科学研究中构建稳定表达细胞株，抗体工程和细胞工程领域筛选种子细胞经常需要实现两个或以上的基因稳定共表达。通常通过两个载体共转染的筛选方法来实现，然而实践中常面对以下问题：① 两个载体共转染需要两种筛选标记；② 两个载体的共转染效率，整合效率和目的基因的共表达效率及表达稳定性存在差异^[1]；③ 筛选标记基因与目的基因的共整合效率。以上问题为筛选合适的稳定表达细胞株在效率、时间和人工成本等方面提出了挑战。因此，有必要开发单个载体实现多基因共同表达来解决以上问题。

IRES(internal ribosome entry site)序列是于1988年分别由Nahum Sonenberg和Eckard Wimmer实验室在脊髓灰质炎病毒(PV)^[2]和脑心肌炎病毒(EMCV)^[3]的RNA基因组中发现。IRES通常位于RNA病毒的5′UTR中，允许RNA以5′帽子非依赖性方式翻译^[4-9]。利用IRES连接两个基因，在上游启动子的控制下，IRES和两个基因转录成为同一条mRNA，翻译时，IRES上游基因翻译起始遵循真核生物基因的帽依赖性方式，而下游基因则通过IRES招募核糖体进入起始基因的翻译，实现了IRES序列连接的两个基因共用同一个转录单位表达^[10-12]。目前，已经有较多利用IRES序列连接两个目的基因，实现双基因的瞬时表达或者稳定表达细胞株构建的研究^[13-18]。但是使用唯一启动子，利用2个或以上IRES序列串联2个或者以上目的基因和抗性基因共表达，以提高多基因稳定共表达细胞株的筛选效率的研究未见报道。

本研究在实验室前期构建的慢病毒表达载体pLV-MCS-Puro的基础上，设计并全基因合成双基因克隆表达元件(BamHⅠ-MCS1-IRES-MCS2-IRES-BsiWI)，构建双基因共稳定表达筛选载体pLV-2MCS-Puro，该载体通过两个IRES序列串联两组多克隆位点以及嘌呤霉素抗性基因，由上游唯一的启动子转录形成一个长的转录框，进而实现外源双基因和抗性基因的共同表达，提高双基因共稳定表达细胞株的筛选效率。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 载体、菌种和细胞株

真核表达载体pEGFP、pDsRed2和大肠杆菌菌种DH5α由中山大学医药分子生物学实验室惠赠；细胞株HEK293T、MDCK和HeLa细胞购自中国科学院细胞库；表达载体pLV-MCS-Puro为本实验室自主构建并保种。

1.1.2 酶、试剂盒和其他试剂

质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自Omega公司；限制性内切核酸酶购自New England BioLabs公司；DNA聚合酶、连接酶和反转录试剂盒购自TaKaRa公司；全基因合成和测序由上海生工生物工程有限公司完成；JetPEI^TM转染试剂购自PolyPlus-transfection(PT)公司；基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；RNA提取试剂盒购自Invitrogen公司；DMEM培养基、胎牛血清FBS、胰酶购自Gibco公司；嘌呤霉素(puromycin)购自TCI公司；鼠抗GFP单克隆抗体、鼠抗RFP单克隆抗体、鼠抗β-Tubulin单克隆抗体和辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG购自美国Abbkine公司。

1.1.3 主要仪器

全温培养摇床购自上海新苗医疗器械制造有限公司；台式冷冻离心机购自Eppendorf公司；超微量紫外分光光度计购自Implen公司；梯度PCR仪、电泳槽购自Bio-Rad公司；成像仪购自UVITEC公司；洁净工作台购自北京东联哈尔仪器制造有限公司；二氧化碳培养箱购自Thermo公司；生物照相显微镜购自奥林巴斯公司；倒置荧光显微镜购自Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 pLV-2MCS-Puro载体的构建

分析骨架载体pLV-MCS-Puro已有的限制性酶切位点，设计两组多克隆位点，全基因合成双基因克隆表达元件(BamHⅠ-MCS1-IRES-MCS2-IRES-BsiWI)(图 1A)，克隆到pUC57载体。BamHⅠ和BsiWI双酶切pUC57载体和骨架载体pLV-MCS-Puro，胶回收，连接BamHⅠ-MCS1-IRES-MCS2-IRES-BsiWI与骨架载体，连接产物转化DH5α感受态，涂板，挑克隆，接种，提质粒，用BamHⅠ和Sbf Ⅰ双酶切鉴定质粒，获得pLV-2MCS-Puro载体。

1.2.2 pLV-DsRed2-EGFP-Puro表达载体构建

以pEGFP表达质粒为模板，设计EGFP上游克隆引物5′CGACCGGTGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA3′和下游克隆引物5′CTCCTGCAGGTTATGATCAGTTATCTAGATCCGG3′，PCR克隆和胶回收EGFP基因片段，Age Ⅰ和Sbf Ⅰ双酶切EGFP基因片段和载体pLV-2MCS-Puro，胶回收后连接，转化DH5α感受态，涂板，挑克隆，菌落PCR阳性鉴定，接种，提质粒pLV-MCS1-EGFP-Puro。以DsRed2表达质粒为模板，设计DsRed2上游克隆引物5′TCATGCTAGCGCCATGGTGCGCTCCTCCAAGAAC3′和下游克隆5′AGGCGCGCCCTACAGGAACAGGTGGTGGCGGC3′，PCR克隆和胶回收，Nhe Ⅰ和Asc Ⅰ双酶切DsRed2基因片段和载体pLV-MCS1-EGFP-Puro。按以上克隆方法回收，连接，转化，鉴定，接种，提取重组质粒pLV-DsRed2-EGFP-Puro。

1.2.3 细胞培养、转染和稳定表达细胞株筛选

HEK293T、MDCK和HeLa细胞在DMEM、10% FBS、5% CO₂、37℃条件下培养。MDCK和HeLa细胞铺板24h后，用嘌呤霉素终浓度分别为0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、10μg/ml的10% FBS DMEM培养，以3~4天以内能杀死所有细胞的最小浓度配制稳定表达细胞株筛选培养基。细胞转染使用JetPEI试剂盒完成，转染36h后，换筛选培养基培养，3~4天更换一次筛选培养基，直至克隆形成，获得耐药细胞池(pool)。瞬时转染爬片的HEK293T细胞荧光显微镜观察质粒的转染效率和目的基因表达情况，筛选得到的MDCK和HeLa耐药细胞池消化悬浮后涂片，荧光显微镜观察和计数荧光蛋白表达情况。

1.2.4 基因组和转录水平PCR鉴定稳定表达细胞株

使用天根生化科技有限公司的基因组DNA提取试剂盒分别提取稳定表达DsRed2和EGFP的MDCK和HeLa细胞的基因组DNA，以基因组DNA为模板，用上述DsRed2和EGFP克隆引物进行PCR鉴定。使用Invitrogen公司的TRIzol^® Reagent说明书提取稳定表达DsRed2和EGFP的MDCK和HeLa细胞总RNA，然后用TaKaRa公司的PrimeScript^TM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit将总RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板，使用上述DsRed2和EGFP克隆引物进行PCR鉴定。

1.2.5 蛋白质水平鉴定稳定表达细胞株

提取稳定表达DsRed2和EGFP的MDCK和HeLa细胞总蛋白质，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉室温封闭2h，将膜片分别与封闭液稀释的鼠抗GFP单克隆抗体及鼠抗RFP单克隆抗体4℃杂交过夜，洗膜10min/次，3次；然后用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG室温杂交2h，ECL显色，UVITEC化学发光成像。

2 结果 2.1 构建pLV-2MCS-Puro载体

连接设计合成的双基因克隆表达元件(图 1a下划线处所示两酶切位点之间部分)和骨架载体pLV-MCS-Puro(图 1b)，挑取阳性克隆提取质粒后，从两个多克隆位点各选取一个限制性内切核酸酶切位点(BamHⅠ和Sbf Ⅰ)双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得了750bp的目的基因条带及10kb的载体条带(图 1c)。测序证实pLV-2MCS-Puro载体构建成功(图 1d)。

2.2 pLV-DsRed2-EGFP-Puro载体构建

将EGFP荧光蛋白基因先克隆到pLV-2MCS-Puro载体的多克隆位点MCS2，菌落PCR验证得到pLV-MCS1-EGFP-Puro(图 2a)，然后将DsRed2荧光蛋白基因克隆到pLV-MCS1-EGFP-Puro的多克隆位点MCS1，菌落PCR验证得到表达载体pLV-DsRed2-EGFP-Puro(图 2b)。

2.3 瞬时转染HEK293T细胞验证pLV-2MCS-Puro载体

将构建完成的pLV-DsRed2-EGFP-Puro载体转染爬片的HEK293T细胞，转染24h后荧光倒置显微镜用488nm和559nm激发光观察DsRed2和EGFP表达情况。可见DsRed2和EGFP能在HEK293T细胞中共表达，从荧光强度看具有很高的协同性，而且具有较高的转染效率(图 3)。

2.4 MDCK和HeLa稳定共表达细胞筛选实验验证pLV-2MCS-Puro载体

嘌呤霉素耐药性预试验确定了MDCK和HeLa细胞的筛选给药浓度分别为10μg/ml和2μg/ml。将重组质粒pLV-DsRed2-EGFP-Puro分别转染MDCK和HeLa细胞，经嘌呤霉素筛选，分别获得了具有嘌呤霉素抗性的MDCK和HeLa细胞池(pool)。去除嘌呤霉素，正常培养传代3个月约60代次以后，取消化处理的细胞涂片，荧光显微镜观察所获抗性细胞池的DsRed2和EGFP表达情况。结果表明所获得的MDCK和HeLa耐药细胞池的DsRed2和EGFP阳性率都接近100%。其中MDCK耐药细胞池两种荧光蛋白在所有细胞中亮度较为一致，且表达量均较高(图 4a)。HeLa细胞池中两种荧光蛋白表达也较为一致(图 4b)，但是存在均弱表达的细胞群(图 5)，且通过进一步提高药物浓度到5μg/ml不能去除弱表达细胞群。

2.5 稳定共表达DsRed2和EGFP的MDCK和HeLa细胞池基因组鉴定

提取传代3个月传代60代的两种耐药细胞池，提取基因组，PCR鉴定。MDCK和HeLa细胞嘌呤霉素抗性细胞的基因组PCR产物均包含651bp的DsRed2基因条带和781bp的EGFP基因条带以及包含DsRed2基因、一个IRES序列和EGFP基因的2 200bp的基因条带(D-I-E)(图 6a)。

2.6 稳定共表达EGFP和DsRed2的MDCK和HeLa细胞RT-PCR鉴定

提取稳定共表达EGFP和DsRed2的MDCK和HeLa细胞池总RNA。以cDNA为模板PCR鉴定，PCR产物均包含651bp的DsRed2基因条带和781bp的EGFP基因条带以及包含DsRed2基因、一个IRES序列和EGFP基因的2 200bp的基因条带(图 6b)。

2.7 稳定共表达EGFP和DsRed2的MDCK和HeLa细胞蛋白质水平鉴定

提取稳定共表达EGFP和DsRed2的MDCK和HeLa细胞池总蛋白质，蛋白质免疫印迹鉴定结果表明，在所获得的两种细胞池中，EGFP和DsRed2表达量较为一致(图 7)。

3 讨论

科研和细胞工程领域获得两个基因的共表达可以通过共转染两个表达质粒的方法实现，然而限于两个载体的转染和表达效率差异以及不稳定性，在效率和成本等方面带来一系列问题。要克服转染效率的差异，可以将两个基因克隆到同一个载体表达，目前主要有以下方式：① 在同一个载体，由不同的启动子启动表达两个基因^[19]；② 两个基因之间插入剪切位点，应用选择性剪切机制表达两个基因^[20-22]；③ 基因之间以切割靶点序列连接，如2A肽^[23-25]或者intein^[26-27]序列链接两个蛋白质；④ 两个蛋白质编码序列之间插入内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site, IRES)。文献报道，IRES介导的双基因共表达系统在表达效率上相较前三者具有明显的优势^{[19, 28-29]}。

在科研和细胞工程领域经常需要筛选稳定表达细胞株，尤其是双基因共表达细胞株构建，实质上是要实现两个目的基因和筛选标记基因至少三个基因的共表达，更是增加了筛选的难度。本文基于IRES序列构建了一个多基因共表达载体，含有两个多克隆位点，串联表达2个目的基因以及筛选标记基因。由一个高效启动子启动目的基因和筛选标记基因转录为一个转录本，而且筛选标记基因位于转录本的3′端，位于两个外源基因读码框的下游，原理上筛选到的抗性细胞克隆都能够共同表达目的基因。

本文以DsRed2和EGFP荧光蛋白为模型，利用载体pLV-2MCS-Puro，筛选得到了MDCK和HeLa两种抗性细胞池，得到抗性细胞池以后，取出筛选压力，传代3个月约60代次。荧光显微观察表明，两种细胞均稳定表达两种荧光蛋白，双阳性率接近100%。荧光细胞计数表明，MDCK细胞池几乎全部细胞都能同时表达两种荧光蛋白且呈现较强而且一致的荧光亮度；HeLa细胞池中两种荧光蛋白亮度也高度一致，但存在荧光强弱两种细胞群，强荧光强度细胞约占总细胞的75%以上，提高筛选压力不能去除弱表达的细胞群，可能是因为基因组整合位点差异。但是处于第二个多克隆位点依靠IRES起始翻译的EGFP蛋白高荧光亮度细胞数甚至略高于DsRed2荧光高亮度细胞数，表明该载体分别以5′帽式和IRES分别启动两个蛋白质以大体一致的效率翻译表达。通过基因组和转录水平的PCR验证，都证明目的基因稳定整合到了细胞的基因组上，而且两个目的基因以一个共同的转录本转录。蛋白质免疫印迹鉴定验证，在所获得的两种细胞池中，EGFP和DsRed2表达量较为一致。另外，据文献报道MDCK细胞转染效率不高，只有4%左右^[30]，与我们的转染实验结果基本一致，如此低的转染效率能够成功筛选到稳定表达细胞株也表明该载体具有高效的筛选效率。

该载体在多基因共表达或稳定共表达细胞株筛选方面具有一定的应用前景。以单克隆抗体药物为例，单抗药物已经达到了千亿美元的市场规模，在单抗药物研发的过程中，种子细胞的构建是关键环节之一。抗体是由轻重链构成的同源四聚体，种子细胞筛选的过程中需要同时转染轻链和重链两个表达基因，转染，整合，表达效率的一致性和基因整合后的稳定性制约了种子细胞筛选的成功率和效率，影响抗体药物研发环节的时间，以及人力、物力、成本。本文构建的载体为此提供了一种选择。另外载体是以慢病毒表达载体为骨架改造的，未来的应用中可以用于慢病毒包装进一步提高一些难转染细胞的转染效率。同时在抗性筛选标记的选择上也具有比较大选择空间。

4 结论

本文成功构建了一个基于IRES介导的多基因共表达载体pLV-2MCS-Puro。利用IRES可以有效地介导双外源基因和抗性基因共表达。在MDCK和HeLa两种转染效率差别较大的细胞中实现了高效的筛选效率，而且连续传代证明以该载体筛选到的稳转株细胞稳定性较好。该载体在将来科学研究中瞬时共表达两个基因，或者抗体工程和细胞工程领域构建稳定表达种子细胞等方面都具有比较好的应用前景。