中国生物工程杂志  2017, Vol. 37 Issue (3): 65-72 |
表1(Table 1)
表2(Table 2)
表3(Table 3)
必特螺旋霉素 (Bitespiramycin, BT，原名生技霉素，药品注册名可利霉素) 是利用基因工程技术，将耐热链霉菌 (Streptomyces thermotolerans) 的4″-异戊酰基转移酶基因 (4″-isovaleryltransferase gene，ist) 导入到螺旋霉素产生菌 (S. spiramyceticus) 中进行表达，所产生的发酵产物[1]。BT是多组分药物，是以异戊酰螺旋霉素 (简称为埃莎霉素)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三个组分为主成分，还含有其他酰化螺旋霉素的小组分。BT具有较高的亲脂性，口服吸收快，组织渗透性强，分布广，体内维持时间长，有较好的抗生素后效应[2-4]。已完成的三期临床试验研究结果证实，BT具有良好的疗效和安全性。埃莎霉素Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的区别是在其16元内酯环3位上具有不同的修饰基团，3位上是羟基的为埃莎霉素Ⅰ，对3-OH进行乙酰化和丙酰化修饰分别产生埃莎霉素Ⅱ和Ⅲ。3-OH的酰基化由3-O-酰基转移酶 (3-O-acyltransferase) 进行催化[5]，此酶对底物的选择具有一定的宽容性，对乙酰基和丙酰基底物都能识别。
研究表明，埃莎霉素Ⅰ的抗菌活性与BT多组分的混合物没有显著差异，因此埃莎霉素Ⅰ可以单独成药，这样可以降低药物质控成本，而且可以做成注射剂型。我们在BT产生菌WSJ-1中阻断3-O-酰基转移酶基因 (sspA) 成功构建了只产生埃莎霉素Ⅰ组分的菌种WSJ-2[6-7]，但其埃莎霉素Ⅰ的产量较低，只有280μg/ml左右，不利于规模化生产。
在链霉菌中经常通过改造调节基因来提高抗生素产量[8]，特别是通过提高特异性正调控基因的表达来提高目标化合物的产量。例如，天蓝色链霉菌 (S. coelicolor) 中放线紫红素生物合成调控蛋白ActⅡ-4和十一烷基灵菌红素合成调控蛋白RedD [9]，匹马菌素产生菌S. natalensis中的PimR [10]。还有些异源调控基因也能提高次级代谢产物的产量。例如，来源于S. platensis NRRL 18993的mgsA或者Streptomyces sp. YIM56141的chxA基因高表达可以提高S. amphibiosporus中lactimidomycin的产量[11]。
已知来源于耐热链霉菌的4″-异戊酰基转移酶基因 (ist) 与调节基因acyB2连锁，调节基因的存在可以激活ist基因的表达。研究证实，包含ist和其正调控基因acyB2的变铅青链霉菌可以将67%~79%外源添加的泰洛菌素转化为4″-异戊酰泰洛菌素，而仅含有单个ist或ist与不完整的acyB2基因的变铅青链霉菌，对泰洛菌素的转化率仅为0%~2.4% [12-13]，说明acyB2对ist基因表达具有正调控作用。经同源比较，acyB2与生二素链霉菌 (S. ambofaciens ATCC 23877) 的srm40[14]序列的一致性为69%，与泰洛菌素产生菌 (S. fradiae) 中的调控蛋白TylR[15]的一致性为41%，它们均具有DDE转座酶保守结构域 (DDE transposase conserved domain)；但经过分析这些同源蛋白没有明显的DNA结合结构域，因此这些调节蛋白调控靶基因的机制还未见报道。Srm40和TylR已证实为正调控蛋白，它们分别参与S. ambofaciens ATCC 23877和S. fradiae中螺旋霉素及泰洛菌素生物合成的调控[16-17]。
本研究拟利用调节基因acyB2激活ist基因表达的特点，改造菌种WSJ-2，将acyB2和ist基因连锁导入WSJ-2菌株中，通过提高ist基因的表达量来提高埃莎霉素Ⅰ的产量。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种、基因和载体埃莎霉素Ⅰ产生菌WSJ-2(S. spiramyceticus WSJ-2)：BT基因工程菌 (WSJ-1)3-O-酰基转移酶基因 (sspA) 阻断变株，本实验室构建[6]；耐热链霉菌 (S. thermotolerans CGMCC4.1501)，用于调节基因acyB2的PCR扩增，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提供；E. coli DH5α：基因克隆和重组质粒构建受体菌；E. coli ET 12567：甲基化缺陷型大肠杆菌，用于重组质粒去甲基化；枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis CPCC 100029)：用于工程菌发酵产物的活性检测，本实验室保存。埃莎霉素Ⅰ产生菌 (WSJ-IA)：含ist-acyB2连锁基因的WSJ-2，本研究构建。含ist基因和部分acyB2基因的片段来自于pSW4重组质粒[1]；pBluescript Ⅱ SK (+)：大肠杆菌克隆载体，含氨苄青霉素 (ampicillin，Amp) 抗性基因bla，购自Merck公司；pSET152：大肠杆菌-链霉菌穿梭型整合载体，含阿普拉霉素 (apramycin，Am) 抗性基因aac (3)Ⅳ，能通过噬菌体φ31的attP位点 (phage attachment site) 特异性整合到链霉菌染色体上[18]，用于构建重组质粒，本实验室保存；pBSK-ia质粒：含ist-acyB2连锁基因的pBluescript Ⅱ SK (+) 重组质粒，本研究构建。pSET152-ia质粒：含ist-acyB2连锁基因的pSET152重组质粒，本研究构建。ET12567(pSET152-ia)：含pSET152-ia质粒的E. coli ET12567，本研究构建。
1.1.2 试剂氨苄青霉素 (ampicillin，Amp)，阿普拉霉素 (apramycin，Am) 购自武汉远城科技发展有限公司。螺旋霉素Ⅰ(spiramycin Ⅰ，SP Ⅰ) 和埃莎霉素Ⅰ(isomycinⅠ) 对照品，沈阳同联集团有限公司提供。链霉菌基因组快速提取试剂盒，购自广州东盛生物科技有限公司。限制性内切核酸酶，RNA提取试剂盒购自Qiagen公司 (德国)，LA-Taq DNA聚合酶 (附带2×GC Buffer Ⅰ)，SYBR Premix ExTaq TM (Perfect Real Time) 荧光染料，均购自宝生物工程 (大连) 有限公司。
1.1.3 培养基R2YE培养基按参考文献[19]配制，用于S. spiramyceticus WSJ-2原生质体的制备和再生，S. spiramyceticus WSJ-2及WSJ-IA斜面、种子、发酵和生物检定培养基均按参考文献[20]配制。
用于培养菌丝提取RNA的可溶性发酵培养基 (g/L)：可溶性淀粉50.0，葡萄糖5.0，酵母提取物5.0，KH2PO4 10.0，K2HPO4·3H2O 7.0，NaCl 10.0，MgSO4·7H2O 1.0，NH4NO3 6.0，鱼粉20.0。将可溶性发酵培养基煮沸，在4℃静置过夜，4 000r/min离心15min取上清液，每500ml三角瓶中分装50 mL培养基。
1.2 方法 1.2.1 分子克隆链霉菌总DNA的提取参照文献[19]进行。大肠埃希菌DH5α与大肠杆菌ET12567感受态细胞的制备，PCR产物纯化，限制性酶切，DNA连接反应，大肠埃希菌DH5α与大肠杆菌ET12567转化，重组质粒筛选，参照文献[21]进行。PCR反应：采用TaKaRa LA-Taq DNA酶，GC-Ⅰ体系。DNA测序在中美泰和生物技术 (北京) 有限公司完成。
1.2.2 重组质粒pBSK-ia和pSET52-ia的构建ist基因源自本实验室最初构建在pKC1139载体的重组质粒pSW4[1]，原来认为此质粒中包含ist和acyB2两个完整的基因，但通过Sma Ⅰ/BamH Ⅰ酶切和测序发现此片段包含ist完整基因和部分acyB2基因。为获得完整的acyB2基因，以耐热链霉菌 (S. thermotolerans CGMCC4.1501) 总DNA为模板，根据NCBI公布的acyB2基因的核苷酸序列 (GenBank Accession No. D31821) 设计引物 (表 1)。利用上游引物为acyB2-F, 在5′端加入BamH Ⅰ酶切位点, 下游引物为acyB2-R，在5′端分别加上EcoR Ⅰ酶切位点，通过PCR获得acyB2基因剩余的约900bp片段，BamH Ⅰ/EcoR Ⅰ双酶切后与包含ist基因的1.8kb Sma Ⅰ/BamH Ⅰ片段一起连入pBluesript Ⅱ SK (+) 载体，获得含完整ist基因和acyB2基因的重组质粒pBSK-ia，并进行DNA测序验证。
| Primer name | Oligonucleotide sequences (5′-3′) |
| acyB2-F | CGCGGATCCCGCTCAGGGACGCAAGACC |
| acyB2-R | CCGGAATTCGCCCCGTGACCTCACCGTC |
| IA-F | CTTCGAGGA ACTCCACGGG |
| IA-R | ACCGTC AGCGGGACAGGG |
| 16S RNA-F | GGTAGAGCTTGTTGACGCAGAG |
| 16S RNA-R | ATGAGGGCGAGGACAGCGATGC |
| ist-F | CGATGGAGAACCGCAGCCGAGC |
| ist-R | CGAGCAGCACGCCGAAGATGAAG |
用Xba Ⅰ/EcoR Ⅰ酶切pBSK-ia重组质粒，得到2.7kb的ist-acyB2连锁基因，通过Xba Ⅰ/EcoR Ⅰ酶切位点连入pSET152载体上，获得含ist-acyB2连锁基因的重组质粒pSET152-ia (图 1)。
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| 图 1 重组质粒pSET152-ia的构建 Figure 1 The construction of recombinant plasmid pSET152-ia |
具体操作参照文献[19]进行。
1.2.4 菌株筛选、发酵及发酵液的提取摇瓶初筛：挑取转化子于含Am (50μg/ml) 的斜面培养基上，28℃培养10~12天，菌株长好后挖块接种到装量30ml发酵培养基的100ml三角瓶，28℃振荡培养96~120h后，发酵液经离心取上清液稀释，进行埃莎霉素Ⅰ生物活性检测。
摇瓶复筛：挑选一定量的初筛高产菌种，经传代后接种于种子培养基，28℃培养48~52h，以8%的接种量转入发酵培养基 (500ml三角瓶, 装50ml发酵培养基)，28℃、96h进行二级摇瓶发酵复筛。
发酵液的提取：发酵液室温3 000r/min离心15min，上清液用1mol/L NaOH调至pH 8.5后，用1/2体积乙酸乙酯萃取，取出酯相于平皿中吹干，用适量甲醇溶解。
1.2.5 抗生素生物效价测定以枯草芽孢杆菌为检定菌，参考《中华人民共和国国药典》2005年版 (二部) 乙酰螺旋霉素微生物检定法[22]。采用杯碟法，用标准曲线法进行测定。参照文献[23]进行菌株摇瓶发酵产量分布的参数分析，计算变势B及菌株发酵产量的稳度和偏度。
1.2.6 Real-time PCR分析用可溶性发酵培养基培养WSJ-2和WSJ-IA菌株，取培养48h、72h、96h和120h的菌丝分别提取总RNA，进行RT-PCR和实时定量PCR分析。以16S RNA作为内参基因 (引物16S RNA-F/R，表 1)，对每个样品中的ist基因表达进行定量分析，每个样品做3个重复。以培养48h的WSJ-2中ist的表达量设为1，使用2-ΔΔCt方法计算WSJ-2和WSJ-IA中ist基因在不同培养时间的表达量。SYBR Green Ⅰ染料法进行定量分析，实时定量PCR仪为罗氏公司的LightCycler 96。荧光定量PCR反应条件：96℃预变性3min，96℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共计35个循环，72℃延伸10min。
1.2.7 高效液相色谱分析发酵液经提取、挥干后溶于色谱纯甲醇，过滤后进样10μl。色谱仪：岛津LC-10ATvp液相色谱仪，二级管阵列检测器。色谱柱：Kromasil C18 (4.5mm×150mm，5μm)。流动相：CH3OH：1% NaH2PO4(55:45)；检测波长：231nm；流速：1ml/min；柱温：25℃。以埃莎霉素Ⅰ标准品为对照品，检测并计算埃莎霉素Ⅰ(保留时间为34.534 min) 和螺旋霉素Ⅰ(保留时间为4.376min) 百分含量的比值，以此确定埃莎霉素Ⅰ的相对产量。
2 结果 2.1 重组质粒pSET152-ia的酶切鉴定和转化pSET152-ia用Xba Ⅰ-EcoR Ⅰ双酶切得到5.5kb和2.7kb两条带，用BamH Ⅰ酶切获得预期的6.4kb和1.8kb两条带，分别与pSET152载体和ist-acyB2连锁基因片段大小相符 (图 2)，经过测序也证实2.7kb中包含完整的ist和acyB2基因。
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| 图 2 重组质粒pSET152-ia的酶切鉴定 Figure 2 Identification of the recombinant plasmid pSET152-ia by restriction enzymes digestion 1, 2: pSET152-ia digested by Xba Ⅰ+EcoR Ⅰ, 3~4: pSET152-ia digested by BamH Ⅰ; M1:1kb ladder Marker; M2: λDNA Hind/Ⅲ Marker |
提取pSET152-ia重组质粒，转化至E. coli ET 12567中使重组质粒去甲基化。利用PEG介导的原生质体转化法将pSET152-ia导入到WSJ-2中，将转化子在含有Am (50μg/ml) 的平板进行传代培养，挑取阳性单克隆用IA-F/R引物 (表 1) 进行PCR，PCR产物测序验证正确。说明ist-acyB2基因通过链霉菌整合型载体pSET152整合进宿主菌WSJ-2染色体中，获得新的重组菌株命名为WSJ-IA。
2.2 重组菌株WSJ-IA发酵产量分布的参数分析WSJ-IA发酵产物中的抑菌物质主要是螺旋霉素和酰化螺旋霉素，对408个WSJ-IA转化子先进行摇瓶发酵初筛，微生物法测定菌种发酵效价。根据效价选取50株进行复筛，其与原始菌株WSJ-2效价的比值如图 3所示。50株复筛菌株的效价高于WSJ-2的占94%。
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| 图 3 重组菌株WSJ-IA产量分布图 Figure 3 Distribution of WSJ-IA recombinant strains with high fermentation titer compared to the original strain |
在发酵变势参数分析 (表 2) 中，可见复筛菌株的效价平均值X为665μg/ml，平均产量的标准差S为237.25，稳度Ct达2.80，偏度CS为-0.28，虽然出现了负偏，但仍使变势B达到741.19。表明调节基因acyB2的引入改变了原始菌株WSJ-2基因群的产量限定性。
| Ratio of fermentation titer of WSJ-IA/WSJ-2 | Number of strains | The proportion of recombinant strains (%) | The parametric analysis |
| 0~1.0 | 3 | 6 | |
| 1.0~1.5 | 5 | 10 | n=50 |
| 1.5~2.0 | 10 | 20 | X=665μg/ml |
| 2.0~2.5 | 9 | 18 | S=237.25 |
| 2.5~3.0 | 9 | 18 | Ct=2.80 |
| 3.0~3.5 | 11 | 22 | 1/ Ct=0.36 |
| 3.5~4.0 | 2 | 4 | Cs=-0.28 |
| 4.0~4.5 | 1 | 2 | B=741.19 |
| Note:n: Number of strains; X: Average titer; S: Standard deviation of average titer; Ct: Degree of stability of titer distribution (X/S); CS: Skewness of titer distribution Σ(Xi-X) 3/n/S3; Variable capacity B=X(6/Ct)1/6(1 + CS/8)1/2 | |||
对WSJ-2和WSJ-IA菌株中ist基因表达进行定量分析，发现两种菌株的ist基因的转录产物在24h时几乎检测不到，因此取培养48h、72h、96h和120h的菌丝进行定量PCR分析 (图 4)。通过2-ΔΔCt方法计算，以WSJ-2培养48h的ist基因表达量的数值设为1。从图 4中可以看出，在不同培养时间，WSJ-IA菌株中ist的表达水平都比WSJ-2的高，WSJ-2在72h时ist的表达量最高，而WSJ-IA菌株是在培养96h达到最高，是WSJ-2的4.7倍左右。
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| 图 4 Real-time PCR检测WSJ-2和WSJ-IA菌株中ist基因的相对表达量 Figure 4 The relative expression leavel of ist gene in WSJ-2 and WSJ-IA strains detected by Real-time PCR |
WSJ-IA菌株和原始菌株WSJ-2进行发酵培养，经反复筛选WSJ-IA中IA-41号菌株效价最高，达到 (1160±108)μg/ml (表 3)，比原始菌株WSJ-2[(280±20)μg/ml]的提高了314%。
| Batch number | Isomycin Ⅰ (peak area%) | Spiramycin Ⅰ (peak area%) | Isomycin Ⅰ/spiramycin Ⅰ(%) | Titer (μg/ml) | |||||||
| IA-41 | WSJ-2 | IA-41 | WSJ-2 | IA-41 | WSJ-2 | IA-41 | WSJ-2 | ||||
| 1 | 29.16 | 15.18 | 13.87 | 17.37 | 210.24 | 87.39 | 1250 | 280 | |||
| 2 | 30.16 | 21.52 | 10.32 | 16.49 | 292.25 | 130.50 | 1190 | 300 | |||
| 3 | 29.93 | 15.64 | 14.56 | 20.56 | 205.56 | 76.07 | 1040 | 260 | |||
| X±S | 29.75±0.52 | 17.45±3.54 | 12.92±2.28 | 18.14±2.14 | 236.02±48.76 | 97.99±28.72 | 1160±108 | 280±20 | |||
按方法1.2.7对发酵产物进行HPLC分析，计算埃莎霉素Ⅰ的相对产量。HPLC检测发现，螺旋霉素Ⅰ特征峰的保留时间在4.4min左右，埃莎霉素Ⅰ的保留时间为34.5min，保留时间6.6min左右为其它酰化螺旋霉素。从图 5中可以看出，在上样量相同的条件下，IA-41菌株中螺旋霉素和埃莎霉素Ⅰ特征峰的峰高和峰面积都大于WSJ-2的峰值。从表 3的统计中，在IA-41菌株中埃莎霉素Ⅰ占总发酵产物比例为 (29.75±0.52%) 左右，而WSJ-2中埃莎霉素Ⅰ所占比例为 (17.45±3.54)%。从埃莎霉素Ⅰ与螺旋霉素Ⅰ的峰面积比值来看，IA-41菌株中二者比例为 (236.02±48.76)%，在WSJ-2中的比例是 (97.99±28.72)%，IA-41中二者比值是WSJ-2的2.4倍左右，说明其埃莎霉素Ⅰ的相对含量明显高于原始菌株WSJ-2。
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| 图 5 WSJ-2和IA-41发酵产物的HPLC检测 Figure 5 HPLC detection of the fermentation products from strain WSJ-2 and IA-41 (a) spiramycin Ⅰ(SP Ⅰ) (b) Isomycin Ⅰ (c) WSJ-2 (d) IA-41 |
将IA-41高产菌株在不加Am抗生素的情况下连续传3~4代后，再经加药 (Am, 50μg/ml) 检测，结果表明抗性表达稳定，而且发酵单位也达 (1 220±53)μg/ml，说明外源基因ist-acyB2在WSJ-IA基因组比较稳定，WSJ-IA是一种稳定型基因工程高产菌株。
3 讨论目前BT已完成临床试验研究，进入新药证书申报阶段。构建埃莎霉素Ⅰ单组分产生菌对简化生产工艺、质量控制及制剂改良均有重要价值。本研究利用调节基因acyB2激活ist基因表达的特点，将ist和其正调控基因acyB2同时导入埃莎霉素Ⅰ低产菌株WSJ-2中，通过acyB2的正调控来提高ist的表达量，从而提高由螺旋霉素Ⅰ转化生成埃莎霉素Ⅰ的产量。
S. spiramyceticus是中国医学科学院医药生物技术研究所 (原名为中国医学科学院抗菌素研究所) 从土壤中分离的螺旋霉素产生菌，经初步鉴定可能是一个产螺旋霉素链霉菌新种[24]。在早期构建的BT产生菌的产量较低，除了进行诱变育种外，为了提高ist的表达量，在链霉菌模式菌株S. lividans TK24中测试了多种提高ist基因表达的方法。首先在ist基因前面引入强启动子PermE*后转化到S. lividans TK24中，通过生物转化法可以将外加的螺旋霉素高效转化为必特螺旋霉素[25]；另外利用S. mycarofaciens 1748中的正调控基因orf27和orf 28可以调控ist基因在S. lividans TK24中高表达，其转化效率与PermE*调控下的ist基因相当[26]，但目前还没有将它们导入S. spiramyceticus中检测ist的表达情况。
S. spiramyceticus中含有螺旋霉素生物合成的正调控基因srm40的同源基因，与acyB2的一致性达到70%[27]，在早期构建的BT产生菌中只引入了异源ist基因，因此推测ist基因的激活可能由该菌内的Srm40完成。AcyB2在S. thermotolerans和S. lividans中能激活ist基因表达[13]，而在S. spiramyceticus中也可能具有正调控螺旋霉素生物合成的功能。所以在将ist-acyB2连锁基因整合在WSJ-2基因组上后，定量PCR研究显示ist基因表达量明显提高；而且在发酵效价、螺旋霉素和埃莎霉素Ⅰ的产量上WSJ-IA都比WSJ-2要高，说明acyB2既能正调控ist基因表达，也能促进螺旋霉素的生物合成。并通过发酵实验证实WSJ-IA菌株的埃莎霉素Ⅰ产量也比WSJ-2菌株高3倍以上。但通过同源分析发现，在acyB2中并没有DNA结合结构域，因此acyB2的作用机制还需要进一步研究。尽管acyB2提高埃莎霉素Ⅰ产量的作用机制还不清楚，但WSJ-IA高产菌株的构建成功，为埃莎霉素Ⅰ的后续研发奠定了重要基础。
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