2017, Vol. 37文章信息
- 郜娇娇, 杨树林.
- GAO Jiao-jiao, YANG Shu-lin.
- 基因工程技术优化透明质酸生产的研究进展
- Advances in Optimization of Hyaluronic Acid Production by Genetic Engineering Technology
- 中国生物工程杂志, 2017, 37(8): 72-77
- China Biotechnology, 2017, 37(8): 72-77
- http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20170811
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文章历史
- 收稿日期: 2017-05-05
- 修回日期: 2017-05-22
透明质酸(hyaluronic acid，HA)，又称玻尿酸，是由N-乙酰葡萄糖胺和葡萄糖醛酸通过β-1, 4和β-1, 3糖苷键反复交替连接而成的高分子聚合物。HA是一种生物中普遍存在的酸性粘多糖，如哺乳动物组织(皮肤、滑液、眼睛玻璃体液、脐带等)，小球藻病毒以及各种原核生物(A、C族链球菌，多杀性巴氏杆菌，蜡样芽胞杆菌，新型隐球菌等)[1-2]，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质。HA因其独特的黏弹性、保湿性、非免疫原性和高生物相容性，在医药、化妆品、食品等领域中广泛应用，包括皮肤填充剂[3]、化妆品、骨关节炎治疗[4]、眼科手术[5]、组织工程支架[6]、腹部手术后的粘连预防[7]和伤口愈合等[8]。2014年HA市场调查报告显示，2012年HA的市场份额为53.2亿美元，2019年预计达到98.5亿美元[9]。
随着大量关于微生物多糖生物合成途径和相关基因研究成果的获得，HA生产在基因工程方面的研究也逐渐展开并取得显著成效。现阶段，对优良菌株进行基因工程改造，将是一条降低发酵成本、提高HA品质的切实可行的途径。目前，基因工程技术在HA生产中的应用主要从三个方面进行：调控HA分子量、提高HA产量和增强HA生产安全性。
1 HA合成相关基因对于HA的生物合成途径及其基因表达调控方式进行了大量研究，其中了解最清楚的是链球菌。不同种类链球菌中编码与HA合成相关的基因是高度保守的。合成HA的两个前体是UDP-葡萄糖醛酸(UDP-GlcUA)和UDP-N-乙酰葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)，UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc在透明质酸合成酶(hyaluronic acid synthase，HAS)的作用下合成HA。链球菌中涉及到HA合成的基因通常以操纵子形式表达，该操纵子在不同种类链球菌中分别由两个、三个或五个基因(hasAB、hasABC、hasABCDE)组成，包括编码HAS的hasA、编码UDP-葡萄糖脱氢酶(UGDH)的hasB、编码葡萄糖-1-磷酸尿苷转移酶的hasC、编码N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷转移酶的hasD/glmU以及编码磷酸葡萄糖异构酶的hasE/pgi。其中，hasB、hasC与前体UDP-GlcUA合成相关，hasD/glmU、hasE/pgi与前体UDP-GlcNAc合成相关[10]。
2 调控HA分子量HA的生物学功能和特异性应用取决于其分子量。具有高粘弹性、对细胞高亲和力的高分子量HA适用于损伤软骨的愈合，骨关节炎治疗，作为眼科的佐剂等[11]；而短链HA(2 kDa~3.5 kDa)或HA寡糖(长度为10~20个糖)对细胞行为也具有特殊的影响，如促进血管生成、诱导炎症介质表达和抑制肿瘤生长等[12-13]。为了扩展HA的应用并且制备更好的HA生物医学产品，对于有效生产特定分子量HA的深入研究是非常重要的[14]。
2.1 通过调控前体的可用性HA的分子量受两种前体UDP-GlcNAc和UDP-GlcUA的浓度的影响[15-16]，UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc之间的竞争影响链球菌HAS的聚合速率[17-18]，因此，可能存在两种前体的最佳比例以实现最大HA分子量[19]。Hmar等[20]发现当两种前体的比例更接近1时，产生较高分子量的HA；当该比例与1相差甚远时，产生较低分子量的HA。然而许多研究发现[21-23]，相对于前体UDP-GlcUA，前体UDP-GlcNAc的浓度才是HA分子量的限制因素。低浓度的UDP-GlcNAc迫使HAS切割糖链并将聚合物释放到细胞外基质[24]。Chen[19]等发现在较低浓度UDP-GlcNAc存在时，UDP-GlcNAc水平和分子量之间保持正相关性，然而这种关系在较高浓度UDP-GlcNAc存在下停滞。这些研究表明，虽然使用基因工程方法提高HA前体水平可以提高HA分子量，但是当前体的量超过一定浓度时则不再利于分子量的增加。
2.2 通过调控HAS与前体浓度的比率Hmar等[20]将来源于兽疫链球菌的HA合成相关基因(hasA、hasB)整合到乳酸乳球菌中，发现HA合酶(hasA)和前体基因(hasB)在细胞中的相对表达是控制HA分子量的重要因素。当hasA和hasB拷贝数之比较高时，细胞内每个HAS分子能够分配到的用来合成HA的前体就相对较少，合成的HA糖链就相对较短，反之则合成较长糖链的HA。
Jia等[25]引入分别携带来自多杀性巴氏杆菌的HA合酶pmHAS基因(木糖启动子控制下)和来自枯草芽孢杆菌的前体基因tuaD、gtaB(IPTG启动子控制下)的两个诱导型人工操纵子，通过分别调控pmHAS和前体基因的诱导表达的开始时间，使得重组枯草芽孢杆菌得以产生具有受控分子量的HA，能够合成范围为8 ×103~5.4×106 Da的受控分子量HA。
2.3 通过调控HAS的活性HAS中在调控HA分子量方面起着至关重要的作用[26]。Medina[27]对来自类马链球菌的seHAS的Lys48残基进行修饰(突变为Glu或Phe)，发现HA分子量降低；Weigel等[28]利用基因定点突变技术对seHAS中的4个Cys进行突变，发现当Cys262和Cys281突变为Ala时，HA分子量降低了38%。
Jeong[29]在将来自非洲爪蟾的HAS(xlhasA2)和不同组合的前体基因引入毕赤酵母中表达的基础上，为了降低HAS表达，将xlhasA2基因中的强AOX1启动子用弱AOX2启动子代替，由此将HA的分子量从1.2 MDa增加到2.1MDa。
2.4 通过调控透明质酸酶的表达量透明质酸酶是一种能水解HA糖链的酶。Jin等[30]在构建共表达兽疫链球菌HAS和枯草芽孢杆菌前体基因的枯草芽孢杆菌工程菌的基础上，进一步引入水蛭来源的透明质酸酶编码基因LHyal再整合至枯草芽孢杆菌染色体上，并对LHyal N端进行修饰以高效表达，分别采用不同强度的核糖体结合位点(RBS)序列来调控透明质酸酶的表达量，得到范围为2.20×103~1.42×106 Da的特定分子量HA。
已经开发了许多化学酶合成方法用于合成HA寡糖[31-32]，然而，此方法过程复杂、耗时，碳水化合物寡糖主链稀少，并且所用底物UDP-糖昂贵，限制了在大规模生产中的应用。相比之下，Jin等[30]的通过透明质酸酶的酶解反应产生HA寡糖的方法是有工业生产吸引力的，因为其具有操作条件温和，高降解速率和高产物均一性等独特优点。
此外，Hmar等[20]将来自兽疫链球菌的HA合成相关基因(hasA-hasB-hasC)整合到乳酸乳球菌的染色体中，发现通过染色体整合的方式不仅消除了由于质粒表达系统不稳定性而降低生产率的固有缺点，而且与质粒表达的菌株(2 MDa)相比，基因组整合的菌株产生更高分子量(3.5~4 MDa)的HA。
3 提高HA产量随着HA应用的增加，市场份额多年来持续增长，提高HA产量成为提高经济效益的重要手段。大量的传统研究通过优化发酵参数提高HA的产量取得显著成效，但也趋于上限，而利用基因工程的方法正在提供新的研究思路。
3.1 超表达前体基因尽管HA的产生可以通过单独表达hasA实现，但与hasA同时共表达前体基因可以显著增强HA生产。Chien等[33]将兽疫链球菌szhasA基因整合到枯草芽孢杆菌的基因组中，同时分别共表达兽疫链球菌中UGDH基因(szhasB)、枯草芽孢杆菌中UGDH基因(tuaD)，结果表明与szhasA共表达szhasB或tauD可以增加HA产量至少2倍，并且tauD的共表达比hasB更有效地增加HA产量。Prasad等[34]在引入兽疫链球菌中HA合成相关基因的乳酸乳球菌中发现，导入szhasA、szhasB、szhasC的重组菌的HA产量比只导入szhasA、szhasB的重组菌提高了119%。
研究者[25]通过在枯草芽孢杆菌中同时引入来自多杀性巴氏杆菌的pmHAS合成基因和不同的前体基因组合，构建了3个工程菌：TPG223 (pmHAS/tuaD-gtaB)、PG6181 (pmHAS/gcaD)、PP6502 (pmHAS/pgi)，与Widner等[35]的研究结论一致，菌株TPG223 (pmHAS/tuaD-gtaB)达到最高产量，证明负责UDP-GlcUA合成途径的tuaD和gtaB对于枯草芽孢杆菌中的高浓度HA的产生是必需的。与只含有pmHAS的菌株(几乎没有检测到HA)相比，与UDP-GlcNAc合成相关的gcaD或pgi的过表达也对HA的产量有促进作用，但这种促进效应低于UDP-GlcUA。因此得出结论，UDP-GlcUA的表达水平限制了重组枯草芽孢杆菌中的HA合成。显然，UDP-GlcUA而非UDP-GlcNAc是微生物合成HA产量的限制因素，因为各类微生物自身合成的UDP-GlcNAc已足以满足HA的合成[36]。
3.2 抑制与HA合成竞争的代谢途径生产HA过程中与之竞争碳源和能量的包括三个代谢过程：生物质的合成、磷酸戊糖途径和乳酸合成(通过糖酵解途径)。通过抑制与HA竞争碳源及能量的途径可提高HA产量。
由pfkA编码的6-磷酸果糖激酶是糖酵解途径中的第一种限速酶。Jin等[30]在构建的枯草芽孢杆菌重组菌中，分别用TTG或GTG替换pfkA的起始密码子ATG，以适度下调pfkA表达，从而为HA合成提供更多的果糖-6-磷酸。摇瓶水平下，重组枯草芽孢杆菌E168G(GTG)和E168T(TTG)与E168A(ATG)相比，HA产量分别增加13%和18%。
3.3 补充能量代谢途径HA的生物合成是一种高能耗过程。菌体内众多代谢过程以及合成HA都要消耗NAD+，而NAD+的再生则主要依靠丙酮酸转化成乳酸途径，在发酵过程中，多达80%的碳源被代谢成乳酸，不仅消耗了大量碳源，而且对菌体生长和HA合成都有抑制作用。如果考虑通过基因工程的手段，构建其他的代谢途径获得能量的再生，将有利于HA的合成。
合成聚羟基丁酸(polyhydroxyalkanoic acids，PHB)时可以将NADH氧化为NAD+，从而完成NAD+循环避免NADH的堆积。张晋宇[37]克隆PHB合成基因phbCAB，导入兽疫链球菌，构建了一个新的NAD+补给途径，发酵罐水平下乳酸合成从64 g/L降低到41 g/L，同时HA产量提高了1 g/L左右；Wu等[38]将phbCAB导入兽疫链球菌，摇瓶水平下HA产量提高了29%，乳酸产量降低了29%。
为了补充HA生物合成消耗的能量，Chien等[33]将透明颤菌血红蛋白合成基因vgb (Vitreoscilla hemoglobin gene, vgb)与HA合成相关基因在兽疫链球菌中共表达。通过vgb的表达，HA的产量增加了100%；此外，Chong等[39]尝试在兽疫链球菌中过表达NADH氧化酶以增加能量产生，成功地将ATP产量提高了30%。然而，它只导致15%的生物量增加，而不是预期的HA合成的增加。Kaur等[40]在含有来自兽疫链球菌的异源基因(hasABC/hasABD)的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，ldh)突变体(敲除三个ldh基因中的两个)重组乳酸乳球菌株中发现，ldh突变菌株中乳酸生产的转移导致更高的NAD+/NADH比，HA的产量增加了3倍。
3.4 提高发酵液溶氧由于HA具有特殊的粘弹性，随着发酵过程中HA的积累导致发酵液粘度增加，DO水平急剧降低，限制了HA的产量增加。透明质酸酶可将HA降解为小分子糖链，从而使发酵液粘度降低，DO增加。Jin等[30]在构建共表达兽疫链球菌HA合酶和枯草芽孢杆菌前体基因的枯草芽孢杆菌工程菌的基础上，引入水蛭来源的透明质酸酶编码基因LHyal整合至枯草芽孢杆菌，在3 L发酵罐水平下，HA的产量从5.96 g/L显著增加到19.38 g/L，是目前微生物发酵法生产HA的最高产量。
4 增强HA生产安全性国内外工业微生物发酵法生产HA的主要菌种为兽疫链球菌，该菌具有一定的致病性。利用基因工程技术改善HA生产过程以及产品的安全性主要有敲除HA天然生产菌毒力基因和利用安全异源宿主合成HA两种方法。
4.1 敲除HA天然生产菌毒力基因链球菌毒力因子主要包括透明质酸分解酶、菌体表面蛋白、溶血素S、溶血素Hylc以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶等[41]。如刘玉川等[42]在兽疫链球菌中将编码能够引起宿主细胞溶血的溶血素S (streptolysin S，SLS)的sagA基因敲除，获得了溶血活性极低的菌株。但HA天然生产菌中毒力因子过多且尚未被完全测定，潜在的毒力基因等待进一步发现。因此通过敲除HA天然生产菌毒力基因的方法，目前只能降低而不能完全消除菌株毒力，且毒力基因过多操作复杂难以实现，现已逐渐被利用安全异源宿主合成HA的方法取代。
4.2 利用安全异源宿主合成HA由于HA天然生产菌发酵培养基成本较高，且可能产生的毒素和热原的风险难以完全消除，因此，大量研究正在探索HA生产的替代来源。HA已经在广泛的安全异源宿主中得以产生，包括：乳酸乳球菌[43]、大肠杆菌[44]、枯草芽孢杆菌[33]、酿酒酵母[45]、毕赤酵母[29]、谷氨酸棒状杆菌等[46]。由于枯草芽孢杆菌表达系统具有分泌能力强，已测序，可用价格低廉的基本培养基发酵，同时生产的HA不与细胞粘附易于下游分离，发酵中不产毒素和透明质酸酶等优势，已由丹麦Novozymes公司申请专利并成功上市。
此外，利用化学酶合成方法通过无细胞系统合成HA [47]，是增强HA生产安全性的另一个思路，但此法可操作性及产率较差，很难应用于实际生产中。
5 展望基因工程技术提供了一种新的策略，用于优化HA产品的生产，并且可以扩展到其它多糖的生产，如肝素原和软骨素等[48]。但仍有以下几点挑战需要更多的研究以加深对HA最优生产条件的认识：(1) 尽管已经提出了HA聚合模型，并且已经阐明了影响分子量的一些关键的细胞内代谢物，但对于HA的链终止及跨膜转运的调控机制目前尚无统一的认识。因此，分子量的调节仍然是一个挑战。为了了解链终止及跨膜转运的机制，我们需要深入探究不同类别HAS的体内动力学，并研究细胞内的代谢物浓度，酶活和HA分子量三者之间的具体联系。实际上，对于体外研究得出的链终止机制是否与体内链终止机制相同仍存在争议。因此，体外研究的数据必须非常严谨地解释；(2) DO水平是HA产量的限制因素，随着HA的积累，由于其粘弹性导致发酵液粘度增加，DO水平急剧降低，即使在配备有良好通气和搅拌装置的发酵罐中，也难以在整个发酵过程中保持高的DO水平，从而将HA产量限制在6~10 g/L[30]。因此，增加DO水平提高HA产量仍然是一个挑战；(3) 在实际生产中难以获得既高产量又高分子量的HA，许多研究都发现HA产量与分子量之间呈反比关系[9, 29, 33]，如何平衡二者的关系也是生产中需要考虑的问题；(4) 近年来，焦点一直是对于更安全的异源宿主如枯草芽孢杆菌的研究。枯草芽孢杆菌是生产HA的最佳异源宿主[49]，然而，即使在高度遗传修饰的枯草芽孢杆菌中，HA产量及分子量都与天然HA生产菌株相差甚远，且在工程菌中尚难真正实现HA分子量的控制。可见，兽疫链球菌作为HA主要生产菌株的地位目前尚难撼动。综合运用基因工程和代谢工程的方法，进一步开展对异源宿主的研究，建立一套适用于工业生产要求的发酵方案生产更好服务于社会的安全、高产、高纯度的特定分子量HA，是今后的研究重点。
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