2017, Vol. 37文章信息
- 张鹤铭, 蔡楚凡, 刘杨, 甘龙站, 焦雪苗, 田永强.
- ZHANG He-ming, CAI Chu-fan, LIU Yang, GAN Long-zhan, JIAO Xue-miao, TIAN Yong-qiang.
- 人白血病抑制因子在原核细胞中的表达与纯化
- Soluble Expression of Human Leukemia Inhibitory Factor in Prokaryotic Cells and Its Purification
- 中国生物工程杂志, 2017, 37(9): 7-14
- China Biotechnology, 2017, 37(9): 7-14
- http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20170902
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文章历史
- 收稿日期: 2017-04-11
- 修回日期: 2017-06-28
2. 四川大学皮革化学与工程教育部重点实验室 成都 610065；
3. 河南大学植物逆境生物学重点实验室 开封 475001
2. Key laboratory of Leather Chemistry and engineering(Sichuan University), Ministry of Education, Chengdu 610065, China;
3. Key Laboratory of Plant Stress Biology, Henan University, Kaifeng 475001, China
白血病抑制因子[1](leukemia inhibitory factor，LIF)是一种多功能的细胞因子，对造血干细胞的存活、增殖及各种神经细胞的分化、成熟发挥着重要作用[2-3]，因其能抑制小鼠骨髓性白血病M1细胞的生长，被定性为巨噬细胞分化的诱导剂[4-5]。研究表明，LIF还具有保持胚胎干细胞(ESC)全能性的功能[6-7]，并被广泛用于多功能干细胞的培养。然而，天然状态下LIF含量微少、纯化困难、价格高昂使其研究与应用受到了极大地限制。
本文主要从hLIF蛋白结构特性出发，构建重组质粒，优化表达条件，再经简单酶切纯化即可得到纯度高活性好的重组hLIF，为hLIF后续研究提供了试验基础。
1 材料与方法 1.1 实验材料大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli)菌株DH5α、BL21(DE3)，表达载体pET32a购自Novagen公司；小鼠M1髓系白血病细胞购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)；常用的限制性内切核酸酶Kpn Ⅰ、Hind Ⅲ、连接酶试剂盒Ligation mix购自宝生物TaKaRa公司；琼脂糖、预染蛋白质Marker购自Invitrogen公司；EasySee Western Marker购自全式金生物技术公司；2-ME、IPTG、PMSF、Trizma-base、EDTA、TEMED等购自美国Sigma公司；Ampicillin、Imidazole、APS等购自上海生工生物工程有限公司；肠激酶(EK酶)为实验室自制；镍亲和层析柱(HisTrap FF crude)、强阳离子交换色谱柱(HiTrap SP HP column)、强阴离子交换色谱柱(HiTrap Q HP column)、硝酸纤维素膜(NC膜)购自美国GE公司；胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自天根生化科技公司；鼠源抗His-tag单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb)购自武汉三鹰生物技术有限公司，LumiGLO ECL检测试剂盒购自德国罗氏公司；医用X线胶片购自伊士曼柯达公司；胰蛋白胨(tryptone)、酵母提取物(Yeast extract)购自英国Oxoid公司。
1.2 试验方法 1.2.1 基因克隆hLIF基因序列来源于GenBank (NCBI Reference Sequence: NM_002309.3)，根据大肠杆菌密码子偏爱性对hLIF基因序列进行优化设计[8-10]，目的蛋白与硫氧还蛋白(thioredoxin, Trx)融合表达，以提高目的蛋白的可溶性表达[11-12]。优化后基因序列由上海生工生物工程有限公司合成。合成序列克隆到载体pET32a中，得到重组质粒，并通过DNA测序确认。
1.2.2 E. coli BL21(DE3) pET32a-LIF原核表达菌株的构建利用DNAstar序列分析软件，对来自GenBank数据库的hLIF cDNA序列进行密码子优化，使其易于在大肠杆菌中表达。对优化后的hLIF基因序列进行合成，合成时，在hLIF基因前加上EK酶表达序列，合成基因插入pUC57中。利用Kpn Ⅰ/Hind Ⅲ对pUC57-hLIF双酶切，回收hLIF表达序列插入经Kpn Ⅰ/Hind Ⅲ双酶切的原核表达载体pET32a中，构建重组质粒pET32a-hLIF，然后将经测序确定的重组质粒转入BL21(DE3) 中，得到E. coli BL21(DE3) pET32a-LIF原核表达菌株。
1.2.3 融合蛋白Trx-hLIF的诱导表达挑取单菌落接入LB液体培养基(100μg/ml Amp)中，37℃过夜培养，OD600达到0.6，加IPTG诱导。用12%的SDS-PAGE检测融合蛋白Trx-hLIF的表达情况，用Bio-Rad GelDoc XR凝胶成像系统对电泳结果进行分析。
1.2.4 融合蛋白Trx-hLIF的纯化低速(5 000r/min×5min)离心收集诱导后的菌体，用破菌缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，pH8.0) 重悬菌体，加溶菌酶(终浓度1mg/ml)，30℃温浴后反复冻融进行破胞。低温(冰浴)超声处理后高速(12 000r/min×10min)离心收集上清，0.45μm滤膜过滤。由于重组蛋白带有6个组氨酸标签，用镍离子亲和层析柱对融合蛋白Trx-hLIF进行初步纯化，并用SDS-PAGE和Western blot鉴定纯化结果。再用HiTrap Q HP column除去咪唑，同时对融合蛋白进一步纯化。
1.2.5 hLIF的释放和纯化先用EK酶对纯化的融合蛋白Trx-hLIF做预酶切，16℃温浴10h。根据预酶切结果选择最佳酶切条件对融合蛋白进行酶切，释放的hLIF，由于hLIF的理论等电点(pI 9.28) 高于融合伴侣(Trx)和重组肠激酶，因此可以通过简单的色谱分离纯化hLIF。SDS-PAGE分析纯化结果，Bradford法测定hLIF的浓度。
1.2.6 hLIF氨基酸组成验证将纯化样品按1：1的比例加入6mol/L的盐酸，于120℃水解12h，冷却至室温，加上样缓冲液对处理后的样品进行稀释，定容，0.22μm的滤膜过滤即可上机。分别取20μl标样及试样进样, 根据标样加入的保留时间定性，再根据试样峰面积与标样峰面积比较定量。
1.2.7 生物活性检测用脂肪干细胞(ASCs)与小鼠M1髓系白血病细胞的培养对纯化后的hLIF进行生物活性的鉴定。
1.2.8 hLIF对ASCs培养形态学的影响用含10ng/ml hLIF的DMEM培养液与未含hLIF的DMEM培养液分别培养ASCs 14天，观察其细胞形态的变化情况。
1.2.9 hLIF对小鼠M1髓系白血病细胞生长的影响细胞增殖检测使用改性MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐]法，测定如文献[13]所述，将小鼠M1髓系白血病细胞维持在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中。终浓度为0.1pg/ml~10ng/ml的rhLIF按梯度与1×104个M1细胞/孔在96孔板中孵育。37℃、5%CO2下孵育72h，在570nm波长下测量吸光度，每个试验重复5次。计算rhLIF对小鼠M1髓系白血病细胞生长的抑制率：
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将hLIF cDNA插入pET32a质粒的Trx，His-tag序列之后，Trx-hLIF表达由T7强启动子控制(图 1a)。此种设计方案，表达的融合蛋白Trx-hLIF经EK酶切割除去Trx和His-tag后，即可得到分子质量为20kDa的hLIF。所得到的预测分子质量为34kDa的融合蛋白Trx-hLIF如图 1b所示。
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| 图 1 表达载体的构建 Figure 1 Construction of the expression vectors (a) Vector map of pET32b-trx-his-tevhLIF (b) Schematic representation of the resulting fusion protein with a predicted molecular weight of 34kDa N: Amino terminus of the polypeptide; trx: Thioredoxin; His, His-tag (6 × His); EK protease cleavage site recognized by EK protease; hLIF, human leukemia inhibitory factor; C: Carboxy terminus of the polypeptide |
挑取BL21(DE3) pET32a-hLIF单克隆菌株扩大培养，并在不同IPTG浓度(0.25mmol/L、0.50mmol/L)，不同诱导温度(37℃、16℃)诱导表达。取诱导前、后菌液收集菌体、破菌上清和沉淀，用12%SDS-PAGE分析(图 2)。
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| 图 2 融合蛋白Trx-hLIF的诱导表达的SDS-PAGE分析 Figure 2 SDS-PAGE analysis of fusion protein Trx-hLIF expression The expression of fusion protein at 37℃ (a), 16℃ (b) at different temperatures, 0.5mmol / L (1, 3) 0.25mmol / L (2, 4) at different concentrations of IPTG, and the arrows indicated that the position of the fusion protein Trx-hLIF. Equal amounts of cells were loaded into the C and I lanes. For the P and S lanes, the volume of the precipitant obtained after sonication and centrifugation was adjusted to ensure that it was obtained from the same amount of cells. 10μl of sample was loaded. M: Molecular weight size marker; C: Total cellular protein before IPTG induction (control); I: Total cellular protein after IPTG induction; P: Soluble supernatant after sonication; S, Insoluble cell pellet. Gel electrophoresis was performed in a 12.5% SDS-PAGE, followed by staining with Coomassie brilliant blue R-250 |
融合蛋白Trx-hLIF在37℃、0.5 mmol/L IPTG诱导时，可溶性所占比例仅为9.1%。在相同IPTG浓度，降低诱导温度至16℃，融合蛋白Trx-hLIF所占比例为28.7%，提高了215.4%。与此对应的当诱导温度为16℃时，降低IPTG浓度至0.25mmol/L，融合蛋白Trx -hLIF在可溶性蛋白中所占比例为34.3%，提高了19.5%。相同温度，降低IPTG浓度或者相同IPTG浓度，降低诱导温度，均能够增加融合蛋白Trx-hLIF在可溶性部分的表达比例，与此同时在不可溶部分所占比例则有所降低(表 1)。
| 温度 | 可溶性(%) | 不可溶性(%) | |||
| 0.25mmol/L IPTG | 0.5mmol/L IPTG | 0.25mmol/L IPTG | 0.5mmol/L IPTG | ||
| 16℃ | 34.3 | 28.7 | 30.6 | 35.6 | |
| 37℃ | 16.8 | 9.1 | 53.9 | 55.1 | |
2.3 融合蛋白hLIF的纯化
4ml预培养的菌株BL21(DE3) pET32a-hLIF的过夜菌接入400ml新鲜的LB培养基(含100μg/ml Amp)中，37℃培养至OD600为0.6时，加入终浓度为0.25mmol/L的IPTG，16℃诱导15h，收集菌体，重悬菌体，超声破菌，离心收集上清。
选用HisTrap FF crude，结合缓冲液：20mmol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，pH 8.0；洗脱缓冲液：分别用含不同浓度(0mmol/L、10mmol/L、50mmol/L、100mmol/L、250mmol/L、500mmol/L)咪唑的20mmol/L Tris-HCl(pH8.0) 洗脱。洗脱结果用12%SDS-PAGE分析(图 3a)。
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| 图 3 融合蛋白Trx-hLIF纯化结果的SDS-PAGE分析 Figure 3 SDS-PAGE of The purified protein Trx-hLIF was purified HisTrap FF crude purified SDS-PAGE (a)and Western blot results(b); HiTrap Q HP column purification results(c) M: Standard protein molecular weight; 1: Soluble supernatant after sonication; 2-7: Eluted separately from 0mmol/L, 10mmol/L, 50mmol/L, 100mmol/L, 250mmol/L and 500mmol / L imidazole; a, b: HiTrap Q HP column purify the sample gel electrophoresis was performed in a 12.5% SDS-PAGE, followed by staining with Coomassie brilliant blue R-250 |
用抗His-tag多克隆抗体对HisTrap FF crude纯化的样品做Western blot检测。检测到分子质量为34kDa的Trx-LIF融合蛋白条带(图 3b，孔道6、7)，即大部分非特异性结合的杂蛋白流穿或被洗涤除去，部分杂蛋白被100mmol/L以下的咪唑所洗脱，融合蛋白Trx-hLIF在含250mmol/L、500mmol/L咪唑的Tris-HCl中均有被洗脱。收集洗脱的融合蛋白Trx-hLIF再由HiTrap Q HP column做进一步纯化，最终得到的Trx-hLIF纯度达到94.2%(图 3c)，利用Bradford法测定蛋白质浓度，最终收集融合蛋白Trx-hLIF 11.00mg。
2.4 hLIF的释放与纯化利用EK酶对融合物蛋白Trx-rhLIF酶切，释放酶切位点下游hLIF。在加入EK酶之后的0h、2h、4h、6h、8h、10h对酶切样品进行取样，并通过12%SDS-PAGE分析(图 4)。从酶切电泳图可知融合蛋白Trx-rhLIF可以在16℃、8h被酶切完全，切割为融合标签Trx和目的蛋白hLIF(图 5，泳道4)，并且从考马斯亮蓝R-250染色的凝胶上观察到被释放的蛋白质约为20kDa，这与成熟hLIF相对分子质量一致。酶切反应完全之后，通过5ml HiTrap SP HP柱分离纯化，利用12%SDS-PAGE分析，纯化的蛋白质为约20kDa单一条带，纯度高达98.1%(图 4，泳道7)。收集得到hLIF 4.75mg，回收率为43.2%。
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| 图 4 融合蛋白Trx-hLIF肠激酶(EK酶)酶切的SDS-PAGE分析 Figure 4 SDS-PAGE analysis of the fusion protein Trx-hLIF enterokinase (EK enzyme) digestion M: Standard protein molecular weight; 1: Purified fusion protein Trx-hLIF no EK enzyme; 2-6: Plus EK enzyme 16 ℃ incubation 2, 4, 6, 8, 10 hours of digestion effect; 7: SP column purification of the mature hLIF. Gel electrophoresis was performed in 12.5% SDS-PAGE followed by staining with Coomassie Brilliant Blue R-250 |
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| 图 5 氨基酸色图谱 Figure 5 Amino acid chromatogram (a) Amino acid standard chromatogram (b) Mature hLIF chromatogram |
将hLIF样品经浓盐酸水解，使蛋白质完全变成氨基酸后用A300自动氨基酸分析仪(德国曼默博尔公司)进行分析。在最优色谱条件下，用18种氨基酸标准品进样，分析得到标准谱图，标准品中18种氨基酸能全部分离, 且分离度较高, 达到2.0~13.3，峰型较好，如图 5a所示。
hLIF氨基酸图谱分析如图 5a所示。测定的氨基酸组成比例(表 2)与已知的hLIF的各种氨基酸组成基本相似χ2=28.135 957＜χ0.052。
| 氨基酸 | 理论值(Ei) | 测定值(Oi) | Ei-Oi | (Ei-Oi)2 | (Ei-Oi)2/ Ei |
| Thr | 10 | 10.906 5 | 0.758 901 | 0.575 931 | 2.937 189 |
| Ser | 10 | 13.234 02 | 3.054 92 | 9.332 535 | 0.933 254 |
| Asp | 21 | 14.711 99 | -6.487 11 | 42.082 65 | 2.003 936 |
| Glu | 12 | 19.123 33 | 6.864 526 | 47.121 72 | 3.926 810 |
| Gly | 12 | 18.717 17 | 6.463 864 | 41.781 53 | 3.481 794 |
| Ala | 14 | 10.182 18 | -3.955 61 | 15.646 88 | 1.117 634 |
| Val | 11 | 11.857 59 | 0.697 119 | 0.485 975 | 0.044 180 |
| Cys | 6 | 12.448 78 | 6.280 306 | 39.442 24 | 6.573 707 |
| Met | 1 | 2.318 492 | 1.287 115 | 1.656 665 | 1.656 665 |
| Ile | 10 | 8.075 798 | -2.033 49 | 4.135 097 | 0.413 510 |
| Leu | 25 | 19.202 3 | -6.057 57 | 36.694 12 | 1.467 765 |
| Tyr | 7 | 9.209 659 | 2.085 022 | 4.347 318 | 0.621 045 |
| PHe | 6 | 0.939 243 | -5.073 47 | 25.740 08 | 4.290 013 |
| His | 6 | 1.809 665 | 4.214 826 | 2.960 793 | 0.493 466 |
| Lys | 12 | 8.417 648 | 3.696 27 | 1.138 534 | 0.094 878 |
| Arg | 6 | 7.845 641 | -1.739 46 | 0.504 289 | 0.084 048 |
| 合计 | 169 | 169 | 0 | 28.135 957 | |
| Note: Amino acid analyzer can not determine Pro, Asn and Gln, respectively, into the corresponding Asp and Glu, Met destroyed half | |||||
2.6 生物活性测定
脂肪干细胞(ADSCs)用含10ng/ml rhLIF融合蛋白培养基培养14天后，细胞形态如ADSCs原始形态，多数呈成纤维细胞样伸展的长梭形(图 6a、b)。然而用不含rhLIF融合蛋白的培养基培养14天后，细胞形态发生了明显的变化，如ADSCs细胞核和核仁出现明显的分化(图 6c)。
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| 图 6 干细胞未分化标志的检测。 Figure 6 Detection of undifferentiated markers of stem cells ESC original form(a); ESC morphology after culturing for 14 days with 10ng/ml rhLIF fusion protein medium (b); ESC morphology after 14 days without rhLIF fusion egg culture (c) |
通过MTT测定，并计算抑制率(图 7)。将不同浓度的hLIF添加到在96孔板上生长的鼠M1细胞中，72h孵育，测定细胞增殖情况，hLIF对鼠M1细胞具有明显抑制作用。计算hLIF的半数最大效应浓度(EC50)为5ng/ml，对应的比活性0.5× 107IU / mg。
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| 图 7 纯化的hLIF融合蛋白对鼠M1细胞增殖的抑制作用 Figure 7 Inhibitory effects of purified hLIF on the proliferation of M1 cells Cell proliferation was measured by an MTT assay. The data represent themean±standard error of five repeat experiments |
天然状态下hLIF含量极微，且纯化困难，使其应用与进一步研究受到了极大限制。基因重组技术以成本低、纯度高、宜于制备等特点，克服了上述不足。同时大肠杆菌为宿主的蛋白质表达体系以其遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、易于操作等优点，成为外源基因表达的首选菌株。
本试验成功设计并克隆融合了His-tag、Trx和EK蛋白酶特异性切割位点的重组质粒pET32a-Trx-His-EK-hLIF，并成功在BL21(DE3) 中得到高效表达。大肠杆菌表达外源蛋白多因错误折叠聚集而丧失生物活性，以包涵体的形式存在于沉淀中[14]。本文通过减少IPTG浓度、降低诱导温度既可以诱导重组蛋白最大限度的可溶性表达[15]，又能避免过高的IPTG对工程菌的毒害作用[10]，16℃、0.25mmol/L IPTG诱导，融合蛋白Trx -hLIF在可溶性蛋白中所占比例达到34.3%。通过HisTrap FF crude梯度洗脱纯化和与HiTrap Q HP column进一步纯化处理，可以获得具有高纯度的融合蛋白Trx-hLIF。随后利用EK酶酶切，hLIF被成功释放，再利用简单的HiTrap SP HP column进行纯化，得到纯度高达98.1%的hLIF。氨基酸分析验证，MTT法测定证明了其生物活性，hLIF的纯度与回收率也超过以前的研究[16-17]。
总的来说，在此我们描述了一个简单、方便、经济的用于生产重组hLIF的研究方法。我们希望这将是一个很好的用于生产其他细胞因子的设计模型。
| [1] |
Nishimoto N, Ogata A, Shima Y, et al. Oncostatin M, leukemia inhibitory factor, and interleukin 6 inducethe proliferation of human plasmacytoma cells via the commonsignal transducer, GP130. J Exp Med, 1994, 179(4): 1343-1347. DOI:10.1084/jem.179.4.1343 |
| [2] |
Yarnamori T, Fukada K, Aebersold R, et al. The cholinergic neuronaldiffere ntiation factor from heart cells is identical to leuke mi a inhibitory factor. Science, 1989, 246(4936): 1412-1416. DOI:10.1126/science.2512641 |
| [3] |
Patersen P H. Leukemia inhibitory factor, a cytokine at the interface betwcen neurobidogy and immunology. Proc Nag Acad Sci USA, 1994, 91(17): 7833-7835. DOI:10.1073/pnas.91.17.7833 |
| [4] |
Gearing P D, Gough M N, King A J, et al. Molecular cloning and expression of cDNA encodinga murine myeloid leukaemia inhibitory factor (LIF). Embo Journal, 1987, 6(13): 3995-4002. |
| [5] |
Gough M N, Gearing P D, King A J, et al. Molecular cloning and expression of the human homologue of themurine gene encoding myeloid leukemia-inhibitory factor. Proc Natl Acad Sci USA, 1988, 85(8): 2623-2627. DOI:10.1073/pnas.85.8.2623 |
| [6] |
Gearing D P, Thut C J, VandeBos T. Leukemia inhibitory factor receptor is structurally related to the IL-6 signal transducer, gp130. Embo Journal, 1991, 10(10): 2839-2848. |
| [7] |
Chung C D, Liao J Y, Liu B, et al. Specific inhibition of Stat3 signal transduction by PIAS3. Science, 1997, 278(5344): 1803-1805. DOI:10.1126/science.278.5344.1803 |
| [8] |
Wang Q, Mei C, Zhen H, et al. Codon preference optimization increases prokaryotic cystatin C expression. Biomed Research International, 2012, 2012(3): 732017. |
| [9] |
Burgess-Brown N A, Sharma S, Sobott F, et al. Codon optimization can improve expression of human genes in Escherichia coli:amulti-gene study. Protein Expression & Purification, 2008, 59(1): 94-102. |
| [10] |
Kim S, Lee S B. Soluble expression of archaeal proteins in Escherichia coli by using fusion-partners. Protein Express Purif, 2008, 62(1): 116-119. DOI:10.1016/j.pep.2008.06.015 |
| [11] |
Turner P, Holst O, Karlsson E N. Optimized expression of soluble cyclomaltodextrinase of thermophilic origin in Escherichia coli by using a soluble fusion-tag and by tuning of inducer concentration. Protein Express Purif, 2005, 39(1): 54-60. DOI:10.1016/j.pep.2004.09.012 |
| [12] |
Stevens R C. Design of high-throughput methods of protein production for structural biology. Structure, 2000, 8(8): 177-185. |
| [13] |
Zhou J J, Han J X, Yang W Y. Improved MTT assay for activity of antitumor agents. Chinese Journal of Pharmaceuticals, 1993, 24(10): 455-457. |
| [14] |
Lian J, Ding S, Cai J, et al. Improving aquaporin Zexpression in Escherichia coli by fusion partners and subsequent condition optimization. Appl Microbiol Biotechnol, 2009, 82(3): 463-470. DOI:10.1007/s00253-008-1774-x |
| [15] |
Jana S, Deb J K. Strategies for efficient production of heterologous proteins in Escherichia coli. Applied Microbiol and Biotechnol, 2014, 67(12): 289-298. |
| [16] |
Samal B B, Arakawa T, Boone T C, et al. High level expression of human leukemia inhibitory factor (LIF) from a synthetic gene in Escherichia coli and the physical and biological characterization of the protein. Biochim Biophys Acta, 1995, 1260(1): 27-34. DOI:10.1016/0167-4781(94)00172-Y |
| [17] |
Tomala M, Lavrentieva A, Moretti P, et al. Preparation of bioactive soluble human leukemia inhibitory factor from recombinant Escherichia coli using thioredoxin as fusion partner. Protein Express Purif, 2010, 73(1): 51-57. DOI:10.1016/j.pep.2010.04.002 |