中国生物工程杂志  2017, Vol. 37 Issue (1): 46-52

文章信息

谢喜珍, 林娟, 谢勇, 叶秀云.
XIE Xi-zhen, LIN Juan, XIE Yong, YE Xiu-yun.
海洋来源琼胶酶的分离纯化及酶学性质研究
Separation and Purification of Agarase and Study on Its Properties
中国生物工程杂志, 2017, 37(1): 46-52
China Biotechnology, 2017, 37(1): 46-52
http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20170107

文章历史

收稿日期: 2016-07-18
修回日期: 2016-09-02
海洋来源琼胶酶的分离纯化及酶学性质研究
谢喜珍 , 林娟 , 谢勇 , 叶秀云     
福州大学 福建省海洋酶工程重点实验室 福州 350116
摘要: 采用Vibiro sp.ZC-1发酵制备琼胶酶,粗酶液经过中空纤维柱浓缩、硫酸铵沉淀、DEAE-阴离子交换层析,得到一个电泳纯的琼胶酶组分AgaZC-1,其分子质量约为45kDa,比活力为114.613U/mg。对AgaZC-1进行酶学性质分析,结果表明,其最适反应pH为7.0,在pH为5.0~9.0时保温1h仍能保持80%以上的酶活力;最适反应温度为50℃,在45℃条件下保温1h酶活力保持在60%以上。在高浓度(5mmol/L)下,Fe3+、Cu2+、Sn2+和Zn2+能完全抑制琼胶酶的活性,在低浓度(1mmol/L)下,Cu2+、Ba2+、Na+、Zn2+、Ag+、Sr3+、K+对琼胶酶活性具有明显抑制作用。琼胶酶的动力学参数KmVmax分别为0.538mg/ml和6.33μmol/(L·min),对琼胶底物具有高度专一性,降解产物主要为新琼四糖和新琼六糖。
关键词: 琼胶酶     Vibiro sp.     分离纯化     酶学性质    
Separation and Purification of Agarase and Study on Its Properties
XIE Xi-zhen , LIN Juan , XIE Yong , YE Xiu-yun     
Fujian Provincial Key Laboratory of Marine Enzyme Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350116, China
Abstract: Agarase was fermented with Vibrio sp. ZC-1, and separated through hollow fiber concentration, ammonium sulfate precipitation and DEAE-anion exchange chromatography. A pure AgaZC-1 detected by SDS-PAGE was obtained. Its relative molecular mass and specific activity was about 45kDa and 114.613U/mg, respectively. Furthermore, the enzymatic properties of AgaZC-1 were studied. The results showed that the optimum pH was 7. It was stable in the range of 5.0 to 9.0 and could maintain more than 80% of its relative enzyme activity after incubation for 1 hour. The optimal reaction temperature was 50℃ and 60% of enzyme activity was remained after incubation for 1 hour under 45℃. At high concentrations (5mmol/L), Fe3+, Cu2+, Sn2+ and Zn2+ could completely inhibit the enzyme activity. While at low concentrations (1mmol/L), Cu2+, Ba2+, Na+, Zn2+, Ag+, Sr3+ and K+ had obvious inhibition on enzyme activity. The Km and Vmax of AgaZC-1 was 0.538mg/ml and 6.33μmol/(L·min), respectively. It was highly specific for agar and the hydrolysates were neoagarotetraose and neoagarohexaose analyzed by TLC.
Key words: Agarase     Vibiro sp.     Separation and purification     Enzymatic properties    

琼胶(agar)广泛存在于江蓠、石花菜等红藻细胞壁中,是世界上用途最广的三大海藻胶之一。琼胶由琼脂糖和硫琼胶组成,其中琼脂糖是主要成分,由(1-3)-O-β-D-半乳糖和(1-4)-O-3,6-内醚-α-L-半乳糖交替组成的线形链状分子,在凝胶状态下呈类似DNA分子的双螺旋结构[1];而硫琼胶则由长短不一的半乳糖残基多糖链构成。

琼胶在科研及工业应用中常作为微生物或细胞培养基的载体,广泛应用于组织、病毒培养及癌症的研究等[2-3]。琼胶酶是特异性降解琼胶的酶系,主要来源于海洋微生物、藻类的附生微生物以及一些海洋软体动物的寄生微生物,它可用于降解海藻制备单细胞或原生质体,也可用来酶解多种海藻多糖制备琼胶寡糖。琼胶寡糖具有抗敏、抗炎、抗肿瘤等生理活性,使其在食品、化妆品、医药等工业领域具有重要的应用价值[4-6],而作为琼胶的降解酶,琼胶酶引起了国内外学者的关注[7]。但是目前,微生物产琼胶酶能力普遍较低,以及酶学性质不稳定等原因,限制了琼胶酶的开发应用。本文利用Vibiro sp. ZC-1发酵制备琼胶酶,并对其进行分离纯化和酶学性质研究,为琼胶酶的生产和应用打下基础。

1 材料与方法 1.1 材 料

1.1.1 菌株来源

Vibiro sp. ZC-1为福建省海洋酶工程重点实验室从福建南日岛紫菜中筛选获得。

1.1.2 主要试剂

琼胶(生化纯)购于上海生工生物工程有限公司;D-半乳糖购自国药集团化学试剂有限公司;蛋白胨(tryptone)、酵母提取物(yeast extract)购于英国Oxoid公司;新琼寡糖标准品购于青岛博智生物科技有限公司;其它试剂均为国产分析纯。

1.1.3 主要仪器设备

隔水式恒温培养箱(SHP-250型,上海精宏实验设备有限公司),高压蒸汽灭菌锅(YXQ-LS-100SII型,上海博迅实业有限公司),超净工作台(SW-CJ-2FI类B型,上海博迅实业有限公司医疗设备厂),pH计(UB-7型,Denver Instrument),可见分光光度计(752N型,上海精密科学仪器有限公司),高速冷冻离心机(CF16RXⅡ型,日本Hitachi公司),磁力搅拌器(Jan-78型,江苏省金坛市环宇科学仪器厂),中空纤维柱(KA 48-51型,厦门膜天膜有限公司),蠕动泵(BT100S-1,雷弗),酶标仪(03691-C型,美国Thermo Fisher Scientific公司),AKTA pure system H8(29-2827-26型,瑞典GE Healthcare公司),气热式恒温摇床(THZ-052型,SHAKER公司),蛋白质电泳仪(AE-8150型,日本Atto公司),凝胶成像系统(JS-680型,上海培清科技有限公司)。

1.1.4 培养基

人工海水:NaCl 26.5g、MgSO4·7H2O 4.2g、MgCl2·6H2O 2.1g、CaCl2·H2O 1.2g、KCl 0.9g,蒸馏水定容至1 000ml。

2216E培养基[8]:蛋白胨5.0g、酵母膏1.0g、FeCl3·6H2O 0.018g,人工海水定容至1 000ml,调节pH至7.2~7.4,固体时添加2%琼脂粉。

发酵培养基:琼脂2g、蛋白胨5.0g、酵母浸膏1.0g、FeCl3·6H2O 0.018g,人工海水定容至1 000ml,调节pH至7.0~7.2。

1.1.5 常用试剂的配制

DNS试剂[9]:将182g酒石酸钾钠溶于500ml热水中,加入16g氢氧化钠,搅拌溶解,再入3,5-二硝基水杨酸5.0g、结晶酚5.0g和亚硫酸钠5.0g,不断搅拌,直到加入的物质完全溶解,蒸馏水定容至1 000ml,储存于棕色瓶中,避光保存,室温下放置7天后使用。

考马斯亮蓝G250:称取考马斯亮蓝G250 100mg溶于50ml 95%(V/V)乙醇中,加入100ml 85%磷酸,用蒸馏水稀释至1 000ml,过滤后备用。

5×蛋白质电泳缓冲液:Tris 15.1g、甘氨酸94g、SDS 5g、用蒸馏水定容至1 000ml,使用时用蒸馏水稀释5倍。

5×蛋白质上样缓冲液:0.25mol/L Tris-HCl(pH6.8)、5%β-巯基乙醇、10% SDS、0.5%溴酚蓝、50%甘油。

10% SDS(m/V):SDS 10g溶解于80ml蒸馏水,60℃水浴溶解,待冷却后用蒸馏水定容至100ml。

30%丙烯酰胺溶液:丙烯酰胺290g,N,N′-亚甲叉丙烯酰10g,用蒸馏水溶解定容到1 000ml,0.45μm滤膜过滤,4℃避光保存。

考马斯亮蓝染色液:1g考马斯亮蓝R250溶解于250ml异丙醇后再加入100ml冰乙酸,蒸馏水定容到1 000ml,用Watman 1号滤纸过滤后备用。

脱色液:冰乙酸100ml,乙醇50ml,蒸馏水850ml。

展开剂:正丁醇20ml,乙酸20ml,蒸馏水10ml。

显色剂:苯胺2ml,二苯胺2g、磷酸10ml,溶解于100ml丙酮。

1.2 实验方法

1.2.1 Vibiro sp. ZC-1粗酶液的制备

Vibiro sp. ZC-1在2216E平板上划线活化,30℃培养24h,用接种环挑取单菌落接入2216E液体培养基中过夜培养,按1.5%(V/V)接种量转接至发酵培养基,在30℃、200r/min条件下培养24h,取发酵液10 000r/min离心15min,取上清液采用DNS法测定琼胶酶活力。

1.2.2 D-半乳糖标准曲线绘制

以D-半乳糖标准品配制不同浓度的D-半乳糖溶液,准确移取1ml于40℃下反应15min后加入1.5ml DNS煮沸显色5min,用冷水冷却至室温,于540nm下测定吸光值(即OD540),绘制D-半乳糖标准曲线。

1.2.3 琼胶酶活力测定

参照Kirimura等[10]和马芮萍等[11]的方法,采用DNS(3,5-二硝基水杨酸)法测定琼胶酶活力。取0.1ml酶液于试管中,加入0.9ml 0.2%琼胶底物,于40℃下水浴反应15min后,加入1.5ml DNS并煮沸5min显色;以加入灭活酶液作为空白组,在相同条件下反应,测定OD540,根据D-半乳糖标准曲线,依式(1)计算还原糖含量。

酶活力单位定义为:1min催化底物产生1μmol还原糖所需的酶量作为一个酶活力单位(U)。

$\frac{{(\Delta A - b) \times 1{\text{ }}000 \times n/180}}{{a \times V \times t}}$ (1)

其中,ΔA为实验组和空白组OD540的差值;b为截距;n为酶液的稀释倍数;t为酶反应时间;a为标准曲线的斜率;V为样品的反应体积。

1.2.4 琼胶酶比活力测定

以牛血清蛋白(BSA)标准品配制不同浓度的BSA溶液,加入5ml考马斯亮蓝G250,室温下静置5min后测定OD595[12-13],绘制蛋白质含量标准曲线。

加入0.9ml蒸馏水、0.1ml酶液和5ml考马斯亮蓝G250试剂于试管中,充分混匀后静置5min测定OD595,根据标准曲线计算待测酶液的蛋白质含量,计算比活力(酶活力/蛋白质含量)。

比活力定义为:每毫升酶蛋白所具有的酶活力单位数,单位U/mg。

1.2.5 琼胶酶的分离纯化

粗酶液经中空纤维柱浓缩后进行硫酸铵分级沉降[14],用适量pH7.0 Tris-HCl缓冲液溶解,透析48h收集酶液,用超滤离心管浓缩,并经0.45μm滤膜过滤,用DEAE-阴离子交换柱[15]分离(流速1ml/min,NaCl洗脱梯度为0%~60%),收集洗脱液测定酶活,SDS-PAGE检测纯度。

1.2.6 琼胶酶酶学性质研究

(1) 最适反应pH。在40℃条件下,分别测定琼胶酶在不同pH下的活力,以酶活力最高者为100%,计算其相对酶活力,确定最适反应pH。

(2) 最适反应温度。在最适pH条件下,分别测定琼胶酶在不同温度下的活力,以酶活力最高者为100%,计算其相对酶活力,确定最适反应温度。

(3) pH稳定性。将琼胶酶在不同pH缓冲液中37℃保温1h,在最适反应条件(pH7.0,40℃)下测定其活力,以未处理的酶液酶活力定义为100%,计算各pH下相对酶活力。

(4) 温度稳定性。将琼胶酶分别置于不同温度下保温一定时间后在最适反应条件下测定其琼胶酶活力,以未处理的酶液酶活力定义为100%,计算各温度下琼胶酶的相对酶活力。

(5) 金属离子和化学试剂对琼胶酶活性的影响。在最适反应条件下测定不同终浓度(1mmol/L和5mmol/L)的金属离子(Na+、Ca2+、K+、Co+、Cr3+、Li+、Cu2+、Mg2+、Ni2+、Fe2+、Fe3+、Sn2+、Mn2+、Hg2+、Ag+、Zn2+、Ba2+)和化学试剂(EDTA、SDS)对琼胶酶活性的影响,以相同条件下不加金属离子和化学试剂的酶促反应为空白对照。

(6) 动力学参数KmVmax的测定。分别以不同浓度的琼胶(0.05%、0.08%、0.1%、0.15%、0.2%和0.3%)为底物,在最适条件下测定琼胶酶活力,计算反应速率,以琼胶浓度的倒数为横坐标,反应速率的倒数为纵坐标,利用Lineweaver-Burk法[16-17]求得KmVmax值。

2 结果与分析 2.1 琼胶酶粗酶液的SDS-PAGE电泳分析

采用Vibiro sp.ZC-1发酵制备琼胶酶,发酵液离心去除菌体,粗酶液经中空纤维柱浓缩、硫酸铵沉淀后,进行SDS-PAGE电泳分析,可以看出粗酶液的分子质量主要分布在45~116kDa(图 1)。

图 1 粗酶液的SDS-PAGE电泳分析 Figure 1 SDS-PAGE analyses of crude agarase Lane M:Marker;Lane 1:Crude enzyme;Lane 2:Enzyme solution after ammonium sulfate precipitation
2.2 DEAE-阴离子交换层析分离

将经过硫酸铵沉淀、透析后的酶液用DEAE-阴离子交换柱分离纯化,收集洗脱液测定琼胶酶活力,其中第18号、19号、20号管酶活力较高(表 1),SDS-PAGE电泳分析结果表明,经过DEAE-阴离子交换层析后得到的琼胶酶AgaZC-1已达到电泳纯,其分子质量约为45kDa(图 2)。

表 1 不同收集管琼胶酶活力测定 Table 1 Agarase activity of different collecting tubes
管号181920
酶活(U/ml)0.3950.9131.322

图 2 不同收集管的SDS-PAGE电泳分析 Figure 2 SDS-PAGE analyses of different collecting tubes Lane M:Marker;Lane 1:Enzyme of No.18 collecting tube;Lane 2:Enzyme of No.19 collecting tube; Lane 3:Enzyme of No.20 collecting tube
2.3 纯度分析

分别测定粗酶液以及各分离步骤酶液的活力与蛋白质含量,计算比活力和纯度,结果如表 2所示。可以看出,经过硫酸铵沉淀、DEAE-阴离子交换层析纯化后的琼胶酶AgaZC-1比活力为114.613U/mg,纯度较纯化前提高了18.156倍。

表 2 琼胶酶的分离纯化及纯度分析 Table 2 Separation and purity analysis of agarase
纯化步骤总体积
(ml)
蛋白质
(mg/ml)
蛋白质量
(mg)
酶活力
(U/ml)
总活力
(U)
比活力
(U/mg)
纯化倍数
粗酶液2500.360902.154538.55.9831
硫酸铵沉淀80.1431.1441.1779.4168.2311.376
DEAE-阴离子交换层析120.1061.27212.149145.788114.61319.156

2.4 AgaZC-1酶学性质研究

2.4.1 最适反应pH和pH稳定性

在pH4.0~7.0,AgaZC-1活力随pH上升而增加,在pH7.0达到最大值,之后酶活力持续下降;确定AgaZC-1的最适反应pH为7.0(图 3)。pH稳定性实验结果表明(图 4),AgaZC-1具有较好的pH稳定性,在pH5.0~9.0保温1h仍能保持80%以上的酶活力。

图 3 最适反应pH Figure 3 Optimal pH of AgaZC-1
图 4 pH稳定性实验 Figure 4 pH stability of AgaZC-1

2.4.2 最适反应温度和热稳定性

AgaZC-1的最适反应温度为50℃,且在45~60℃时相对酶活维持在81%以上(图 5)。热稳定性实验显示(图 6),在40℃条件下保温60min,相对酶活保持在80.59%;在45℃保温30min,相对酶活保持在67.33%;当温度超过65℃时,酶活力迅速下降。

图 5 最适反应温度 Figure 5 Optimal pH of AgaZC-1
图 6 热稳定实验 Figure 6 Temperature stability of AgaZC-1

2.4.3 金属离子及化学试剂对AgaZC-1活力的影响

在高浓度(5mmol/L)下,Fe3+、Cu2+、Sn2+和Zn2+完全抑制AgaZC-1的活性,Co+、Cr3+、Mn2+、Ag+和SDS也具有明显的抑制作用,而Mg2+和Li+则具有微弱的促进作用;在低浓度(1mmol/L)下,Cu2+、Ba2+、Na+、Zn2+、Ag+、Sr3+、K+对AgaZC-1的活性具有明显抑制作用,SDS则具有一定的促进作用。

2.4.4 AgaZC-1的底物特异性

分别以0.2%(m/V)的琼胶、褐藻胶和卡拉胶为底物,在最适条件(pH 7.0,40℃)下测定AgaZC-1活力(表 4)。可以看出,该酶对琼胶具有高度专一性,但对褐藻胶和卡拉胶底物也具有一定的水解能力。

表 3 不同金属离子及化学试剂对AgaZC-1活性的影响 Table 3 Effect of different metal ions and chemicals on AgaZC-1 activity
Chemicals Relative activity(%) ChemicalsRelative activity(%)
1mmol/L5mmol/L1mmol/L5mmol/L
100.00100.00
Fe3+59.37±8.080.00Li+ 100.57±4.31104.65±5.42
Co+83.50±2.3550.69±0.90Ba2+52.28±2.04102.40±4.11
Cu2+25.79±2.610.00Na+ 53.55±0.2493.60±5.07
Ni2+93.77±0.2296.33±1.11Zn2+16.10±0.770.00
Cr3+79.79±4.239.29±8.83Ag+ 50.81±3.9274.00±1.52
Mg2+94.42±0.94111.33±2.71Sr3+52.04±1.8198.25±5.73
Sn2+87.16±1.530.00K+54.93±2.33101.30±1.55
Mn2+91.89±1.0451.79±2.02SDS 108.84±7.1474.04±3.01
Ag+95.80±1.6798.86±4.23 EDTA95.15±0.0790.79±1.40

表 4 琼胶酶的底物特异性 Table 4 Substrates specificity of AgaZC-1
底物相对酶活力(%)
琼胶100.0±0.14
褐藻胶33.58±1.22
卡拉胶29.57±6.51

2.4.5 AgaZC-1降解产物分析

采用薄层色谱(TLC)分析AgaZC-1降解产物[18],可以看出其主要产物为新琼四糖及新琼六糖(图 7)。

图 7 琼胶酶降解产物分析 Figure 7 Analysis of enzymatic hydrolysates Lane M: Standard samples;Lane 1:Enzymatic hydrolysates

2.4.6 琼胶酶的KmVmax

米氏常数Km值是酶促反应的特征常数,表示酶与底物的亲和能力大小,Km值越小,则酶与底物结合能力越强。以不同浓度的琼胶为底物测定AgaZC-1活力,利用Linewaeaver-Burk作图法求得Vmax为6.33μmol/(L·min)、Km为0.538mg/ml,小于已报道的琼胶酶Km值。例如,Liu等[19]报道的AgWH50A 其Km为5.97mg/ml,董素洁[7]得到的YM01-3其Km为3.78mg/ml。可见,该琼胶酶与底物具有较强的结合能力。

3 结 语

本文采用Vibiro sp.ZC-1发酵制备琼胶酶,并采用中空纤维柱浓缩、硫酸铵沉淀、DEAE-阴离子交换层析等方法对粗酶液进行分离纯化,得到电泳纯的琼胶酶组分AgaZC-1,其分子质量约为45kDa,与粗酶液相比纯度提高了18.156倍。

对纯化后的AgaZC-1进行酶学性质分析,结果表明,该酶最适反应pH为7.0,为中性琼胶酶,这与Agarivorans sp. HZ105来源的rHZ2[20]Saccharophagus degradans 2-40来源的Aga50D[21]一样;但与近几年已报道的琼胶酶pH稳定性相比,AgaZC-1具有较宽的pH稳定范围,在pH5.0~9.0条件下存放1h仍能保持80%以上的酶活力。据报道,马芮萍等[11]Stenotrophomonas sp.中得到的琼胶酶的pH稳定范围为7.0~9.0;尹群健等[22]得到的琼胶酶在pH6.5~8.0较稳定;Liu等[19]得到的来源于Agarivorans gilvus WH0801的β-agarase(AgWH50C)最适pH为6.0,当pH为7.0时其剩余酶活力只有28%,而当pH为5.0时就几乎完全失活。

AgaZC-1的最适反应温度为50℃,在45℃~60℃其相对酶活维持在81%以上,在45℃保温30min,相对酶活保持在67.33%以上。目前已报道的只有少数琼胶酶最适反应温度能达到50℃。琼胶的凝胶温度一般在43℃~45℃,而AgaZC-1的最适反应温度为50℃,且具有较好的耐热性和pH稳定性,可以避免琼胶酶解过程出现的凝胶问题,具有良好的开发应用价值。

参考文献
[1] Sugano Y, Terada I, Arita M, et al. Purification and characterization of a new agarase from a marine bacterium, Vibrio sp. strain JT0107. Applied & Environmental Microbiology , 1993, 59 (5) : 1549–54.
[2] 刘江涛, 蔡俊鹏, 吴冰. 琼胶酶及其综合应用的研究概况. 现代食品科技 , 2005, 21 (1) : 177–179. Liu J T, Cai J P, Wu B. Progress of studies on agarase and its applications. Modern Food Science and Technology , 2005, 21 (1) : 177–179.
[3] 马翠萍, 石超. 琼胶酶研究进展. 微生物学通报 , 2008, 35 (1) : 107–111. Ma C P, Shi C. Advance in research of agarase. Microbiology , 2008, 35 (1) : 107–111.
[4] 陈海敏, 严小军, 王峰, 等. 琼胶寡糖抑制血管形成作用的研究. 营养学报 , 2007, 29 (4) : 405–407. Chen H M, Yan X J, Wang F, et al. Study on the ant I-ang I Ogen l C role of agaro-OL l gosacchar l DE. Acta Nutrimenta Sinica , 2007, 29 (4) : 405–407.
[5] 刘美英, 梅建凤, 易喻, 等. 琼胶寡糖生物活性的研究进展. 药物生物技术 , 2008, 15 (6) : 493–496. Liu M Y, Mei J F, Yi Y, et al. Advances in study on biological activities of agaro-oligosaccharide. Chin J Pharm Biotec , 2008, 15 (6) : 493–496.
[6] 刘刚. 琼胶寡糖的制备及生物活性研究. 上海:上海海洋大学,食品学院 , 2011 . Liu G. Preparation and Biological Activities of Agar oligosaccharides. Shanghai:Shanghai Ocean University, College of Food Science , 2011 .
[7] 董素洁. 嗜琼胶卵链菌β-琼胶酶基因YM01-3的克隆表达及酶学性质研究. 青岛:中国海洋大学, 海洋生命学院 , 2013 . Dong S J. Cloning, Expression and Characterization of β-agarase gene YM01-3 from Catenovulum agarivorans. Qingdao:Ocean University of China, College of Marine Life Science , 2013 .
[8] Azam F, Malfatti F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology , 2007, 5 (10) : 782–791. DOI:10.1038/nrmicro1747
[9] 郭彦岑. 琼胶酶高产细菌的筛选鉴定、产酶条件和酶活性分析. 海口:海南大学, 海洋学院 , 2013 . Guo Y C. Isolation and Identification of Agarase-Producing Bacteria,Conditions for Production of Enzyme and Analysis of Enzyme Activities. Haikou:Hainan University, College of Oean , 2013 .
[10] Kirimura K, Masuda N, Iwasaki Y, et al. Purification and characterization of a novel β-agarase from an alkalophylic bacterium. Alteromonas sp. E-. Journal of Bioscience & Bioengineering , 1999, 87 (4) : 436–441.
[11] 马芮萍, 朱艳冰, 倪辉, 等. 一株产琼胶酶细菌的分离、鉴定及其琼胶酶基本性质. 微生物学报 , 2014, 54 (5) : 543–551. Ma R P, Zhu Y B, Ni H, et al. Isolation, identification andcharacterization of an agarase-producing marine bacteria l strain Stenotropphomonas sp. NTa. Acta Microbiologica Sinica, , 2014, 54 (5) : 543–551.
[12] 田鑫, 汪之和, 施文正, 等. 南极磷虾体内胰蛋白酶的纯化及性质研究. 上海海洋大学学报 , 2014, 23 (5) : 741–747. Tian X, Wang Z H, Shi W Z, et al. Purification and characterization of serine proteinase from Euphausia superba. Journal of Shanghai Ocean University , 2014, 23 (5) : 741–747.
[13] 杨刚刚, 马诚凯, 史世会, 等. 豹蛙抗瘤酶与人血清白蛋白融合蛋白的毕赤酵母高效表达与活性测定. 生物技术通报 , 2015, 31 (10) : 222–229. Yang G G, Ma C K, Shi S H, et al. Efficient expression and biological activity detection of fusion protein of onconase with human serum albumin in Pichia pastoris. Biotechnology Bulletin , 2015, 31 (10) : 222–229.
[14] Shen P,Chen X D.Microbiology Experiment. 4th Edition. Beijing:Higher Education Press,2007.
[15] 王孝平, 邢树礼. 考马斯亮蓝法测定蛋白含量的研究. 天津化工 , 2009, 23 (3) : 40–42. Wang X P, Xing S L. Determination of protein guantitation using the method of coomassie brilliant blue. Tianjin Chemical Industry , 2009, 23 (3) : 40–42.
[16] 许鑫琦, 任跃明, 马素娟, 等. 发酵产物对灰绿曲霉β-葡萄糖苷酶活力的影响. 厦门大学学报:自然科学版 , 2014, 53 (1) : 115–119. Xu X Q, Ren Y M, Ma S J, et al. Effects of fermentation products on glucosidase from Aspergillus glaucus. Journal of Xiamen University(Natural Science) , 2014, 53 (1) : 115–119.
[17] Kendall K, Cullum J. Cloning and expression of an extracellular-agarase gene from Streptomyces coelicolor A3(2) in Streptomyces lividans 66. Gene , 1984, 29 (3) : 315–21. DOI:10.1016/0378-1119(84)90060-X
[18] Rouser G, Siakotos A N, Fleischer S. Quantitative analysis of phospholipids by thin-layer chromatography and phosphorus analysis of spots. Lipids , 1966, 1 (1) : 85–86. DOI:10.1007/BF02668129
[19] Liu N, Mao X Z, Du Z J, et al. Cloning and characterisation of a novel neoagarotetraose-forming-β-agarase, AgWH50A from Agarivorans gilvus, WH0801. Carbohydrate Research , 2014, 388 (1) : 147–151.
[20] Lin B, Lu G, Zheng Y, et al. Gene cloning, expression and characterization of a neoagarotetraose-producing β-agarase from the marine bacterium Agarivorans sp. HZ105. World Journal of Microbiology & Biotechnology , 2012, 28 (4) : 1691–1697.
[21] Hee T K, Saeyoung L, Dongho L,et al. Overexpression and molecular characterization of Aga50D from Saccharophagus degradans 2-40:an exo-type β-agarase producing neoagarobiose//Electronic Components & Technology Conference. 2010,86(1):1105-1109.
[22] 尹群健, 陈潇骁, 杨宏胜, 等. 产琼胶酶菌株发酵条件优化及酶学特性. 食品工业 , 2014, 35 (9) : 83–87. Ying Q J, Chen X X, Yang H S, et al. Fermentation conditions optimization for agarase-producing strain and the enzymatic properties. The Food Industry , 2014, 35 (9) : 83–87.