文章信息
- 刘珊, 李元, 祝俊.
- LIU Shan, LI Yuan, ZHU Jun.
- 偶联基于酮还原酶的NADH再生系统一锅法酶催化合成L-2-氨基丁酸
- One-pot Enzymatic Synthesis of L-2-Aminobutyric Acid Coupling with a NADH Regeneration System Based on Ketoreductase
- 中国生物工程杂志, 2017, 37(1): 64-70
- China Biotechnology, 2017, 37(1): 64-70
- http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20170110
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文章历史
- 收稿日期: 2016-07-04
- 修回日期: 2016-08-04
L-2-氨基丁酸是一种重要的手性医药中间体,可用于抗结核药物盐酸乙胺丁醇[1]以及抗癫痫药物左乙拉西坦[2]和布瓦西坦[3]的合成。目前文献报道的L-2-氨基丁酸的合成方法主要有化学合成法和微生物酶促合成法。化学法制备是比较经典的方法,然而该类方法合成的产物多为消旋体,需要进一步拆分[4]。另外,化学法需要使用昂贵的试剂,成本较高,工业生产不易采用,同时还会使用大量有机溶剂,易造成环境污染。
近年来,L-2-氨基丁酸的酶法合成备受人们关注。用于催化合成L-2-氨基丁酸的酶主要有转氨酶和氨基酸脱氢酶。利用α-转氨酶[5]合成时,由于反应的可逆性仅获得58%~62%的产率,并且该过程复杂,需要引入乙酰乳酸合成酶、丙氨酸外消旋酶和D-氨基酸氧化酶移除副产物[6]。L-2-氨基丁酸还可通过ω-转氨酶[7]以苄胺或异丙胺作为氨基供体合成,该反应不可逆,但目前所报道的ω-转氨酶法[8]普遍底物浓度偏低。
L-2-氨基丁酸也可以通过以亮氨酸脱氢酶(leucine dehydrogenase,LeuDH)[9]、缬氨酸脱氢酶[10]及谷氨酸脱氢酶[3]等氨基酸脱氢酶作为催化剂还原2-丁酮酸制备。氨基酸脱氢酶以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(还原型辅酶Ⅰ,NADH)作为辅酶,所以在转化反应过程中需要偶联辅酶再生体系。Galkin等[11]以LeuDH催化,并偶联基于甲酸脱氢酶的辅因子再生系统,可达到L-2-氨基丁酸的产率为88%,最终浓度为36g/L。由于2-丁酮酸不易市售获得,以其作为原料制备L-2-氨基丁酸成本昂贵,苏金环等[12]报道了以廉价易得的L-苏氨酸为原料,生物催化一锅法制备L-2-氨基丁酸。Tao等[13]以L-苏氨酸为原料,以苏氨酸脱氨酶(threonine deaminase,L-TD)和LeuDH催化,偶联基于甲酸脱氢酶或葡萄糖脱氢酶的NADH再生系统,实现了一锅法制备L-2-氨基丁酸。然而,基于甲酸脱氢酶的NADH再生系统需要以甲酸盐为底物,过量甲酸盐的存在为产物L-2-氨基丁酸的分离纯化带来了不便;而基于葡萄糖脱氢酶的NADH再生系统由于副产物葡萄糖酸的生成,在反应过程中需要控制反应的pH,增加了反应的复杂性。
除此之外,酮还原酶(ketoreductase,KRED)也可用于NADH再生[14-15]。基于KRED的NADH再生系统可以以异丙醇为底物,通过氧化异丙醇为丙酮,实现NADH的再生;反应产物为丙酮,使得水溶性目标产物较易分离纯化。因此,本研究偶联基于KRED的NADH再生系统,以L-苏氨酸为底物,利用L-TD和LeuDH催化,一锅法制备L-2-氨基丁酸,路线图如图 1所示:在L-TD的催化下,底物L-苏氨酸转化为中间体2-丁酮酸;中间体2-丁酮酸在LeuDH的催化下还原为终产物L-2-氨基丁酸,同时KRED实现NADH的再生。由于引入基于KRED的NADH再生系统,可以使用廉价易得的异丙醇为底物,实现辅因子再生;产物为丙酮,反应结束后很容易除去,易于L-2-氨基丁酸的分离纯化。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 质粒与菌株大肠杆菌(E. coli) K12、Top10、BL21(DE3) 与表达载体pET-21a(+)为本实验室保存。
1.1.2 试剂限制性内切核酸酶购于Thermo;Taq DNA聚合酶、PrimeSTAR DNA聚合酶和T4 DNA连接酶购于TaKaRa;基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司;L-苏氨酸及L-2-氨基丁酸标准品购于阿拉丁,2-丁酮酸标准品购于Sigma-Aldrich;烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(辅酶Ⅰ,NAD+)和NADH购于Amresco。其他试剂均为国产分析纯试剂。
1.2 方法 1.2.1 重组表达载体的构建将E. coli K12接种到LB培养基中,37℃培养过夜,离心收集菌体,根据基因组提取试剂盒中提供的说明书提取基因组DNA。以5′-GGAATTCCATATGGCTGACTCGCAACCCCTG-3′和5′-CGGGATCCTTAACCCGCCAAAAAGAACCTG-3′为引物从E. coli K12的基因组PCR扩增编码L-TD的基因ilva。PCR条件为:94℃ 5min;94℃ 45s,58℃ 30s,72℃ 1.5min,进行30个循环;72℃ 10min。PCR产物用NdeI/BamH I双酶切,将胶回收后的酶切片段与同样酶切的pET-21a(+)连接,构建重组质粒pET21a-ilva,测序验证序列同一性。
编码LeuDH的基因leudh(GenBank: AB103384.1) 和编码KRED的基因kred (GenBank: HK067133.1) 由华大基因从新合成,并进行密码子优化以适合在E. coli中外源表达。基因的两端分别添加NdeI和BamH I酶切位点。用NdeI/BamH I双酶切,将胶回收后的基因片段与同样酶切的pET-21a(+)连接,构建重组质粒pET21a-leudh和pET21a-kred,测序验证序列同一性。
1.2.2 重组蛋白的诱导表达及酶粉制备将构建成功的重组质粒分别转入E. coli BL21(DE3) 中。将含有重组质粒的工程菌接种到含有100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中,37℃、200r/min培养过夜。取一定量的过夜培养物以1%的接种量转接入另一摇瓶中培养至OD600=0.6~0.8,加入诱导剂IPTG,终浓度为0.1mmol/L,25℃、200r/min诱导过夜。离心收集菌体,用无菌水洗涤一次后,加入20mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 8.0) 重悬。冰浴超声破碎细胞,4℃、12 000r/min离心10min,收集上清液,冷冻干燥后即得到重组蛋白的粗酶粉。
1.2.3 酶活测定L-TD酶活测定:以L-苏氨酸为底物,采用分光光度法测定[16]。标准反应体系包括:10mmol/L L-苏氨酸,50mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 8.0) ,适量粗酶冻干粉,总体积为3ml。30℃下反应30min,测定OD230。酶活定义:一个酶活力单位(U)定义为在测定条件下,每分钟产生1μmol 2-丁酮酸所需要的酶量。
LeuDH酶活测定:以2-丁酮酸为底物,采用分光光度法测定[17]。标准反应体系包括:50mmol/L 2-丁酮酸,0.25mmol/L NADH,200mmol/L NH3/NH4Cl缓冲液(pH 7.5) ,200mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 8.0) ,适量粗酶冻干粉,总体积为3ml。30℃下测定340nm处NADH吸光度的变化。酶活定义:一个酶活力单位(U)定义为在测定条件下,每分钟消耗1μmol NADH所需要的酶量。
KRED酶活测定:以异丙醇为底物,采用分光光度法测定[15]。标准反应体系包括:100mmol/L异丙醇,1mmol/L NAD+,200mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 8.0) ,适量粗酶冻干粉,总体积为3ml。30℃下测定340nm处NADH吸光度的变化。酶活定义:一个酶活力单位(U)定义为在测定条件下,每分钟产生1μmol NADH所需要的酶量。
1.2.4 催化反应条件优化为了探索催化反应的最佳反应条件,考察了影响反应的各种因素。标准催化反应体系为:50g/L L-苏氨酸,5%异丙醇(V/V),0.5g/L NAD+及10ml磷酸钠缓冲液(100mmol/L,pH 8.0) 。用浓氨水调节反应pH至8.0,加入0.6g/L L-TD粗酶,2g/L LeuDH粗酶和2g/L KRED粗酶,酶添加量参照苏金环等[12]报道的方法。在30℃、200r/min下反应,定期取样,用高效液相色谱(HPLC)监测反应过程。
1.2.5 分析方法反应产物L-2-氨基丁酸使用HPLC定量检测。HPLC检测条件:色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18 (4.6×150mm,5μm),柱温为28℃,以磷酸钠缓冲液(20mmol/L,pH 1.85~2.0) 与乙腈(97:3,V/V)为流动相,流速为1.0ml/min,等梯度洗脱,检测器为紫外检测器,检测波长为210nm,进样量为10μl。
2 结果与讨论 2.1 重组酶的表达及活性检测根据NCBI数据库中来源于E. coli K12的ilva序列设计引物,以K12的基因组为模板进行PCR扩增,产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定大小约为1 500bp,与预期相符。将其克隆入pET-21a(+)并转化E. coli BL21(DE3) 。重组菌株经IPTG诱导后,L-TD在E. coli中得到高水平的可溶性表达,如图 2(a)所示。经12%的SDS-PAGE电泳显示,L-TD的蛋白质分子质量约为56kDa,与理论值相符。以L-苏氨酸为底物检测L-TD的酶活,在测定条件下,酶活为9U/mg酶粉。
重组质粒pET21a-leudh和pET21a-kred经测序验证无突变,分别转入E. coli BL21(DE3) 中,0.1mmol/L IPTG诱导过夜后,LeuDH和KRED均成功在E. coli中可溶性表达,如图 2中所示。SDS-PAGE电泳图中LeuDH和KRED的蛋白质分子质量分别约为40kDa和30kDa,与从氨基酸序列计算的值一致。以2-丁酮酸为底物检测LeuDH的酶活,在测定条件下,酶活为0.6U/mg酶粉;以异丙醇为底物检测KRED的酶活,在测定条件下,酶活为0.04U/mg酶粉。
2.2 催化合成L-2-氨基丁酸的反应条件优化 2.2.1 pH对催化反应的影响在多酶反应体系中,pH是影响催化反应的一个重要因素,其影响酶蛋白的构型、稳定性和底物的解离状态。前期研究结果表明,来源于E. coli的L-TD催化反应的最适pH为7.0[18],来源于Geobacillus stearothermophilus的LeuDH的最适pH为7.5~9.0[19-20],来源于Novosphingobium aromaticivorans的KRED的最适pH为7.5~8.0[15]。由于一锅法催化反应中同时涉及3种酶,有必要对催化反应的最适pH进行探索。为此在其他反应条件不变的情况下,只改变反应pH,考察pH对催化反应的影响,结果如图 3所示。在pH 7.5~8.0时,L-2-氨基丁酸的产率可达到99%。当pH为6.5时,L-2-氨基丁酸的产率显著下降,底物L-苏氨酸及中间体2-丁酮酸均有剩余,如图 3(c)、(d)所示。这说明在该pH条件下,无论是L-TD还是LeuDH及KRED酶活都有所降低,该结果与苏金环等[12]报道的偶联基于甲酸脱氢酶的NADH再生系统合成L-2-氨基丁酸的结果类似。而当pH为7.0时,底物L-苏氨酸无累积,但是中间体2-丁酮酸有累积,这表明LeuDH和KRED在该pH条件下不能有效发挥作用。因此,选择pH 7.5~8.0进行催化反应。
2.2.2 L-苏氨酸浓度对催化反应的影响如图 4所示,随着底物L-苏氨酸的浓度增加,L-2-氨基丁酸的产率逐步降低。当L-苏氨酸的浓度增加至100g/L时,底物L-苏氨酸无剩余,而中间体2-丁酮酸累积严重,导致L-2-氨基丁酸的产率降低,这表明此时中间体2-丁酮酸的累积可能会抑制LeuDH和KRED的活性,使得第二步反应成为限速步骤;当L-苏氨酸的浓度增加至120g/L时,底物L-苏氨酸有少量剩余,同时中间体2-丁酮酸累积更为严重,导致L-2-氨基丁酸的产率进一步降低,这表明高浓度的L-苏氨酸使L-TD的活性受到抑制,降低了其催化效率,而严重累积的中间体2-丁酮酸则抑制了LeuDH和KRED的活性。
2.2.3 异丙醇浓度对催化反应的影响在催化反应的第二步中,辅因子循环通过KRED催化、以异丙醇为底物实现,辅因子能否顺利循环决定了催化反应是否能顺利进行。在NADH再生体系中,通常需要大于底物摩尔当量的还原剂(甲酸盐、葡萄糖、异丙醇)以保证底物尽可能实现完全转化[15]。因此,在本研究反应体系中,异丙醇用量要大于底物摩尔当量。如图 5所示,当异丙醇浓度较低(如0.5%和1%)时,由于低浓度的异丙醇会导致NADH再生受限,使得第二步反应成为限速步骤,从而导致L-2-氨基丁酸的产率较低。此外,中间体2-丁酮酸积累严重,抑制了LeuDH和KRED的活性。当异丙醇浓度为5%时,L-2-氨基丁酸的产率可达99%。当异丙醇浓度进一步增加至10%时,底物L-苏氨酸大量剩余[图 5(c)],而在整个反应期间中间体2-丁酮酸无任何累积[图 5(d)],这说明当异丙醇浓度为10%时,第一步反应受到抑制,可能是因为高浓度的异丙醇使L-TD失活,从而影响第一步反应的转化。因此,选择5%异丙醇浓度进行催化反应。
2.3 催化反应的反应进程以50g/L L-苏氨酸为底物,在上述优化的最佳反应条件下绘制一锅法制备L-2-氨基丁酸的反应进程曲线,结果如图 6所示。反应在1h内,底物L-苏氨酸几乎完全转化为中间体2-丁酮酸,随后2-丁酮酸在LeuDH和KRED的催化下逐渐转化为终产物L-2-氨基丁酸。反应至20h基本结束,此时终产物L-2-氨基丁酸的产率大于99%;反应体系中NADH的循环次数可达600次。
3 结论L-2-氨基丁酸是一种重要的手性中间体,在医药行业具有广泛的应用。本文研究了利用在E. coli中重组表达的L-TD和LeuDH,并偶联基于KRED的NADH再生系统,通过一锅法合成L-2-氨基丁酸。通过实验确定催化反应的最适pH为7.5~8.0,底物L-苏氨酸的适宜浓度为50g/L,异丙醇的最适添加量为5%。在30℃下,通过加入0.6g/L苏氨酸脱氨酶、2g/L亮氨酸脱氢酶及2g/L酮还原酶,反应20h,实现了L-2-氨基丁酸的摩尔产率为99%,产量为43g/L。本研究为生物催化制备L-2-氨基丁酸提供了一种新的思路,也为其工业化生产提供了直接的实验数据支持。
致谢 本项目得到“深圳市博大生物技术有限公司-中国科学院天津工业生物技术研究所生物医药关键中间体联合实验室”的资金支持。[1] | 张世和, 白国义. 乙胺丁醇的合成研究进展. 精细与专用化学品, 2005, 13(8) : 13–15. Zhang S H, Bai G Y. Progress on synthesis of ethambutol. Fine and Specialty Chemicals, 2005, 13(8) : 13–15. |
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