中国生物工程杂志  2017, Vol. 37 Issue (2): 81-87

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王笃强, 沈云龙, 廖远平, 李德彬, 刘虹均, 陈帅, 卢大儒, 朱化星.
WANG Du-qiang, SHEN Yun-long, LIAO Yuan-ping, LI De-bin, LIU Hong-jun, CHEN Shuai, LU Da-ru, ZHU Hua-xing.
循环酶法同型半胱氨酸检测关键酶CBS和CBL的开发及试剂盒研制初探
Development of Two Recombinant Enzymes: Cystathionine β-synthase and Cystathionine β-lyase Vital for Enzymatic Cycling Homocysteine Assay and Preliminary Characterization of the Corresponding Assay Kit
中国生物工程杂志, 2017, 37(2): 81-87
China Biotechnology, 2017, 37(2): 81-87
http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20170212

文章历史

收稿日期: 2016-08-15
修回日期: 2016-09-07
循环酶法同型半胱氨酸检测关键酶CBS和CBL的开发及试剂盒研制初探
王笃强1,2 , 沈云龙1 , 廖远平1 , 李德彬1 , 刘虹均1 , 陈帅1 , 卢大儒2 , 朱化星1     
1. 吴江近岸蛋白质科技有限公司研发部 苏州 215222
2. 复旦大学生命科学学院遗传工程国家重点实验室 上海 200433
摘要: 以酿酒酵母基因组为模板通过PCR分别扩增胱硫醚β合成酶(cystathionine β-synthase,CBS)和胱硫醚β-裂解酶(cystathionine β-lyase,CBL)目的基因片段,经无缝克隆构建表达质粒并转化大肠杆菌菌株E. coli BL21(DE3)。经诱导表达和纯化后,重组蛋白的纯度均达到90%,回收率均达到80%,可溶表达量分别为26 mg/L和332 mg/L。经催化活性测定,CBS的单位酶活为15 U/mg,CBL的单位酶活为72 U/mg。在此基础上初步开发了循环酶法同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)检测试剂盒,实验结果证明该试剂盒的有效性和稳定性均符合体外诊断检测的要求,其检测性能与市售进口同类试剂盒基本一致。
关键词: 胱硫醚β-合成酶     胱硫醚β-裂解酶     同型半胱氨酸     酶活测定    
Development of Two Recombinant Enzymes: Cystathionine β-synthase and Cystathionine β-lyase Vital for Enzymatic Cycling Homocysteine Assay and Preliminary Characterization of the Corresponding Assay Kit
WANG Du-qiang1,2 , SHEN Yun-long1 , LIAO Yuan-ping1 , LI De-bin1 , LIU Hong-jun1 , CHEN Shuai1 , LU Da-ru2 , ZHU Hua-xing1     
1. R&D Department, Novoprotein Scientific (Wujiang) Inc, Suzhou 215222, China;
2. State Key Laboratory of Genetic Engineering, School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200433, China
Abstract: The target genes of cystathionine β-synthase (CBS) and cystathionine β-lyase (CBL) from Saccharomyces cerevisiae were amplified by PCR and cloned into the expression vector pET28a respectively. The resulting plasmids were then transformed to E.coli BL21(DE3) cells. After induction of the gene expression with IPTG and protein purification, the purities of recombinant CBS and CBL were both near 90% with a final yield of 80%. The soluble expression levels of CBS and CBL were 26 mg/L and 332 mg/L respectively, and the specific activities of purified enzymes were determined to be 15 U/mg and 72 U/mg. With utilization of recombinant CBS and CBL as two key components, an enzymatic cycling homocysteine (Hcy) assay kit was developed and characterized preliminarily, whose functionality and stability are believed to meet the requirements of in vitro diagnostic usage. In addition, functionality comparison of our Hcy assay kit with the imported product that has been sold on the market did not show any obvious difference.
Key words: Cystathionine β-synthase     Cystathionine β-lyase     Homocysteine     Enzymatic activity measurement    

近些年的研究表明,同型半胱氨酸 (homocysteine,Hcy) 代谢水平高低与心脑血管疾病、糖尿病等疾病存在紧密联系[1-3],因此建立快速高效的Hcy检测方法,对基础研究乃至临床医学均具有至关重要的作用[4]

目前,同型半胱氨酸的检测主要包括同位素法、色谱法、免疫法与荧光偏振技术结合等方法,存在操作繁琐、仪器昂贵、实验成本较高等弊端,无法全面普及[5-7]。而循环酶法具有快速、简便、灵敏度高[8],易于自动化等特点,该方法根据实验原理的不同,具体分为腺苷同型半胱氨酸循环酶法 (四酶法) 和胱硫醚循环酶法 (三酶法) 两种类型。相对于四酶法,三酶法所需酶种类更少且反应中间条件更易控制。

本研究旨在开发同型半胱氨酸三酶法检测所需关键原料酶和成品试剂盒,其中原料酶包括:胱硫醚β合成酶 (cystathionine β-synthase, CBS)、胱硫醚β-裂解酶 (cystathionine β-lyase, CBL) 和乳酸脱氢酶 (LDH)[9-10]。该试剂盒反应原理如下:CBS催化丝氨酸和游离Hcy反应合成胱硫醚,CBL催化胱硫醚裂解生成丙酮酸、Hcy和氨[8],Hcy可再循环进入第一步反应,增强整个级联反应的信号,随后LDH催化丙酮酸与NADH反应生成乳酸和NAD+,因此可以通过直接测量NADH在340 nm波长下吸光值的变化反映检测体系中游离Hcy的浓度[11]

综上所述,开发三酶循环法Hcy检测试剂盒的关键是获得具有催化活性的CBS和CBL重组蛋白。本研究成功地从酿酒酵母基因组中扩增获得CBS和CBL目的基因,经无缝克隆构建表达质粒并转化大肠杆菌BL21(DE3) 进行重组表达。经亲和层析纯化后获得高纯度和高活性的CBS和CBL重组蛋白,并根据三酶法工作原理进行了Hcy检测试剂盒的初步开发和性能验证,为该产品的临床应用奠定了技术基础。

1 材料与方法 1.1 材料

大肠杆菌菌株E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3);表达载体pET28a、NovoRec® PCR一步定向无缝克隆试剂盒、质粒抽提DNA试剂盒、DNA胶回收试剂盒、DNA分子量Marker、蛋白分子量Marker;His融合蛋白纯化柱 (IMAC预装柱) 均由Novoprotein公司提供;各种限制性内切酶购自TaKaRa公司;循环酶法同型半胱氨酸 (Hcy) 检测试剂盒、同型半胱氨酸标准品和质控品均购自Axis-shield公司;D,L-同型半胱氨酸 (Hcy)、磷酸吡哆醛 (PLP)、乳酸脱氢酶 (LDH)、NADH、L-丝氨酸 (L-Ser)、牛血清白蛋白 (BSA)、L-胱硫醚均购自Sigma公司;其余试剂均为国产或进口分析纯。

TB培养基:1.2%胰蛋白胨,2.4%酵母粉,72mmol/L K2HPO4,17mmol/L KH2PO4,0.4%甘油;ZYM培养基:1%胰蛋白胨,0.5%酵母粉,25mmol/L Na2HPO4,25mmol/L KH2PO4,50mmol/L NH4Cl,5mmol/L Na2SO4,2mmol/L MgSO4,0.5%甘油,0.05%葡萄糖,0.2%乳糖;LB培养基:1%胰蛋白胨,0.5%酵母粉,1% NaCl。

1.2 方法

1.2.1 基因扩增、重组表达载体pET28a-CBS和pET28a-CBL的构建

以酿酒酵母 (S. cerevisiae) 基因组DNA为模板,通过PCR获得CBS和CBL目的基因片段。用NdeⅠ和XhoⅠ酶切质粒pET28a,切胶回收后,线性质粒分别与CBS和CBL基因片段通过无缝克隆构建重组表达载体pET28a-CBS和pET28a-CBL,测序正确后分别转化E.coli BL21(DE3),从而获得重组表达菌株E.coli BL21(DE3)(pET28a-CBS) 和E.coli BL21(DE3)(pET28a-CBL)。

1.2.2 重组CBS和CBL的表达与纯化

表达:重组大肠杆菌菌液在37℃ TB培养基中培养至OD600值2.0时加入IPTG (终浓度为0.1 mmol/L),16℃过夜培养。

粗提取:低温高速 (12 000g) 离心收集的菌体重悬于平衡缓冲液 (20mmol/L Tris-HCl,250mmol/L NaCl,10mmol/L Imidazole,100μmol/L PLP,pH8.0),冰浴中超声破菌,低温高速离心后取上清液即为粗酶液。

纯化:粗酶液加入到经平衡缓冲液平衡完全的IMAC预装柱,上样结束后用平衡缓冲液洗脱,随后用不同咪唑浓度的洗脱缓冲液 (20mmol/L Tris-HCl,250mmol/L NaCl,50~500mmol/L Imidazole,100μmol/L PLP,pH8.0) 进行梯度洗脱,收集洗脱产物并透析至缓冲液 (20mmol/L Tris-HCl,150mmol/L NaCl,10%Glycerol,0.01%Tween20,pH8.0),-20℃保存备用。

1.2.3 蛋白浓度测定

采用Bradford法,以牛血清白蛋白制作标准曲线,测定重组CBS和CBL的蛋白浓度。

1.2.4 SDS-PAGE分析

SDS-PAGE电泳用于分析目的蛋白的相对分子质量及纯度,分离胶浓度为15%,染色使用考马斯亮蓝R-250。

1.2.5 酶活性测定

由于传统的CBS和CBL酶活检测方法[12-13]存在一些弊端,如特征吸收峰不明显,特征吸收波长不一致,实验稳定性和重复性较差等[14],本研究采用了下述测活方法:酶活性检测体系为150μl,其中底物体系100μl,酶液体系50μl。100μl底物体系包括:91.5μl Tris-HCl (50mmol/L,pH8.5)、1.5μl NADH (70mmol/L)、5μl Hcy (370mmol/L)、2μl L-Ser (500mmol/L);50μl酶液体系包括:5μl LDH (1.5~2.5U/μl) 和10U CBL (检测CBS活性) 或10U CBS (检测CBL活性), 不足50μl以Tris-HCl补足。底物和酶体系混合后37℃孵育5min,加入1μl稀释至0.25mg/ml的待测CBS或CBL酶液反应7min,每30s记录一次340nm波长下吸光度,以不加待测酶液的反应液为对照。酶活性定义:在pH 8.0,温度37 °C条件下,每分钟催化产生1 μmol Hcy所需要的待测酶酶量定义为1个单位 (U)。

1.2.6 重组CBS酶活性优化

重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(pET28a-CBS) 菌液分别在37℃ ZYM、LB、TB培养基中培养至OD600值2.0,加入IPTG (终浓度为0.1mmol/L) 进行诱导,16℃过夜培养。超声破碎后收集上清,经His亲和层析柱一步纯化后,重组CBS透析至保存缓冲液并检测酶活性。

在TB培养基中添加不同组份,检测重组CBS活性的差异:在相同培养条件下将重组大肠杆菌菌液培养于TB培养基、TB培养基 (添加0.15mmol/L FeCl3)、TB培养基 (添加0.15mmol/L FeCl3和10mg/ml VB6),超声破碎后收集上清,经His亲和层析柱一步纯化后,重组CBS透析至保存缓冲液并检测酶活性。

1.2.7 三酶法同型半胱氨酸检测试剂盒 (NOVOHOMO试剂盒) 的有效性检测

使用高纯度和高活性的CBS和CBL重组蛋白配制NOVOHOMO同型半胱氨酸检测试剂盒 (三酶法),主要成分为试剂A (Reagent A):500mmol/L L-Ser、70mmol/L NADH、2% BSA、50mmol/L Tris-HCl) 和试剂B (Reagent B):5U/mg CBS、60U/mg CBL、5U/μl LDH、2% BSA、50mmol/L Tris-HCl、100μmol/L PLP。

以不含Hcy的溶液为空白对照,分别取2μmol/L、8μmol/L、16.65μmol/L、34.5μmol/L Hcy标准品作为待测样品,通过NOVOHOMO试剂盒进行循环酶法检测,根据340nm波长下吸光度的变化速率绘制标准曲线,记录不同批次NOVOHOMO试剂盒Hcy标准曲线的斜率a值和线性回归R2值;以8μmol/L和16.65μmol/L Hcy质控品为待测样品,根据标准曲线确定不同批次NOVOHOMO试剂盒的检测值及相同批次平行10次检测值,计算CV批间(%) 以及CV批内(%),验证NOVOHOMO试剂盒的有效性。

1.2.8 NOVOHOMO试剂盒的保存稳定性检测

取新鲜配制的NOVOHOMO试剂盒Reagent A和Reagent B,分别于4℃保存0、3、6、9、12个月后,取不同浓度Hcy标准品绘制标准曲线,记录其斜率a值和线性回归R2值,并以16.65μmol/L Hcy质控品为待测样品,检测NOVOHOMO试剂盒的保存稳定性。

1.2.9 NOVOHOMO试剂盒与市售同类产品性能比较

以含Hcy血清为待测样品,进行NOVOHOMO试剂盒与市售Axis-shield试剂盒的检测性能对比实验。

2 结果与讨论 2.1 重组蛋白的表达与纯化

对照蛋白分子量Marker,SDS-PAGE电泳显示重组CBS和CBL蛋白的分子量分别为55 kDa和40 kDa左右 (图 1),与酿酒酵母CBS和CBL的分子量理论值大小相近。此外,在16℃、0.1mmol/L IPTG的诱导条件下,重组蛋白表达量较高且为可溶表达,CBS和CBL可溶表达量分别占上清表达总量的60%和70%。

图 1 SDS-PAGE分析重组CBS和CBL的表达与纯化 Figure 1 SDS-PAGE analyses of the expression and purification of recombinant CBS and CBL (a) SDS-PAGE analysis of expression and purification of recombinant CBS (b) SDS-PAGE analysis of expression and purification of recombinant CBL MK: Protein standard marker; 1: Supernatant of full lysate; 2: Flowthrough; 3: Elution samples from His-affinity column with 50mmol/L Imidazole; 4 and 5: 250mmol/L Imidazole

通过His亲和层析柱一步纯化的结果如图 1所示。重组蛋白CBS和CBL经过一步纯化后纯度均达到90%,回收率均达到80%,可溶表达量分别为26mg/L和332mg/L,回收率和纯度均达到后续实验要求。相对于Maclean等[15]将重组酿酒酵母CBS通过原核表达的表达量为10 mg/L,和曹珊珊等[4]将重组大肠杆菌CBL通过原核表达的表达量为18 mg/L,本研究目的蛋白的表达量更高,可为后续同型半胱氨酸检测试剂盒的开发提供充足的原材料来源。

2.2 酶活性测定

重组CBS和CBL酶活检测结果如图 2所示。相对于阴性对照,在CBS和CBL的测活体系中加入Hcy底物后,OD340值随着时间逐渐下降,说明NADH被消耗,因此重组CBS和CBL均存在催化活性。

图 2 重组CBS和CBL的酶活测定 Figure 2 Enzyme activity measurements of recombinant CBS and CBL (a) Recombinant CBS (b) Recombinant CBL

根据酶活性定义及酶比活公式

可以计算出在最优条件下获得的重组CBS的单位酶活为15 U/mg,重组CBL的单位酶活为72U/mg,均达到用于Hcy检测试剂盒开发的要求。

2.3 重组CBS酶活性优化

不同培养基以及在TB培养基中添加不同组份对重组CBS的活性影响,如表 1表 2所示。

表 1 不同培养基对CBS活性的影响 Table 1 The effect of culture medium on enzymatic activity of recombinant CBS
培养基 活性 (U/mg)
ZYM 0.15
LB 0.32
TB 0.5

表 2 TB培养基添加不同组份对CBS活性的影响 Table 2 The effect of different reagents added into TB culture medium on enzymatic activity of recombinant CBS
培养基添加组份 活性 (U/mg)
TB培养基 0.5
TB培养基 (0.15mmol/L FeCl3) 0.72
TB培养基 (0.15mmol/L FeCl3和10mg/ml VB6) 1.2

三种不同培养基对CBS活性存在不同程度的影响,其中TB培养基有利于CBS保持较高活性。此外,向TB培养基中添加不同组份对CBS活性同样具有影响,加入0.15mmol/L FeCl3和10mg/ml VB6对CBS活性提高具有明显促进作用。因此,为了保证最终Hcy检测试剂盒中所使用的CBS具有更高活性,可以选择培养基成分为TB培养基 (添加0.15mmol/L FeCl3和10mg/ml VB6),从而达到优化酶活性的目的。

2.4 三酶法同型半胱氨酸检测试剂盒 (NOVOHOMO试剂盒) 的有效性

以不含Hcy的溶液为空白对照,分别取2μmol/L、8μmol/L、16.65μmol/L、34.5μmol/L Hcy标准品作为待测样品,选择不同批次NOVOHOMO试剂盒绘制标准曲线并统计其斜率和线性回归R2值 (表 3),同时以8μmol/L和16.65μmol/L Hcy质控品为待测样品,计算CV批间(%)(表 4) 以及CV批内(%)(表 5)。

表 3 不同批次NOVOHOMO试剂盒Hcy标准曲线的斜率和线性回归R2值统计 Table 3 Slope and R2 linear regression values of the standard curves calibrated from different batches of NOVOHOMO Hcy assay kits
试剂盒批次 标准曲线线性回归R2 标准曲线斜率
20140814 0.99987 0.00052
20141025 0.99692 0.00056
20140703 0.99459 0.00050
20140617 0.99626 0.00058
20141105 0.99759 0.00049
20141228 0.99875 0.00058
20150206 0.99921 0.00050
20150430 0.99360 0.00063
20150505 0.99867 0.00055
20150619 0.99561 0.00053
平均值 0.99711 0.00054
标准偏差 0.00208 0.00004
相对标准偏差% - 8.24

表 4 NOVOHOMO试剂盒批间检测精密度 Table 4 Inter-batch CV of NOVOHOMO Hcy assay kits (totally ten batches)
试剂盒批次 Hcy 8μmol/L Hcy 16.65μmol/L
20140814 7.93 16.43
20141025 7.72 17.47
20140703 8.47 16.20
20140617 8.25 16.24
20141105 9.21 18.50
20141228 8.79 16.33
20150206 8.24 15.04
20150430 8.61 16.66
20150505 8.24 15.24
20150619 7.75 16.49
平均值 8.32 16.46
标准偏差 0.46 0.99
精密度CV% 5.62 6.02

表 5 NOVOHOMO试剂盒批内检测精密度 Table 5 Intra-batch CV of NOVOHOMO Hcy assay kits (totally ten measurements)
测试次数 Hcy 8μmol/L Hcy 16.65μmol/L
1 7.93 16.56
2 8.22 16.71
3 8.47 16.35
4 8.03 16.37
5 8.21 16.74
6 8.65 16.46
7 8.24 16.28
8 8.31 16.82
9 8.13 15.17
10 7.75 16.73
平均值 8.19 16.41
标准偏差 0.25 0.47
精密度CV% 3.15 2.91

不同批次NOVOHOMO试剂盒Hcy标准曲线的线性回归R2值均大于0.99、斜率相对标准偏差为8.24%(表 3),说明该试剂盒检测2~34.5μmol/L Hcy标准品的线性化良好且稳定。

不同批次NOVOHOMO试剂盒对8μmol/L和16.65μmol/L Hcy质控品分别进行平行检测,批间精密度CV均小于15%(表 4),说明该试剂盒批间检测重复性良好。

同一批次NOVOHOMO试剂盒对8μmol/L和16.65μmol/L Hcy质控品分别进行10次检测,批内精密度CV均小于10%(表 5),说明该试剂盒批内检测重复性良好,进一步证明了其有效性。

2.5 NOVOHOMO试剂盒的保存稳定性

NOVOHOMO试剂盒于4℃保存0、3、6、9、12个月后,以不同浓度Hcy标准品绘制标准曲线计算其斜率及线性回归R2值,同时以16.65μmol/L Hcy质控品作为样品进行检测 (表 6)。

表 6 NOVOHOMO试剂盒4℃ 12个月保存稳定性 Table 6 Stability of NOVOHOMO Hcy assay kit stored at 4℃ for up to 12 months
保存时间 (月) 标准曲线线性回归R2 标准曲线斜率 Hcy16.65μmol/L
0 0.99887 0.00051 17.11
3 0.99861 0.00065 17.02
6 0.99792 0.00059 16.94
9 0.99697 0.00063 16.32
12 0.99731 0.00055 15.65
平均值 0.99794 0.00053 16.61
标准偏差 0.00081 0.00058 0.62
相对标准偏差% - 9.73 -

从NOVOHOMO试剂盒标准曲线及样品检测数据的统计情况可以看出,其R2值均大于0.99、斜率相对标准偏差为9.73%,16.65μmol/L Hcy质控品的检测均值为16.61μmol/L (表 6),说明该试剂盒稳定性较好,4℃保存12个月后仍不影响其正常使用。

2.6 NOVOHOMO试剂盒与市售同类产品性能比较

以血清为待测样品,进行NOVOHOMO试剂盒与Axis-shield试剂盒的检测性能对比。

针对两种试剂盒对血清样品的检测性能差异,首先进行Bland-Altman plot分析 (图 3a),所检测的8个血清样品Hcy赋值均在95%的一致性界限内,实验偏差为0.2μmol/L,无明显差异;随后采用Passing-Bablok plot进行分析 (图 3b),实验计算P值大于0.1,进一步说明NOVOHOMO试剂盒与市售Axis-shield试剂盒的检测性能基本一致。

图 3 NOVOHOMO试剂盒与Axis-shield试剂盒检测性能比较 Figure 3 Functionality comparison of NOVOHOMO Hcy assay kit with Axis-shield kit (a) Bland-Altmat plot (b) Passing-Bablok plot
3 结论

综上所述,本研究成功地从酿酒酵母基因组中扩增获得CBS和CBL目的基因,构建表达质粒后转化大肠杆菌BL21(DE3) 进行重组表达。重组菌在16℃、0.1mmol/L IPTG条件下过夜诱导,经过一步纯化后CBS和CBL重组蛋白纯度均达到90%,回收率均达到80%,可溶表达量分别为26mg/L和332mg/L。酶活性检测实验证明重组CBS和CBL均存在催化活性。根据酶活定义及酶比活计算公式可以计算出重组CBS的单位酶活为15 U/mg,重组CBL的单位酶活为72 U/mg,均达到用于同型半胱氨酸 (Hcy) 检测的要求。

此外,重组菌在添加0.15mmol/L FeCl3和10mg/ml VB6的TB培养基中培养所获得的重组CBS活性相对较高,有利于后期Hcy检测试剂盒的开发。

在获得高纯度和高活性重组CBS和CBL的基础上,我们进行了三酶循环法Hcy检测试剂盒 (NOVOHOMO试剂盒) 的初步开发并验证了该试剂盒的有效性和保存稳定性。此外,该试剂盒与市售Axis-shield同型半胱氨酸试剂盒的检测性能基本一致。

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