中国生物工程杂志  2017, Vol. 37 Issue (3): 115-123 |
表1(Table 1)
分子诊断是当代医学发展的重要前沿领域之一，是指利用核酸或蛋白质作为生物靶标进行临床检测的诊断技术, 为疾病的预测、诊断、预防、治疗、预后和转归提供了信息和决策依据[1]。分子诊断目前广泛用于现场诊断、床旁诊断、同伴诊断、个体化医疗诊断等。全自动化集成式的分子诊断系统可以实现“样品进-结果出”的直接过程，样品的制备、扩增放大和检测均由系统自动完成，操作人员仅需用移液器加入原始未经处理的样品，无需人工干预。自动分子诊断系统操作简单、无需专业人员操作。核酸诊断是用分子生物学的理论和技术，通过直接探查核酸序列的存在或变化，从而对人体状态与疾病做出诊断的方法。它的目标分子是DNA或RNA，检测的基因有内源性 (机体自身的基因) 和外源性 (如病毒、细菌等)，前者用于诊断基因有无变异，后者用于诊断有无病原体感染。如今，面对各种新发突发性传染病时最经济有效的防控措施就是建立快速、准确的核酸分子诊断方法。目前，全自动化集成式的分子诊断系统的发展趋势为小型化、便携化、微量化和一体化[2]。新型分子诊断系统方便携带，可用于现场检测，无需将样品从疫情暴发地区带回中心实验室检测，方便快捷；无需提供大体积的样品，仅需痕量样品就可检测病原体；全封闭式的自动化处理过程，减少人为干预，省时省力，避免交叉污染，保护操作人员自身安全，对环境污染最小。具备了上述优点，全自动化集成式分子诊断系统在疾病预防、疾病诊断、法医鉴定、食品安全、公共卫生等方面发挥着越来越重要的作用。
1 分子诊断的原理分子诊断的核心技术是基因诊断，主要技术有核酸分子杂交、聚合酶链反应和生物芯片等技术。回顾分子诊断研究20余年的发展历史, 大致经历了3个阶段: ①利用DNA分子杂交技术进行遗传病的基因诊断; ②以PCR技术为基础的DNA和RNA检测, 特别是实时定量PCR的应用, 不仅可以检测存在于宿主的多种DNA和RNA病原体载量, 还可检测多基因遗传病细胞中mRNA的表达量; ③以生物芯片 (biochip) 技术为代表的高通量密集型检测技术, 生物芯片技术包括基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片等, 由于其工作原理和结果处理过程突破了传统的检测方法, 不仅具有样品处理能力强、用途广泛、自动化程度高等特点, 而且具有广阔的应用前景和商业价值, 因此成为分子诊断技术领域的一大热点[3]。
(1) 核酸分子杂交技术。具有一定互补序列的核苷酸单链靶标和探针在液相或固相中按碱基互补配对原则缔合成异质双链的过程，称为核酸分子杂交。杂交的双方是待测核酸序列和探针序列。应用该技术可对特定DNA或RNA序列进行定性或定量检测。
(2) 聚合酶链反应 (polymerase chain reaction，PCR)。PCR是模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷三磷酸 (dNTP) 在DNA聚合酶作用下发生酶促聚合反应，扩增出所需目的DNA。包括三个基本步骤：双链DNA模板加热变性成单链 (变性)；在低温下引物与单链DNA互补配对 (退火)；在适宜温度下TaqDNA聚合酶催化引物沿着模板DNA延伸[4]。
(3) 生物芯片技术是近年发展起来的分子生物学与微电子技术相结合的核酸检测分析技术。最初生物芯片技术的主要目标是用于DNA序列测定、基因表达谱鉴定和基因突变体检测和分析，所以又称为DNA芯片或基因芯片技术。由于目前这一技术已扩展至免疫反应、受体结合等非核酸领域，出现了蛋白质芯片、免疫芯片、细胞芯片、组织芯片等，所以改称为生物芯片技术更符合发展趋势。
2 分子诊断系统发展现状国际上很多公司都在积极进行着全自动化集成式的分子诊断系统的开发和研究。全自动化集成式的分子诊断系统主要包括样本采集、样品处理 (细胞浓缩、细胞破碎)、核酸提取 (DNA/RNA分离)、基因扩增 (PCR)、扩增子检测 (实时荧光定量) 等全部检测过程。表 1中列出了国内外全自动分子诊断系统主要厂商及产品，下面做详细介绍。
| 公司 | 代表性产品 |
| Cephied (www.cepheid.com) | GeneXpert |
| iCubate (www.iCubate.com) | iCubate |
| IntegenX (http://integenx.com) | RapidHITTM 200 |
| Caliper Life Sciences (http://www.caliperls.com) | LabChip® Systems |
| Rheonix (http://www.rheonix.com/) | EncompassMDx (Rheonix CARD®) |
| Idaho Technology (www.idahotech.com) | FilmArray |
| Nanosphere (www.nanosphere.us) | Verigene System |
| Gen-Probe (http://www.gen-probe.com) | Panther MDx Platform |
| GenturaDX (http://genturadx.com) | IDbox |
| Diagenetix (http://diagenetix.com/) | Smart-DARTTM Platform |
Cephied公司的GeneXpert快速检测系统是世界上第一个整合全自动样品制备和检测程序的实时定量PCR仪。使用者直接加入采样样品，GeneXpert自动完成样品裂解、核酸纯化浓缩、定量PCR扩增检测，并输出分析结果，整个过程只需要30min。
GeneXpert的样品制备系统采用Cepheid获准专利的完备独立的反应盒 (cartridge)[5]。盒体包含多达11个分离试剂室和1个废液室 (图 1)。这个反应盒内设计了一个专利超声装置 (sonic horn)，用于破碎原始样品使内含的DNA释放, 然后通过内置滤膜捕获超声处理的和PCR分析的靶目标DNA[6]。
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| 图 1 GeneXpert的反应盒 Figure 1 The cartridge of GeneXpert |
另外一个技术关键是PCR微珠试剂的设计。Cepheid公司的试剂盒则是将酶、脱氧三磷酸核苷 (dNTPs)、缓冲液 (buffer) 等全部浓缩在一个微珠中；而基因特异性引物、荧光探针、内参则包含于另一个微珠中 (最多可容4对引物和4条探针以进行多重qPCR)。稳定、冻干PCR试剂在正常室温中保持稳定，独特的微珠试剂设计也便于精确操作、避免产生误差和交叉污染。
与传统定量PCR仪96孔板的设计不同，GeneXpert的PCR反应系统采用I-CORE模块的设计，每个样品槽都集成有自己独立的加热/冷却系统以及光学信号激发与检测系统，每个模块都可以独立的操控和运行。独一无二的独立设计使得模块反应之间互不干扰，消除了“边缘效应”和传统96孔板中孔与孔之间“不一致性”，可同时进行多个反应程序不同的定量反应，并且每个样品槽独立的4~6通道荧光激发检测系统，扩展了应用空间。根据用户的需求可以配备从1个模块到16个模块、32个模块，而最新推出的GeneXpert Infinity 48 PCR仪可以配备多达48个模块。
目前，该平台上开发的Xpert MTB/RIF、Xpert CT/NG等产品已通过美国食品药品管理局 (FDA) 批准，分别用于结核分枝杆菌复合群 (MTB复合群) 和沙眼衣原体 (CT)、淋球菌 (NG)、人类免疫缺陷病毒 (HIV)、人乳头瘤病毒 (HPV) 及埃博拉病毒的分子诊断[7-12]。
2.2 iCubate美国iCubate公司的iCubate生物技术平台是基于扩增于拯救多重PCR (amplicon rescued multiplex PCR, arm-PCR) 多重扩增专利技术的核酸扩增和iCubate分子鉴别诊断系统 (iCubate4000全自动全封闭多靶点核酸扩增检测仪系统)。该系统包括一个卡盒 (cassette)、一个卡盒处理仪 (cassette processor)、一个卡盒阅读仪 (cassette reader), 预先安装好独家应用软件的iMAC计算机系统控制、样品管理和数据分析软件。遍布整个系统内外的条码阅读器跟踪识别标本排除误差。
该系统的核心技术是arm-PCR，arm-PCR技术首先采用特异性引物扩增富集模板，然后通过高浓度引物“拯救”出扩增子，最后通过共用引物来扩增目的片段 (图 2)。其优点是整个反应体系在指数增长期使用共用引物进行扩增，使得同一反应体系内多个目标基因可以同时进行高效扩增，在一份样品中最多可同时检测50种目标分子的基础上，还可以得到半定量的检测结果。因此，arm-PCR技术具有较好的多靶点检测能力，适合于病原体识别、药敏检测等实际应用。
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| 图 2 arm-PCR反应原理 Figure 2 Reaction of arm-PCR |
iCubate卡盒 (cassette) 仅有手掌大小，内部预先装配了核酸提取、PCR反应和杂交检测等所有必需的试剂 (图 3)。其中，试剂预装在卡盒底部的试剂槽里，用锡箔纸封存。卡盒通过外部机械运转控制液体在不同试剂槽之间的转移，实现操作自动化，避免了人为操作导致的试验结果偏差。使用时，把标本从卡盒上面的开口加入卡盒底部的PCR反应孔，把卡盒放入处理仪，由系统自动完成核酸提取、扩增和检测。卡盒底部还有废物槽，保存所有用过的液体，包括杂交后的PCR产物。卡盒采用一次性全封闭设计确保整个检测过程密闭操作，有效避免PCR产物污染实验室环境导致的假阳性问题。
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| 图 3 iCubate卡盒 Figure 3 The cassette of iCubate |
iCubate的卡盒处理仪 (cassette processer) 里有三个独立控制的加热器，应用“转换恒温加热头”扩增技术，减少加热块升降温所消耗的时间，加快核酸扩增和杂交反应速率。PCR反应完成后，卡盒内部的移液器把所有产物都放到底部有玻璃芯片的杂交检测槽进行杂交，15min杂交后由移液器完成快速清洗，再由实验员把卡盒从处理仪中取出放至阅读仪。1台处理仪可同时检测1~4个样品，最多可串联24台仪器同时检测96个样品。iCubate的卡盒阅读仪 (cassette reader) 里有激光管和光电倍增管 (PMT) 等检测装置，应用“转盘”式激光共聚焦扫描系统，1min内在每个检测位点上读取250个数据，单点多次扫描重复性误差 < 5%，兼顾到检测效率和精确度。
目前，该平台已开发出检测革兰氏阳性菌、呼吸道病毒、消化道传染病菌、分枝杆菌等多种检测卡盒[13]。
2.3 IntegenX RapidHITTM 200加拿大IntegenX公司的RapidHITTM 200(Apollo 200) 是基于STR的DNA人类鉴别 (human identification，HID) 的“样品-结果”全自动系统。该系统基于集成的公司专利技术和快速内部微流控芯片原型。RapidHITTM 200集成所有样品操作步骤，包括口腔拭子或血液样品处理、细胞裂解、DNA提取、扩增、分离和检测等环节。该系统利用磁珠来浓缩和纯化靶分子，使用Promega公司的PowerPlex®成品试剂快速PCR，其核心是MOVeTM(microscale on-chip valve，微型芯片内阀) 流体的集成技术，MOVe是一个气动隔膜泵，阀门可以通过空气压力关闭并通过真空打开 (图 4)。IntegenX开发了内部专有的键合过程中的塑料原型，以提供廉价的一次性设备和可编程流体电路制造相结合的快速移动的技术组合[14]。
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| 图 4 MOVeTM微型芯片内阀 Figure 4 Microscale on-chip valve (MOVeTM) |
美国Caliper生命科学公司 (已被珀金埃尔默公司PerkinElmer收购) 是芯片实验室技术的领导者。LabChip® Systems的设计是基于芯片实验室 (lab-on-chip) 技术，在一块小的微流控芯片上进行电泳，试剂预先装载在芯片上独立的孔中，这些孔大约只有人类头发大小，连接到带有微小通道的石英蚀刻的小板中 (图 5)。当芯片装入LabChip GX系统时，孔与铂电极提供电压和电流控制相接，系统机器人直接移动芯片微升板毛细管孔下方的“吸管”，将大约150nl的样品吸入芯片中，施加电压进行电泳分离，并通过激光诱导荧光检测。LabChip可以从96孔板和384孔板中自动取样，可用于分析DNA、RNA及蛋白质，在短短几个小时内完成数百个样品的分析，样品不需要进一步处理。
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| 图 5 LabChip®检测分析系统 Figure 5 LabChip® systems of caliper Life sciences |
美国Rheonix公司的EncompassMDx分子诊断系统以及创新的CARDTM微流控技术为人类和兽医的体外诊断提供了一个全自动化的分子诊断平台。EncompassMDx分子诊断系统可应用于感染性疾病的检测到基因型分析、多核苷酸多态性 (SNPs) 分析，也可用于床旁诊断 (POC)，包括EncompassMDx工作站 (图 6) 和EncompassMDx便携式控制器 (图 7) 两种。Rheonix EncompassMDxTM工作站 (图 8) 可以同时运行6个CARD卡盒，多达12个独立的样本。可以避免遗留物和交叉污染。
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| 图 6 Rheonix CARDTM卡盒 Figure 6 Rheonix Quad CARDTM |
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| 图 7 EncompassMDxTM便携式控制器 Figure 7 The portable controller of EncompassMDxTM |
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| 图 8 EncompassMDxTM工作站 Figure 8 EncompassMDxTM workstation |
Rheonix CARD®包括所有的微通道、泵、阀、试剂和反应储液池，以及一个执行所有样品制备、分析和读取功能所必需的DNA微阵列组成，自动完成细胞裂解、分离和纯化基因组DNA、执行多重PCR反应以及最后在集成的DNA阵列中检测扩增子得到结果。CARD系统从样品引入到读取结果，自动化完成全部试验大约需要3h，可以自动检测多个单核苷酸多态性 (SNPs)，以全血或口腔拭子样品预测各种治疗药物反应，用于早期发现疾病、疾病的演化和预测患者的反应，以及具体治疗方法的个性化医疗的预后[15]。
2.6 Idaho Technology FilmArray由美国Idaho Technology公司推出的FilmArray是一款简化的分子检测技术产品，可以在一个封闭的体系中, 完全自动化地完成样品的提取、扩增、检测和分析 (图 9)。FilmArray试剂卡盒 (pouch) 储存所有必需的试剂，包括样品制备、逆转录PCR、PCR和检测，所有试剂均以冰冻干燥的形式储存，操作者只需将未处理的样品和水化溶液注射入卡槽中，FilmArray仪器完成余下的工作。首先，FilmArray从未经处理的样品中提取和纯化所有核酸，随后执行一个巢式多重PCR，使用终点溶解曲线数据，FilmArray软件为每个靶目标自动生成一个结果。多重qPCR是将几个PCR分析合在一起，同时扩增并独立检测目标，它在提高通量的同时也节省了样品。该系统检测一份样品可在不到1h内获得结果，实际动手操作时间只有5min，能够快速检测1份样品中的100多种物质。
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| 图 9 Idaho Technology公司的FilmArray系统 Figure 9 FilmArray system of Idaho Technology |
Idaho Technology用来解决多重扩增的方法是分步用巢式引物来做扩增。虽然巢式引物解决了背景高的问题，但是不能解决靶点之间的不兼容问题。另外，提高该系统的通量也有局限性，一个仪器一次只能做一个标本。
2.7 Nanosphere Verigene System美国伊利诺州从事分子诊断技术的Nanospher公司开发了一个核酸和蛋白质诊断系统Verigene。Verigene系统的核心技术是纳米金颗粒技术检测，比荧光检测更敏感，该系统获得FDA批准用于抗凝药华发林 (warfarin) 的代谢检测[16]。
Verigene®系统仪器由Verigene阅读器和一个或多个处理器组成。Verigene处理器SP是一个模块化、易于使用的台式分析仪，结合自动核酸提取、纯化、扩增和杂交，对每个独立模块高精确度，样品到结果的检测过程 (图 10)。Verigene读取器可以管理样品信息，从处理卡盘中读取结果，并允许结果打印，内部数据存储，与LIS (实验室信息系统) 具有连通性，无需外部PC。因为一个Verigene读取器能控制多个处理器，通量能按每个实验室的要求调整大小。虽然Nanosphere公司声称检测可以摆脱扩增步骤直接对靶基因进行检测，但由于未经处理的原始临床标本背景复杂，信噪比较高。
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| 图 10 Nanospher公司的Verigene处理器 Figure 10 Verigene processors of Nanospher |
美国Gen-Probe公司推出的PANTHER MDx Platform可以全自动化包括样品制备、扩增、检测和结果报告的所有分子诊断过程，具有双向主机界面、单管多重检测、样品定位识别、终点和实时转录介导扩增 (TMA) 实验、随机存取、易于操作等特性 (图 11)。
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| 图 11 PANTHER MDx Platform系统 Figure 11 PANTHER MDx Platform |
Gen-Probe公司的PANTHER系统拥有许多核心专利技术，包括DNA提取、捕获靶目标、转录介导扩增 (TMA)、杂交保护试验、荧光ARMS技术、RT-PCR以及QF-PCR等。其中，DNA提取采用的是Nucleon®的一种专利技术，分离DNA是通过分区连续的过程，不像许多其他的DNA纯化技术，Nucleon®可从包括全血、细胞培养、硬/软组织、老鼠尾巴和植物材等广泛的样本中提供高产量、高质量的DNA，而且DNA提取过程中不使用苯酚，最大限度地减少危险废物处理成本。转录介导扩增技术 (transcription mediated amplification, TMA) 可以RNA或DNA为模板，利用RNA聚合酶在约42℃等温反应条件下进行扩增，产物为RNA。该技术在每一循环可产生模板的100~1 000个拷贝转录本，15~30min可将模板扩增约1010倍[17], 该技术的核心产品APTIMA试剂，检测沙眼衣原体和淋病奈瑟氏菌，以及供体血液中的HIV-1、HCV和HBV病毒，已获得FDA认可[18]。
PANTHER系统全自动化程度较高，允许一个操作员在8h内处理275个样品，时间不到1h。对于大客户，PANTHER可以自动运行，并在12h内处理500个样本。但需要专门耗材和试剂，仪器体积庞大，便携性不佳，不适宜现场大批量检测。
2.9 GenturaDx IDbox由两位华裔工程师Steve Yu和Jesus Ching创建的总部位于美国加利福尼亚州的GenturaDx公司 (原名ProgenTech，已于2012年7月9日被Luminex公司收购) 于2010年11月推出了其全自动分子诊断平台IDbox。该系统采用全封闭、一次性的卡盒 (cassette) 来进行分子诊断 (图 12)，其专利的卡盘 (cartridge) 设计实现了样品提取、扩增和检测的全自动化，同时减少手动操作时间及样品处理步骤。IDbox系统易于操作，仅需操作人员加入样品，并将卡盒插入机器，仅仅按下“play”按钮即可离开。此外，系统提供随机存取/批处理形式，让客户最多能够同时运行12个患者样品的分析。IDbox设计成小巧紧凑的台式机，仅占0.5m2(22平方英寸)，充分利用实验室的空间。
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| 图 12 IDbox卡盒 Figure 12 The cassette of IDbox |
IDboxTM使用基于磁珠的核酸提取和纯化法，允许许多复杂样本的检测。实时定量PCR实验基于一步法逆转录PCR[19]。虽然IDbox是小巧紧凑的台式机，但是需要使用独家专利的卡盒，增加检测成本。而且一个卡槽装一个样品，一台机器装6排卡槽，难于达到较高通量。
2.10 Diagenetix Smart-DARTTM美国Diagenetix公司的Smart-DARTTM平台 (图 13)，是可移动的、精确的、基于基因 (分子) 诊断的检测平台，是一个简单的手持仪器[20]。与传统的PCR技术为基础的方法不同，Smart-DARTTM分子诊断平台使用环介导等温扩增方法 (loop-mediated isothermal amplification，LAMP)[21]，该方法是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶 (Bst DNA polymerase) 的作用，等温 (60~65℃) 条件下扩增，快速进行核酸扩增的方法。可以在1h内，将靶序列片段扩增109~1010倍。具有特异性强、灵敏度高、快速、准确和操作简单等优点。该仪器能够实时检测PCR管中的LAMP反应，是简单、低耗电、无需复杂自定义、微型化一次性的手持设备。但它没有样品处理，不是全自动化分子诊断系统。
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| 图 13 Smart-DARTTM手持设备 Figure 13 The handheld device of Smart-DARTTM |
随着人们对精准医疗的重视和疫情快速诊断的需要，国际上许多科研机构和公司都在积极研制全自动化分子诊断系统。该领域的发展趋势是采用微流控芯片，无需卡盒或卡槽，直接注射入样品，短时间内就会出检测结果。
Focke等[22]开发出Lab-on-a-Foil系统，可在一个灵活的膜上进行微流体检测。Mohammed和Desmulliez[23]基于芯片实验室 (lab-on-a-chip) 研发出用于心脏标志物检测的免疫传感器。Xu等[24]提出了一个多合一 (all-in-one) 的样品制备卡盒和实时PCR快速检测的自动化分子诊断系统。多合一系统由聚合物卡盘、微型热循环仪、检测实时逆转录聚合酶链反应 (RRT-PCR) 的一色三室荧光检测器和一个气动流体递送单元 (包括两个阀组和两个气动泵) 组成。试剂预先装在全封闭一次性卡盘中，操作者只需用移液器吸取样品和裂解缓冲液加入卡盘中，系统自动运行，样品制备和诊断在2.5h内完成。
Hurth等[25]研制出应用于人类STR鉴定的全自动化诊断仪器。Du等[26]研究出SlipChip。SlipChip是微流控芯片，主要结构是紧密接触的两个板，实施多个微流控动作而无需泵和阀。底板上预装了多种试剂，样品被加入微流体路径后，滑动顶板，液体流动填充孔和管道，完成提取和扩增反应。
密歇根州立大学的Stedtfeld等[27]开发microRNA的诊断装置——Gene-Z，使用一次性、无阀的聚合物微流控芯片。该芯片包括4个阵列上的15个反应孔，可同时检测4个样品。Gene-Z的操作使用iPod Touch进行接收数据和自动化分析，并通过Wi-Fi接口输出报告。美国伯克利大学Berkeley的Scherer等[28]设计和研制出一个高性能微芯片毛细管阵列电泳的便携式扫描仪。Liu等[29]开发出用于法医人类鉴定的集成式DNA纯化、PCR和样品净化的毛细管电泳微芯片，可用于短串联重复序列 (short tandem repeat, STR) 的分析。
近10年，高通量测序技术 (NGS) 的迅速发展，开发出了一系列测序平台。例如，Illumina公司的MiSeq和HiSeq平台系列，Life Technologies (已被Thermo Fisher收购) 发布的Ion PGM和Ion Proton测序仪, PacificBiosciences推出的PacBio RS第三代测序仪以及英国Oxford Nanopore公司的MinION纳米孔测序仪等[30]。但由于测序常需要较复杂的核酸提取、文库建立等前处理步骤，尚未出现全自动一体化测序产品。相信随着生物学、材料学和半导体技术的发展，必将出现快速、廉价、自动化的的测序仪, 引领我们开辟新病原发现、疾病诊断及个性化 (个体化) 医疗等新领域。
4 结语全自动化集成式的分子诊断系统具有自动、封闭、快速、灵敏等技术特点，无需高水平的实验室条件、复杂的实验步骤和有经验的操作者，将极大地降低成本，提高检测效率，不仅可用于病原体筛查、院内感染监测、环境监测、检验检疫、食品卫生检验，还适用于遗传病基因突变检测、mRNA和miRNA表达图谱研究、免疫组织化学多样性分析等诸多领域，应用场所也将从如今的中心实验室普及至检测现场，将成为未来临床诊断和科技应用的重要发展趋势。随着传染病的频繁暴发及精准医学的发展，分子检测技术将迎来新一轮产业革命，未来将有越来越多的全自动分子诊断相关技术和产品涌现，为提高人民的健康水平服务。
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