文章信息
- 张震阳, 杨艳坤, 战春君, 李翔, 刘秀霞, 白仲虎.
- ZHANG Zhen-yang, YANG Yan-kun, ZHAN Chun-jun, LI Xiang, LIU Xiu-xia, BAI Zhong-hu.
- Pichia pastoris X-33 ΔGT2缓解甘油对AOX1的阻遏并用于外源蛋白的高效表达
- Pichia pastoris X-33 ΔGT2 Release the Glycerol Repression on AOX1 and Ef-ficiently Express Heterologous Proteins
- 中国生物工程杂志, 2017, 37(1): 38-45
- China Biotechnology, 2017, 37(1): 38-45
- http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20170106
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文章历史
- 收稿日期: 2016-10-11
- 修回日期: 2016-11-12
2. 江南大学 工业生物技术教育部重点实验室 无锡 214122;
3. 江南大学 糖化学与生物技术教育部重点实验室 无锡 214122
2. The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China;
3. The Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris,P. pastoris)作为最广泛使用、研究最多的真核表达系统之一[1],具有生长速率快、发酵周期短、基因组简单、成本低、便于操作[2];在蛋白质表达方面有着独特的优势:培养条件相对简单,且易于进行高密度培养,进而可以获得较高的目的蛋白产量[3]; 对外源蛋白可以进行折叠、糖基化修饰、形成二硫键等,修饰后的蛋白质有着类似天然产物的活性[4];自身分泌蛋白质较少,易于后期纯化[5]的特点。目前,疫苗[6]、抗体[7]、酶制剂[8].等已有近1 000种蛋白质利用该表达系统成功表达[9]。P. pastoris能利用甲醇为唯一碳源生长,醇氧化酶alcohol oxidase 1(AOX1)是甲醇代谢的第一个关键酶,依靠其强启动子PAOX1能高效诱导外源基因的表达。PAOX1严格受甲醇的诱导调控[10],但是,葡萄糖、甘油、乙醇等碳源能阻遏AOX1启动子的转录,从而抑制外源基因的表达[11-12]。当用甘油作为碳源时,酵母细胞能在短时间内高密度发酵,在诱导阶段,甲醇为唯一碳源,甲醇作为细胞的碳源、能源、诱导剂,很难找到合适的甲醇水平既能高效诱导蛋白质表达又能促进细胞高密度生长[13]。诱导阶段甲醇往往用量很大,然而甲醇及其代谢产物如甲醛等对细胞有毒害作用[14]。另外,代谢甲醇需要大量的氧气,工业生产中经常使用纯氧,这就带来了安全隐患[15]。有研究表明,在甲醇诱导阶段,添加其他碳源能缩短细胞适应甲醇的时间,从而把有害的代谢中间产物排除体外,比单纯的甲醇诱导表达的蛋白质量高[16-17],但是,该方法通过提高细胞浓度从而提高蛋白质总产量,却忽略了单位蛋白质产率[18]。
我们发现了一个与甘油阻遏相关的基因(PAS_chr3_1076),通过Blast发现,该基因有可能是甘油转运体(glycerol proton symporter of the plasma membrane)家族中的一员,命名为glycerol transporter 2 (GT2)。基于此,我们构建了一株工程菌株P. pastoris X-33 ΔGT2 (简称为ΔGT2),该菌株能在甘油甲醇混合培养基中获得一定的组成型表达,即一定程度上解除了甘油对AOX1表达的抑制。利用该菌株的表达系统在甲醇和甘油作为混合碳源的培养基中表达目的蛋白,这将会极大地克服传统表达体系的缺陷,使其更加广泛的应用于工业生产和基础研究中。
1 材料与方法 1.1 材 料 1.1.1 仪器和试剂LA Taq DNA聚合酶、内切酶(EcoR I、Xho I、Sac I)、T4 DNA连接酶、卡那霉素、博来霉素、G418抗生素(上海生工生物工程公司),分光光度计(上海美诺达仪器有限公司),凝胶成像仪,蛋白质电泳仪(北京六一仪器),PCR仪(杭州朗基科学仪器有限公司),醇氧化酶检测液(3.4U/ml辣根过氧化物酶,10mmol/L OPD,33mmol/L磷酸钾缓冲液 pH 7.5)。
1.1.2 菌株和质粒巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)X-33、pPICZB毕赤酵母表达载体、pMDTM19-T-EGFP、大肠杆菌E.coli DH5α(均由实验室保存)、pFA6a-KanMX6。
1.1.3 培养基LB培养基(酵母提取物5g/L、胰蛋白陈10g/L、NaCl 10g/L、1×105Pa灭菌20min,固体培养基添加2%琼脂粉)、LLB培养基(酵母提取物5g/L、胰蛋白陈10g/L、NaCl 5g/L、1×105 Pa灭菌20min,固体培养基添加2%琼脂粉)、BMY培养基(酵母提取物10g/L、胰蛋白陈20g/L、100ml/L磷酸钾缓冲液,pH=6.1,1×105 Pa灭菌20min,无菌酵母无氨基酸氮源YNB 13.4g/L,无菌生物素0.4mg/L,碳源按照实验要求后续添加)、YPD培养基(酵母提取物10g/L、胰蛋白20g/L、葡萄糖20g/L、115℃灭菌30min,固体培养基添加2%琼脂粉)。
1.1.4 引物通过NCBI数据库报道的P.pastoris PAS_chr3_1076(glycerol proton symporter of the plasma membrane)基因序列设计上下游同源臂片段引物GT2upF、GT2upR、GT2downF、GT2downR;根据质粒pFA6a-KanMX6上Kan基因序列设计引物KanF和KanR,扩增Kan抗性基因片段(P. pastoris表现为G418抗性);根据绿色荧光蛋白EGFP序列设计引物EGFPF和EGFPR,扩增EGFP基因。所用到的引物(表 1)由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
Primer name | Sequences(5′-3′) |
GT2upF GT2upR GT2downF GT2downR KanF KanR EGFPF EGFPR | ATTATCCAGTTTGTTGCAGGAG GCTAAACAGATCTGAATTCTTATGCATTGGAAATTTTAAAAGAGG CCATCCAGTTTAAACGGATCCTTACCAAGCTATTTGAGACTCCC TGGAACAGTAAAACTAATGCTATG TTAAAATTTCCAATGCATAAGAATTCAGATCTGTTTAGCTTGCCTG AGTCTCAAATAGCTTGGTAAGGATCCGTTTAAACTGGATGGCGGC TTACTTGTACAGCTCGTCCAT ATGGTGAGCAAGGGCGAG |
1.2 实验方法 1.2.1 培养P.pastoris细胞、提取基因组及总蛋白质参照Invitrogen公司操作手册。 1.2.2 EGFP表达载体的构建及宿主的转化
用EcoR I和Xho I将质粒pMDTM19-T-EGFP、pPICZB分别双酶切。将pMDTM19-T-EGFP酶切产物EGFP片段和表达载体pPICZB酶切产物回收纯化。用T4连接酶连接片段和质粒,得到EGFP表达载体PAOX1-EGFP,转化感受态E.coli DH5α,然后用含有博来霉素的LLB平板筛选和PCR菌落鉴定,并送苏州金唯智生物科技有限公司测序,保存测序正确的菌株。将重组质粒PAOX1-EGFP利用Sac I内切酶线性化后,电转突野生型X-33感受态,利用含有博来霉素的YPD平板筛选。挑选重组子单菌落接种于YPD液体培养基培养24h,提取基因组,用引物EGFPR、EGFPF扩增EGFP。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳,检测EGFP在P.pastoris染色体的整合情况。筛选到的重组子命名为X-EGFP。
1.2.3 敲除载体构建以X-33酵母基因组为模板,用引物GT2upF、GT2upR和GT2downF、GT2downR分别扩增出GT2基因上下游两段同源臂;以质粒pFA6a-KanMX6为模板,用引物扩增出Kan基因;再通过引物GT2upF和GT2downR把扩增出来的三条片段进行重叠PCR扩增,得到融合片段GT2up-Kan-GT2down,然后通过T4DNA连接酶连入pMDTM19-T Simple Vector,得到敲除载体pMD19-T-up-Kan-down,转化到感受态DH5α,用含有100mg/ml Amp的LB平板筛选和菌落PCR鉴定,并送苏州金唯智生物科技有限公司测序,保存测序正确的菌株。
1.2.4 敲除基因GT2将鉴定正确的菌株用含有100mg/ml Amp的LB液体培养基培养16h后,用质粒试剂盒提取质粒pMD19-T-up-Kan-down,用引物GT2upF和GT2downR扩增敲除片段up-Kan-down,将产物回收纯化。把5μg的片段电转到制备好的感受态X-EGFP,涂布到含有1mg/ml的G418抗性平板,30℃培养48h后,挑取单菌落于YPD液体培养基培养24h,提取基因组,用引物GT2upF和GT2downR验证敲除菌株,将鉴定正确的菌株命名为ΔGT2-EGFP并低温保存。
1.2.5 突变菌株和野生型酵母菌株不同碳源下的生长情况将保存于YPD平板的突变菌株ΔGT2-EGFP和野生型X-EGFP接种于YPD液体培养基进行活化,选择合适的对数期离心收集全部菌体,用无菌PBS洗三次,并重悬于含有0.5%甲醇、0.5%甘油、0.5%葡萄糖为碳源的YNB液体培养基中,在温度30℃、转速230r/min下培养48h,每隔8h取样测OD600。
1.2.6 不同碳源下突变菌株和野生菌株表达AOX1蛋白量及荧光强度按照1.2.5 的方法将菌体重悬于0.25%甘油、0.25%甘油+0.5%甲醇和0.5%甲醇为碳源的MGY液体培养基,在温度30℃、转速230r/min下培养48h,24h补充相应的碳源,从16h开始每隔8h取样保留并提取总蛋白质,经过Bradford法蛋白质定量之后进行AOX1酶活测定[19],并用多功能酶标仪和荧光显微镜测定荧光强度。
1.2.7 多功能酶标仪测定荧光强度EGFP和X-EGFP培养后的液体培养基直接用PBS(pH=7.0)稀释至OD600为1,稀释后样品取200μl至96孔板,使用荧光酶标仪检测EGFP荧光强度(激发波长488nm,发射波长505nm),并检测OD600。用不表达EGFP的野生菌株X-33作为对照去除背景干扰。
1.2.8 培养基中甘油残留量把取的样品离心(12 000r/min)10min,收集上清液,0.2μm滤膜过滤,然后超声10min。色谱条件如下:色谱柱Shim-pack SCR-101C 7.9×300mm;柱温:80℃;RID温度80℃;流速1ml/min;进样体积20μl;流动相:超纯水(抽滤脱气,超声10min),洗脱时间12min,记录出峰时间及面积,算出样品甘油含量。
2 结果与分析 2.1 EGFP表达载体的构建及宿主的转化用EcoR I和Xho I双酶切EGFP表达载体PAOX1-EGFP后用1%琼脂糖凝胶电泳,得到基因EGFP(720bp)目的条带,条带测序正确,表明目的基因EGFP已正确插入表达载体pPICZB中(图 1)。用Sac I内切酶线性化质粒PAOX1-EGFP后,电转野生型X-33感受态,涂布含有博来霉素的YPD平板筛选。挑选重组子单菌落接种于YPD液体培养基中,摇瓶培养至合适浓度,离心收集菌体,提取基因组作为模板,用引物EGFPR和EGFPF扩增基因组来鉴定,同时用表达载体PAOX1-EGFP作为阳性对照(图 2)。
2.2 敲除片段构建以X-33酵母基因组为模板,分别扩增出0.5kb的GT2基因上游片段GT2up、0.5kb的下游片段GT2down,以及以质粒pFA6a-KanMX6为模板扩增出1.4kb的Kan基因与这三条片段进行重叠PCR扩增,得到2.4kb的融合片段GT2up-Kan-GT2down。通过测序表明各序列及融合的序列均正确。
2.3 基因GT2的敲除和鉴定将融合敲除片段GT2up-Kan-GT2down电转到制备好的感受态X-EGFP酵母细胞后,与基因组中的GT2基因发生同源重组,1.4kb的Kan基因将置换掉1.7kb的GT2编码基因。没有发生同源交换的酵母细胞不含有Kan基因,不能在含有遗传霉素G418的培养基中生长。然后经过表型鉴定挑取单菌落,培养后提取基因组,用两端引物GT2upF和GT2downR进行PCR鉴定,野生型X-EGFP酵母基因组中GT2基因的大小为1 704bp,扩增产物为2.7kb;敲除菌ΔGT2-EGFP由于GT2基因被Kan基因置换掉,扩增产物为2.4kb,电泳结果和预期一样,说明已经成功敲除GT2基因。
从图 3可以看出,编号为2的菌株基因组扩增产物和构建的敲除质粒产物有相同的条带,说明已经敲除GT2基因。选取2号菌株为本研究所需的菌株。
2.4 突变菌株和野生型菌株不同碳源下的生长情况将突变菌株ΔGT2-EGFP和野生型X-EGFP酵母细胞经YPD液体培养基活化后,收集合适对数期细胞,离心去上清液,用无菌PBS冲洗三次,分别悬浮于装有含有0.5%甲醇、0.5%甘油、0.5%葡萄糖为碳源的YNB液体培养基中,初始OD=0.1,在温度30℃、转速230r/min下培养48h,每隔8h取样测OD600绘制生长曲线。从图 4~图 6中可以看出,在以葡萄糖和甲醇为唯一碳源时,ΔGT2-EGFP和野生型X-EGFP的生长情况没有差别,而在以甘油为唯一碳源时,敲除菌株生长情况从第8h开始明显低于野生菌株,说明GT2基因对P.pastoris利用甘油有一定的关系。我们推测GT2作为甘油转运体家族的一员,当GT2基因受损不能编码甘油转运蛋白时,酵母细胞对将胞外甘油运输到胞内在一定程度上受阻,从而降低了甘油代谢效率,最终导致细胞密度降低。
2.5 AOX1酶活测定突变体ΔGT2-EGFP菌株和野生型菌株X-EGFP在不同碳源诱导下AOX1的表达水平分析,从单位AOX1酶活结果来看,在以0.25%甘油为碳源时,ΔGT2-EGFP和X-EGFP均没有检测酶活;在以0.5%甲醇为碳源的MGY培养基中,ΔGT2-EGFP酶活和X-EGFP菌株中的AOX1酶活在各时间点没有差异(P>0.05);但是在以0.25%甘油+0.5%甲醇为碳源时,在各时间点有极显著性差异(P<0.01),突变体ΔGT2-EGFP菌株表达的AOX1蛋白比野生型菌株要高出近35%左右(图 7)。我们推断,对于敲除GT2基因的P. pastoris来说,在甘油甲醇双碳源情况下,可以在一定程度上解除甘油对醇氧化酶AOX1启动子PAOX1的阻遏效应,即在甘油存在的情况下,甲醇可以被利用来诱导表达AOX1蛋白。虽然在纯甲醇为唯一碳源培养基中单位OD细胞的AOX1酶活高于混合碳源,但是总OD却明显低于混合碳源[图 9(a)]。综合来看,突变体ΔGT2-EGFP菌株在甘油和甲醇混合碳源培养情况下既可以保持良好的细胞生长状态又可以充分利用甲醇诱导外源蛋白的表达。
2.6 荧光显微镜鉴定EGFP菌株ΔGT2-EGFP、X-EGFP及野生型X-33在以0.25%甘油+0.5%甲醇为碳源的MGY液体培养基培养48h后,取样并用荧光显微镜相同的曝光时间鉴定EGFP的表达情况,从图 8中看出,EGFP基因已经整合到细胞基因组中,并已成功表达,并且从单个细胞的荧光强度来看,ΔGT2-EGFP明显要比X-EGFP亮,也就是说,ΔGT2-EGFP表达EGFP蛋白量明显比X-EGFP要高,这与2.5节的结论相符。
2.7 多功能酶标仪检测EGFP表达量重组毕赤酵母表达菌株ΔGT2-EGFP和X-EGFP以不同碳源诱导表达EGFP荧光强度及生长曲线如图 9所示。从图 9(a)中可以看出,ΔGT2-EGFP和X-EGFP分别在以甲醇、甲醇甘油混合碳源的MGY培养基中的生长情况没有明显差异,在甘油为唯一碳源的培养集中野生型细胞OD高于于突变体。但是无论对于哪种细胞,当甘油存在时,细胞密度显著高于甲醇为唯一碳源的情况。
在以0.25%甘油为碳源时,ΔGT2-EGFP和X-EGFP均没有检测到荧光强度,未在图 9(b)中显示。由图 9(b)可知,在以0.5%甲醇为碳源的MGY培养基中,ΔGT2-EGFP和X-EGFP菌株中单位荧光强度在各时间点没有差异(P>0.05)。但是在以0.25%甘油+0.5%甲醇为碳源时,单位荧光强度在各时间点有极显著性差异(P<0.01),敲除菌株ΔGT2-EGFP在各个时间点的单位荧光强度均要高出野生型X-EGFP 70%左右。
同一细胞在不同碳源培养基中单位OD细胞的EGFP表达情况:无论是野生型X-EGFP细胞还是突变体ΔGT2-EGFP细胞,在甲醇为唯一碳源培养基中单位OD细胞的EGFP荧光强度均高于混合碳源。48h时,混合碳源相对于甲醇为唯一碳源时EGFP的比值:ΔGT2-EGFP细胞为66%,X-EGFP细胞为30%。
同一细胞在不同碳源培养基中EGFP总表达量情况:虽然在甲醇为唯一碳源培养基中单位OD细胞的EGFP荧光强度高于混合碳源,但是总OD却明显低于混合碳源[图 9(a)]。综合来看,突变体ΔGT2-EGFP菌株在甘油甲醇混合碳源培养情况下既可以保持良好的细胞生长状态又可以充分利用甲醇诱导外源蛋白的表达,这与2.5节的结论相符。
2.8 培养基发酵液中甘油残留量为了分析GT2缺失对细胞运输甘油的影响,液相色谱分析发酵液上清中的甘油含量(图 10),实验结果表明,HPLC分析发酵上清液中甘油含量,ΔGT2-EGFP敲除菌株上清液甘油含量高于X-EGFP野生型菌株,这说明敲除菌株运输甘油的能力受到一定程度的影响,基因GT2是一种甘油转运体,有利于细胞对甘油的吸收。
3 讨 论巴斯德毕赤酵母作为一种真核表达蛋白质系统,其最大特点是利用甲醇诱导型启动子PAOX1来表达外源蛋白,但是,该系统受到甘油的阻遏,即在甘油存在时,启动子PAOX1不会驱使其下游基因表达蛋白,这对于常用的发酵型碳源甘油来讲是一种浪费。基于此,我们发现了一个和甘油阻遏相关的基因GT2(PAS_chr3_1076),通过Blast发现,该基因有可能是甘油转运体(glycerol proton symporter of the plasma membrane)家族中的一员,通过实验发现,功能类似于汉逊酵母的己糖运载体GCR1蛋白,缺失该基因,可以使启动子MOX转录不受葡萄糖的阻遏[20]。
需要指出的是,甘油作为一种小分子碳源可以通过自由扩散和主动运输进入细胞,而且细胞膜上很可能存在多个甘油转运体[21]。通过本实验的研究发现,GT2基因确实和甘油的转运相关,并且ΔGT2突变株可以缓解甘油对甲醇代谢的抑制作用。有文献表明,甲醇调控因子1(methanol expression regulator 1,MXR1)的表达是PAOX1所必需的[22],但是GT2调控甲醇代谢的分子机制如何?细胞通过GT2调控PAOX1的信号通路中是否涉及对MXR1的调控?等一系列科学问题还需要进一步深入研究。同时,我们构建的ΔGT2突变株只在摇瓶上做了相关的实验,该菌株在更大体积的发酵罐上表达外源蛋白是否能明显缩短生产周期及总产量明显提高还需进一步的相关研究。
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