα为靶标进行筛选，最终得到2条能显著抑制TNFα活性的拮抗肽，为TNFα拮抗肽药物的进一步开发奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料筛选所用的M13噬菌体展示库Ph.D.-7(7肽随机库)和Ph.D.-12(12肽随机肽)(均购自New England BioLabs)；Murine TNFα(Pepro Tech-达科为生物技术有限公司代理)；ER2738噬菌体受体菌(New England BioLabs试剂盒提供)；L929细胞系(朱乃硕实验室冻存)。
1.2 试剂和设备胰蛋白胨(Tryptone)和酵母提取物(Yeast extract)购自OXOID；IPTG和Xgal购自上海生工生物工程有限责任公司；牛血清白蛋白(BSA)购自上海生工生物工程有限责任公司；HRP-anti-M13单克隆抗体和HRP-anti-FITC单克隆抗体由New England BioLabs试剂盒提供；DMEM细胞高糖培养基购自Gibco；胎牛血清购自Gibco；BD流式细胞仪由复旦大学遗传工程国家重点实验室大型仪器平台提供。
1.3 方法 1.3.1 M13噬菌体展示库筛选TNFα结合肽Murine TNFα以10μg/ml的浓度溶解在0.1mol/L NaHCO3(pH=8.6) 中，150μl包被ELISA板过夜后以5mg/ml BSA溶液封闭2h，弃封闭液，0.1% TBST洗涤6次。试剂盒提供的噬菌体展示库(input library)稀释100倍后加100μl(1011pfu/ml)到包被孔中室温孵育60min，弃孔中溶液，0.1% TBST洗涤10次。加入100μl洗脱液[0.2mol/L Glycine-HCl(pH2.2)，1mg/ml BSA]，室温轻摇15min，吸出孔中溶液到新的EP管并加入15μl 1mol/L Tris-HCl(pH9.1) 进行中和，该溶液中为第1次筛选后的噬菌体。该噬菌体扩大培养后作为第2次筛选的input library，保持滴度为1011pfu/ml，以同样的方法进行第2次和第3次筛选，如果有必要则进行第4次筛选。
1.3.2 洗脱液中噬菌体滴度测定、扩大培养及DNA提取滴度测定：噬菌体洗脱液梯度稀释，10μl加入到200μl ER2738培养液中进行侵染，然后在3ml Top Agar中混匀并平铺到LB/IPTG/Xgal平板表面，37℃过夜培养观察噬菌斑。
扩大培养：噬菌体洗脱液加入到20ml ER2738培养物中培养4.5h，释放出的噬菌体在离心上清液中，加入20% PEG/2.5mol/L NaCl使噬菌体沉淀并进行离心分离可得到扩大培养后的噬菌体。
DNA提取及测序：对最后1轮筛选的洗脱噬菌体进行滴度测定，挑取20~30个克隆扩大培养后沉淀噬菌体，加入Iodide Buffer裂解，再用无水乙醇沉淀噬菌体DNA，70%乙醇(－20℃)清洗沉淀后以TE Buffer溶解并保存DNA。测序引物序列为5′-CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3′，测序公司为上海杰李生物技术有限公司。
1.3.3 ELISA检测Phage-TNFα结合TNFα包被ELISA孔，过夜孵育后BSA溶液4℃封闭2h，同时封闭对照孔。将表达已知肽序列的噬菌体以不同的稀释度加入到TNFα包被孔和BSA包被孔中，室温轻摇孵育2h，TBST清洗后加入HRP-anti-M13单克隆抗体，室温孵育1h后ABTS进行显色，读取OD410信号并进行对比。
1.3.4 ELISA检测Peptide-TNFα结合亲和性人工合成肽时除基本序列，另合成带FITC标记序列，合成公司为上海强耀生物科技有限公司。TNFα溶液过夜包被ELISA孔，5mg/ml BSA溶液4℃封闭2h，TBST清洗后加带FITC标记的不同稀释度的多肽，室温孵育2h后清洗，再加入HRP-anti-FITC单克隆抗体，以ABTS显色底物溶液进行显色，测定OD410值。以OD410为纵坐标，肽浓度为横坐标绘制饱和曲线并利用Graphpad Prism5.0计算解离常数Kd值(一半受体被配体结合时配体的浓度)。针对不同的多肽与TNFα结合的竞争问题，同样利用ELISA方法，在加入多肽时把多种多肽混合加入，并以不结合TNFα的无关多肽作为对照，观察不同多肽之间是否相互影响与TNFα的结合。
1.3.5 Insight Ⅱ分析筛选多肽与TNFα二聚体的对接使用Insight Ⅱ Building and Edit Protein模块构建多肽，然后使用ChARMm力场对它们的初始结构进行能量最小化和分子动力学模拟优化。蛋白质和多肽都采用charmm27力场。使用Insight Ⅱ商业软件包中的Zdock模块对接多肽和TNFα，对接后的模型使用Rdock进行优化，并使用analysis docked protein模块分析对接模型。如果有几个clusters满足要求，则尽量选择clusterⅠ中的对接模型，在此基础上尽量选择Zdockscore得分较高的对接作为最终的对接模型。
1.3.6 流式细胞法检测合成肽拮抗TNFα活性Murine TNFα能诱导L929细胞凋亡。6孔板中每孔加入2ml DMEM(10%FBS)培养基，其中含有4×105个L929细胞，37℃、5%CO2培养24h后加入不同浓度的TNFα诱导凋亡，6h后收细胞进行FITC-AnnexinV和PI双染，上机检测凋亡情况并找出合适的TNFα浓度。将TNFα和合成肽混合加入L929细胞培养基中，共孵育6h，FITC-AnnexinV和PI双染后上机检测，观察加入的合成肽对TNFα诱导的凋亡的影响。
2 结果 2.1 TNFα亲和肽筛选按照方法1.3.1和1.3.2所述，用7肽噬菌体展示库和12肽噬菌体展示库筛选与TNFα亲和的多肽序列。7肽库经过4轮筛选，挑取了28个克隆测序得到3个一致性强的多肽序列；12肽库经过3轮筛选，挑取26个克隆测序得到2个一致性强的多肽序列。筛选过程中噬菌体回收率逐渐提高，体现富集效果(表 1)。
| 噬菌 体库 |
筛选 轮数 |
输入噬菌体 (pfu/ml) |
洗脱噬菌体 (pfu/ml) |
回收率 |
| 7肽库 | 1 | 1×1011 | 4.1×105 | 4.1×10-6 |
| 2 | 1×109 | 1.5×104 | 1.5×10-5 | |
| 3 | 1×109 | 5.2×104 | 5.2×10-5 | |
| 4 | 1×109 | 1.8×105 | 1.8×10-4 | |
| 12肽库 | 1 | 1×1011 | 6.4×105 | 6.4×10-6 |
| 2 | 1×109 | 7.8×104 | 7.8×10-5 | |
| 3 | 1×109 | 3.9×105 | 3.9×10-4 |
为进一步缩小范围，进行Phage-TNFα吸附试验，结果如图 1所示。发现M-1、M-5和R-1与TNFα结合的能力最强，而R-10稍差、M-13最弱。因此在多肽合成时舍弃M-13中的多肽序列并重新编号，具体如表 2所示。
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| 图 1 不同编号噬菌体与TNFα结合试验 Figure 1 The binding between TNFα and the candidate phage |
| 肽 编号 |
对应phage 编号 |
Sequence(N→C) |
| 632 | M-1 | HYIDFRW-NH2 |
| 633 | M-1 | HYIDFRWGGGSK(FITC)-NH2 |
| 634 | M-5 | SLYRDYD -NH2 |
| 635 | M-5 | SLYRDYDGGGSK(FITC)-NH2 |
| 636 | R-1 | KASGSPSGFWPS-NH2 |
| 637 | R-1 | KASGSPSGFWPSGGGSK(FITC)-NH2 |
| 638 | R-10 | TLPAILQSSGTR -NH2 |
| 639 | R-10 | TLPAILQSSGTRGGGSK(FITC)-NH2 |
| 313 | 无关肽 | SMQYADHPVNTGGGGSK(FITC)-NH2 |
| 314 | 无关肽 | SMQYADHPVNTG-NH2 |
| 445 | 无关肽 | MFAKFWS-NH2 |
2.2 肽和TNFα亲和性检测
包被TNFα到ELISA板上，并使用不同梯度稀释的合成肽孵育后检测OD值，按1.3.4方法所示测定合成肽与TNFα结合的亲和性，结果如图 2所示。Kd值越小证明和TNFα的亲和性越高，从图 2中可看出7肽中亲和性最强的是633肽，Kd=138nmol/L；12肽中亲和性最强的的是637肽，Kd=8.594μmol/L。635肽和639肽亲和性较差。
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| 图 2 不同序列合成肽与TNFα结合的亲和性 Figure 2 Different peptides have different affinities for TNFα |
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| 图 3 7肽(633) 和12肽(637) 与TNFα竞争结合试验 Figure 3 he competitive binding test of 633peptide and 637peptide to TNFα |
为检测筛选出的7肽和12肽与TNFα结合是否具有竞争性，将633肽和637肽按各自与TNFα结合的饱和浓度进行混合，并且以无关肽作为对照，加入到到TNFα包被孔中共孵育，2h后加入HRP-anti-FITC单克隆抗体检测，发现当和无关肽313混合时，633肽或637肽的OD值不受影响，但是633肽和637肽混合时与637肽或637肽+313肽组相比OD值显著下降，显示出两种肽与TNFα结合存在竞争关系。下一步试验是用Insight Ⅱ软件分别分析7肽和12肽与TNFα二聚体的结合，对比两种长度的多肽在结合时空间结构差异及稳定性差异。
2.3 多肽结合TNFα二聚体的模型模拟首先构建HYIDFRW和KASGSPSGFWPS两条多肽序列的空间结构并通过能量最小化和分子动力学对它们分别优化(图 4)，优化后7肽的势能为－344.52kcal/mol，12肽的势能为－234.64kcal/mol，7肽明显比12肽的势能低，因此空间结构更加稳定，且从图 4中可看出两种多肽优化后结构存在差异。
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| 图 4 7肽(632) 和12肽(636) 优化后空间结构 Figure 4 The optimized spatial structure of the 632peptide and the 636peptide (a) The 632 peptide (b) The 636 peptide |
通过对接与优化，得到7肽与12肽与TNFα结合的对接模型(图 5)。选择出的模型中两种长度的肽都结合到TNFα二聚体的凹槽位置，而且进入凹槽的都是多肽序列C端侧链带有环状结构的氨基酸残基，由此可推断出环状氨基酸残基在结合TNFα二聚体时具有优势，这也为后期进一步筛选TNFα拮抗肽的氨基酸选择提供思路。虽然两肽均结合到TNFα二聚体的凹槽位，但是各自的走向不同(图 5)。7肽沿着二聚体之间的间隙伸展，而12肽横跨二聚体，这很可能是由于两者三维结构的大小差异导致的。计算它们结合TNFα后的能量，发现7肽为－264.73kcal/mol，12肽的为157.23kcal/mol，远高于7肽。与各自自由状态下的势能相比，12肽结合后势能明显增加，由－234.64kcal/mol上升到157.23kcal/mol，这说明即使最优化的12肽对接，12肽也不能稳定地结合TNFα作用位点，推测原因可能是由于12肽结构对于TNFα二聚体结合位点过大。而7肽相比自由状态，结合后能量由－344.52kcal/mol增加到－264.73kcal/mol，增加不多，说明这种结合比较稳定。
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| 图 5 7肽(632) 和12肽(636) 与TNFα二聚体结合模型 Figure 5 The simulation model of the 632 peptide and the 636 peptide binding to TNFα dimer (a) The 632 peptide was extended along the groove on the combined surface (b) The 636 peptide bound across the groove on the combined surface and its N-terminal residues presented a free state |
AnnexinV能特异性地指示出细胞凋亡，在和PI共染细胞时能通过流式细胞法分辨出活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。为证明TNFα是否能诱导L929细胞的凋亡，并且摸索合适的诱导浓度，按照1.3.5的试验方法检测发现TNFα能诱导L929细胞的凋亡(图 6)，而且诱导效果随着TNFα浓度的逐渐升高而增强，最高在6孔板中每孔40ng时细胞凋亡率为59.2%、存活率为17.1%。合成肽与TNFα混合加入细胞培养孔时，保持TNFα量为40ng，设置肽加入量梯度，结果发现随着肽加入量的增加，对TNFα活性的抑制效果不断加强，细胞存活率不断升高[图 7(a)，图 8(a)]。在每孔加入肽量为5μg时，作为无关肽对照的445肽和314肽对L929细胞存活率的影响非常小，但632肽使L929细胞的存活率上升到50.5%，上升了2倍，而在同样的条件下，636肽只上升到39.2%[图 7(b)，图 8(b)]，证明632肽比636肽有更强的TNFα拮抗功能。
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| 图 6 TNFα诱导的L929细胞凋亡 Figure 6 The apoptosis of L929 induced by TNFα |
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| 图 7 632肽抑制TNFα活性 Figure 7 The antagonistic action of 632 peptide on TNFα (a) The inhibitory effect of different 632 peptide concentrations on TNFα (b) The apoptosis of different cell groups confirmed by flow cytometry |
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| 图 8 636肽抑制TNFα活性 Figure 8 The antagonistic action of 636 peptide on TNFα (a) The inhibitory effect of different 636 peptide concentrations on TNFα (b) The apoptosis of different cell groups confirmed by flow cytometry |
噬菌体展示技术中一个DNA库融合进入了噬菌体基因组中，在侵染和复制的过程中新出现的噬菌体表面表达了DNA库编码的peptide序列，每一个单独的DNA序列只编码一段peptide，而且这段peptide只表达在一个噬菌体的表面，这样，每一个噬菌体都保证了其携带的插入DNA序列与该DNA表达的peptide之间的物理联系。展示库和固定后的靶分子共孵育，能够结合靶分子的噬菌体留在靶标表面，不能结合的噬菌体被洗掉，起到对亲和噬菌体的富集作用，第一轮筛选的洗脱液扩大培养后作为第二轮的input phage，经过第一轮的富集后扩大培养时亲和性噬菌体在input phage中所占的比例大幅上升，所以第二轮筛选的基础的建立在第一轮亲和噬菌体的筛选上。本文使用了7肽长度和12肽长度的两种噬菌体展示库，经过前3轮的筛选，洗脱液滴度测定的克隆挑选后测序很有可能无法得到一致性强的某一个或某两个序列。例如，7肽库筛选时就因第3轮结果不理想而进行第4轮筛选，其结果中HYIDFRW所占比例相对较高，4/28；12肽库筛选则相反，3轮筛选后测序结果中KASGSPSGFWPS所占比例达到18/26。而亲和性试验却证明HYIDFRW和TNFα的亲和性比K-S高，说明测序结果的一致性并不能完全代表亲和性的高低。TNFα能发挥生物学活性的结构是同源三聚体[9]，因此在计算机模拟结合模型时使用筛选肽序列和TNFα二聚体，模拟结果说明7肽结合更加稳定，是对其亲和性比12肽更高的有力佐证。而细胞试验证实，亲和性更高、结合TNFα稳定性更强的HYIDFRW序列比KASGSPSGFWPS有更强的拮抗TNFα功能，说明7肽比12肽更加适合作为TNFα拮抗肽。
目前已使用噬菌体展示法筛选多个靶标，如红细胞生成素受体(EpoR)的激动剂，筛选出肽序列后进行修饰成药，在临床试验中可改善患者的贫血状况并维持血红蛋白水平[10]。肽直接成药虽然存在一些缺点，如口服性差和半衰期短[11]，但是与抗体类和小分子类相比具有非常明显的优势。而针对peptide存在的缺陷可以通过修饰来改善，已有事实证明这些修饰及修饰后的peptide在成药上是可能的。本研究证实7肽比12肽更加适合作为TNFα拮抗肽，为TNFα拮抗肽药物的进一步开发奠定基础。
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