2017, Vol. 37文章信息
- 战春君, 李翔, 刘国强, 刘秀霞, 杨艳坤, 白仲虎.
- ZHAN Chun-jun, LI Xiang, LIU Guo-qiang, LIU Xiu-xia, YANG Yan-kun, BAI Zhong-hu.
- 巴斯德毕赤酵母甘油转运体的发现及功能研究
- Identification of Glycerol Transporter in Pichia pastoris and Function Research
- 中国生物工程杂志, 2017, 37(7): 48-55
- China Biotechnology, 2017, 37(7): 48-55
- http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20170710
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文章历史
- 收稿日期: 2017-02-23
- 修回日期: 2017-04-03
2. 江南大学工业生物技术教育部重点实验室无锡 214122；
3. 江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室无锡 214122
2. The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China;
3. The Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China
作为目前三种主要的外源表达系统，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris, P. pastoris)表达系统由于其自身显著地优越性近年来被大量应用于外源蛋白表达进程中[1-2]。巴斯德毕赤酵母在外源蛋白表达过程中的优势主要源于其本身具有一个受甲醇严格调控的强启动子(promoter of alcohol, PAOX1)[3]，统计结果表明，目前已经有超过1 000种外源蛋白(如EGF等)在巴斯德毕赤酵母中通过PAOX1获得成功表达[4-5]。但是由于该启动子受到甲醇的严格诱导，其仅能在甲醇作为唯一碳源的培养基中被诱导[6]，当培养基中存在甘油等碳源时，PAOX1会被严重抑制[7-8]。甲醇作为一种化工原料，在利用及存储过程中存在诸多缺陷，如耗氧量高、产能少等[9]；同时，由于药品对残留甲醇含量具有严格的限制，因此通过甲醇诱导医药蛋白质表达进程中面临如何彻底消除甲醇的难题[10]，这些均为基于PAOX1启动子进行外源蛋白表达的巴斯德毕赤酵母的推广带来诸多不便，因此探究甘油抑制PAOX1的分子机制并进行改良已经成为改善巴斯德毕赤酵母表达系统的一个主要研究方向。
目前对于甘油抑制PAOX1的研究主要集中在对PAOX1的改造[11-12]，对于甘油抑制PAOX1进程中甘油转运体的研究鲜见报道。甘油转运体作为细胞摄取胞外甘油的重要途径，其可能参与甘油阻遏PAOX1过程，鉴于此，探究巴斯德毕赤酵母甘油转运体对于阐明甘油抑制PAOX1具有重要意义。前期研究发现，粟酒裂殖酵母细胞不能在以甘油作为唯一碳源的培养基中生长，但是当将酿酒酵母甘油转运体(stl1)导入到粟酒裂殖酵母细胞之后，其可以在以甘油作为唯一碳源的培养基中生长[13]，通过对其的研究发现，粟酒裂殖酵母本身不具备运输甘油的转运体，但是其体内具备代谢甘油所需要的酶类，因此可以用作研究甘油转运体的良好菌株[14]。本研究通过生物信息学及相关分子生物学实验对巴斯德毕赤酵母中甘油转运体进行分离与研究，以期为后续甘油抑制PAOX1相关机制的研究提供一定的理论及实验依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株及质粒巴斯德毕赤酵母X-33，大肠杆菌DH5α，质粒pPICZ B，pEGFP-N1均由本实验室保存；质粒pRS424、粟酒裂殖酵母yas56由南京师范大学黄鹰教授赠送；pFA6a-KanMX6载体由江南大学高晓东教授惠赠。
1.1.2 分子及化学试剂LA DNA聚合酶、dNTP Mix，10×buffer及限制性内切核酸酶EcoRI、BamHI、XbaI、HindⅢ、pMD19-T、DNA连接酶等均购自宝生物(大连)有限公司(TaKaRa)；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒及PCR产物纯化试剂盒购自Axygen公司；酵母电转处理液(1mol/L山梨醇，10 TE，1mol/L乙酸锂，1mol/L DTT)，酵母基因组提取液(苯酚:氯仿:异戊醇=25:24:1，SET溶液)及酵母蛋白提取液[0.78% Tris-HCl m/m, 0.058% EDTA m/m, PMSF (100mmol/L) 2% V/m]，SET溶液(0.5mol/L NaCl, 0.2mol/L Tris-HCl, 0.01mol/L EDTA, 1% SDS)，醇氧化酶加测溶液(4.2U/ml辣根过氧化物酶，100mmol/L OPD, 33mmol/L磷酸钾缓冲液)均由本实验室配制。
1.1.3 培养基培养基YPD (1%酵母膏, 2%蛋白胨, 2%葡萄糖)，BMGY (酵母膏1%, 蛋白胨2%, K2HPO4 0.1%, KH2PO4 1.18%, YNB 1.34%, 500×生物素1ml, 甘油10ml)，BMMY (酵母膏1%, 蛋白胨2%, K2HPO4 0.1%, KH2PO4 1.18%, YNB 1.34%, 500×生物素1ml, 甲醇5ml)，Edinburgh minimal medium [3g/L邻苯二甲酸氢钾, 2.2g/L Na2HPO4, 5g/L NH4Cl, 20g/L葡萄糖, 20ml/L salts (52.5g/L MgCl·6H2O, 0.735g/L CaCl2·2H2O, 50g/L KCl, 2g/L Na2SO4), 1ml/L维生素(1g/L泛酸, 10g/L烟酸, 10g/L生物素), 0.1ml/L矿物质(5g/L硼酸, 4g/L MnSO4, 4g/L ZnSO4·7H2O, 2g/LFeCl·6H2O, 0.4g/L钼酸, 1g/L KI, 0.4g/L CuSO4·5H2O, 10g/L柠檬酸)], EMMG将EMM培养基中的葡萄糖用等量的甘油取代。
1.2 方法 1.2.1 亚细胞定位表达载体构建首先以pFA6a-KanMX6载体为模板通过PCR方法扩增kan基因，引物序列如表 1所示，扩增出来的PCR产物经过KpnI酶切之后与同样经过KpnI酶切的pRS424质粒4℃连接过夜，构建pRS424-kan重组载体。以提取的酵母基因组为模板，以gt1-1和gt1-2为引物扩增gt1基因，将扩增得到的1.6kb PCR产物经酶切(SmaI /XhoI)之后与pRS424-kan重组载体4℃连接过夜，构建pRS424-kan-gt1重组载体；以pEGFP-N1质粒为模板，以egfp-1和egfp-2为引物通过PCR方法扩增egfp融合片段，然后通过SmaI与SpeI双酶切之后与pRS424-kan-gt1重组载体通过连接酶4℃过夜连接最终构建亚细胞定位重组载体pRS424-kan-gt1-egfp。
| 引物 | 序列 |
| Kan-1 | 5′-CG GGTACC GGGTTAATTAAGGCGCGCCAGATC-3′ |
| Kan-2 | 5′-CG CTCGAG CGTTTAAACTGGATGGCGGCGTTAG-3′ |
| gt1-1 | 5′-GGC CCCGGG ATGGCAATCTATTCTCAACCCGTAAG-3′ |
| gt1-2 | 5′-GGC CTCGAG GGCCCTTGACACGTCCTCTAC-3′ |
| egfp-1 | 5′-GGC ACTAGT ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3′ |
| egfp-2 | 5′-GC CCCGGG CTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3′ |
| gt1s-1 | 5′-GC GAATTC CCGACAGAAGCAACCTCAGATCAACC -3′ |
| gt1s-2 | 5′-GC GGATCC ATGGAGCGTTAATCCGGAGTGTAAGAG-3′ |
| gt1x-1 | 5′-GC TCTAGA AACATCTCGTTTCGTGTGCTTGTGG -3′ |
| gt1x-2 | 5′-GC AAGCTT CTTGCATTCGCTCAGGGCTCATTAC -3′ |
| kan-3 | 5′-GC GGATCC CCGGTTAATTAA-3′ |
| kan-4 | 5′-GC TCTAGAG AGCTCGTTTAAAC-3′ |
1.2.2 异源回补菌株构建
为研究gt1基因功能，将构建的pRS424-kan-gt1重组载体通过电转方法导入到粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe, S. pombe)细胞中(野生型粟酒裂殖酵母不能在以甘油作为唯一碳源的培养基中生长)，然后将其在含有1mg/ml G418抗生素的平板上30℃培养。
1.2.3 gt1基因敲除载体构建通过同源重组的方法敲除巴斯德毕赤酵母中的gt1基因。首先以提取的酵母基因组为模板，以gt1s-1和gt1s-2为引物通过LA酶扩增gt1上游同源臂并将其与pMDTM19-T载体相连，构建pGT1UP重组载体；然后以gt1x-1和gt1x-2为引物扩增gt1基因下游同源臂，通过XbaI和HindⅢ双酶切与之前构建的pGT1UP重组载体连接构建包含有gt1基因上下游同源臂的pGT1UD重组载体。以pFA6a-KanMX6质粒为模板，以kan-3和kan-4为引物扩增kan基因，通过BamHI和XbaI双酶切之后与同样经过双酶切的pGT1UD重组载体经过DNA连接酶4℃连接过夜构建gt1基因敲除载体。
1.2.4 酵母基因组提取挑取单菌落接种于YPD液体培养基中，30℃ 230r/min培养过夜，取1ml于1.5ml EP管中，10 000g离心3min，弃上清，经PBS(pH7.2) 清洗1次，10 000g离心3min，弃上清；加入与菌体等量的酸性玻璃珠，然后加入400μl苯酚/氯仿/异戊醇混合溶液以及400μl SET溶液，在震荡仪上剧烈震荡30s，在冰上放置1min(重复10次)；加入200μl 1×TE，迅速混合，10 000g离心10min，将上清转移到新的1.5ml EP管中，加入1/10体积的NaAc以及2倍体积的无水乙醇，－80℃放置30min，10 000g离心10min，弃上清；加入500μl 75%乙醇10 000g离心5min，弃上清，55℃烘干20min，然后加入60~100μl TE(含有RNase, 其终浓度约为20μg/ml)，55℃处理30min, －20℃保存。
1.2.5 酵母蛋白提取将菌体接种于YPD液体培养基中，培养16h之后，OD600达到1.6左右时取适量菌体4 000g离心5min，用灭菌处理的预冷的PBS(pH7.2) 清洗2次，每次1min；转接到不同培养基中(甘油培养基、甘油+甲醇培养基、甲醇培养基)，初始OD600为0.05。培养36h后取1ml菌体加入200μl预冷的PEBF(0.788 2% Tris-HCl, 0.058 5% EDTA, 和2μl 100mmol/L PMSF)，然后加入与菌体等量的酸洗玻璃珠，在震荡仪上破碎细胞(10次，每次震荡30s间隔1min)，10 000g离心1min收集上清用于Western blotting检测。
1.2.6 酵母感受态制备及电转将甘油管中的菌体接种于液体YPD培养基中，30℃ 230r/min培养24h，然后转接到2×YPD液体培养基中，初始OD600=0.05，30℃ 230r/min培养至OD600=1.3~1.5。3 000g离心2min，弃上清并用灭菌处理的PBS(pH7.2) 清洗1次，3 500g离心1min弃上清，加入2ml 10×TE(pH7.5)、2ml 10×LiAc及0.5ml 1mol/lDTT，30℃ 50r/min培养45min。加入300μl灭菌处理的蒸馏水，4 000g离心5min，弃上清，用清洗液(25ml预冷的无菌水与20ml遇冷的1mol/L山梨醇混合液)清洗，然后4 000g离心5min重复5次。最后用3ml 1mol/L山梨醇重悬菌体，最终OD600=200，然后每份80μl保存用于电转。电转时先将电转杯在冰上预冷10min，然后将制备的感受态细胞与线性化质粒(2~5μg)混匀之后加入电转杯中，冰上放置5min, 用纸巾擦净电转杯外壁水分，进行电转，所用电转仪为BIO-RAD MicroPluser，程序为PIC，电转一次，然后迅速加入1ml 1mol/l山梨醇，30℃孵育1h，涂板，30℃倒置培养。
1.2.7 AOX1酶活检测取不同养样本菌体，4 000g离心10min，弃上清；加入灭菌后的蒸馏水500μl清洗，4 000g离心2min，弃上清，重复上述操作；加入蒸馏水将OD600调整到4.0，取500μl菌体于新的EP管中4 000g离心3min，弃上清；加入与菌体等量的酸洗玻璃珠(425~600μm)，加入细胞裂解液重悬菌体，加入PMSF溶液使得终浓度为1mmol/L；震荡破碎细胞，每振荡30s后，于冰上放置1min，反复10次；8 000g 4℃离心10min，将上清转移到新的EP管中；通过Bradford法对蛋白质进行定量；取等蛋白质量的上述细胞裂解液加入到96孔板中，加入100μl醇氧化酶检测溶液(空白对照加入10μl蒸馏水)；加入3μl甲醇溶液，室温(21~24℃)反应20~30min；加入30μl 2mol/L终止液(0.1mol/L亚硫酸)终止反应；在492nm处测定吸光值。
1.2.8 邻苯二酚法定性检测AOX1表达检测方法参照Stasyk OV方法[15]，以邻苯茴香胺作为显色底物。
2 结果 2.1 甘油转运体(GT1) 跨膜结构分析通过SGD数据库查找到与酿酒酵母甘油转运体(STL1) 具有较高同源性的巴斯德毕赤酵母中可能的甘油转运体(GT1)，然后通过跨膜结构分析软件DAS对GT1蛋白及酿酒酵母甘油转运体STL1蛋白氨基酸跨膜结构域进行分析，结果如图 1所示。通过图 1可以看出，与STL1蛋白类似，GT1蛋白也具有疏水结构域，这暗示GT1蛋白在巴斯德毕赤酵母细胞内可能作为一个膜蛋白发挥作用。
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| 图 1 GT1蛋白跨膜结构预测 Figure 1 The transmembrane structure prediction of STL1 and GT1 |
以提取的巴斯德毕赤酵母基因组为模板，以gt1-1/2为引物，通过PCR方法扩增得到gt1基因，以pEGFP-N1质粒为模板，以egfp-1/2为引物，通过PCR方法扩增egfp基因(图 2a)，然后将其与pRS424-kan重组表达载体相连(图 2b)构建巴斯德毕赤酵母及粟酒裂殖酵母亚细胞定位表达载体。
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| 图 2 亚细胞定位载体构建 Figure 2 The construction of subcellular localization vector (a) Gene cloning of egfp and gt1 (b) Construction of subcellular localization vector |
通过将GT1蛋白与EGFP蛋白融合表达对GT1蛋白在巴斯德毕赤酵母及粟酒裂殖酵母内的定位进行研究。通过图 3可以看出，在巴斯德毕赤酵母当中与GT1蛋白融合表达的EGFP蛋白定位于细胞膜上，而单独的EGFP蛋白则游离在细胞质中；在粟酒裂殖酵母中，与GT1融合表达的EGFP蛋白定位于细胞膜上，而单独的EGFP蛋白则位于细胞质当中。这说明GT1蛋白可以引导EGFP蛋白定位于细胞膜，即GT1蛋白自身定位于细胞膜上。
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| 图 3 荧光显微镜检测GT1蛋白亚细胞定位 Figure 3 Subcellular localization of GT1 by fluorescence detection The left column was objected at the bright field the right column was objected at the 490nm gluorescence |
将野生型粟酒裂殖酵母S. pombe (WT)以及导入gt1基因的粟酒裂殖酵母S. pombe (pRS424-P.pGT1) 分别培养在以葡萄糖作为碳源的EMM+A+H+L+NaCl培养基和以甘油代替葡萄糖的EMMG+A+H+L+NaCl培养基中(图 4), 30℃培养48h。通过图 4可以看出，野生型及导入gt1基因的粟酒裂殖酵母均可以在以葡萄糖为唯一碳源的培养基中生长(图 4a)，但是在以甘油作为唯一碳源的培养基中，野生型粟酒裂殖酵母不能生长而转化有毕赤酵母甘油转运体gt1基因的粟酒裂殖酵母可以生长(图 4b)，这表明，gt1基因可以赋予粟酒裂殖酵母转运甘油功能进而促进其在甘油培养基中生长。
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| 图 4 S. pombe(WT)和S. pombe (pRS424-P.pGT1) 菌株在不同培养基中的生长状况 Figure 4 Growth curve of S. pombe(WT) and S. pombe (pRS424-P.pGT1) in different medium (a) S. pombe(WT) and S. pombe (pRS424-P.pGT1) were cultured in EMM+A+H+L+NaCl medium (b) S. pombe(WT) and S. pombe (pRS424-P.pGT1) were cultured in EMMG+A+H+L+NaCl medium |
将野生型巴斯德毕赤酵母以及gt1基因缺失突变体(Δgt1)分别在0.5%甘油培养基、0.5%甘油与0.5%醇混合培养基以及0.5%甲醇培养基中进行培养，24h后各取1ml OD600=1的菌体，4 000g/min离心之后加入AOX1检测液，结果如图 5所示，图 5表明与野生型菌株相比，Δgt1突变体在0.5%甘油及0.5%甘油与0.5%甲醇混合培养基中AOX1酶活显著升高，但是在0.5%甲醇培养基中，突变体与野生型中的AOX1表达量差异不大。
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| 图 5 AOX1表达量定性检测 Figure 5 Enzyme activity detection of AOX1 |
以提取的不同培养条件下野生型巴斯德毕赤酵母以及gt1基因缺失突变体菌株总蛋白质为研究对象，测定在甘油培养基、甘油与甲醇混合养基以及甲醇培养基AOX1酶活(图 6)，结果表明，在甘油以及甘油与甲醇混合培养基中AOX1在突变体(Δgt1)中的表达量(0.045U/ml/OD600、0.057U/ml/OD600)显著高于其在野生型中的表达量(0.003U/ml/OD600、0.004U/ml/OD600)，而在甲醇培养基中两者则差异不明显(0.062U/ml/OD600、0.059U/ml/OD600)。这说明，gt1基因缺失可以在一定程度上缓解甘油对于PAOX1的抑制作用，进而提高AOX1酶活。
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| 图 6 ELISA测定不同菌株在不同培养基中AOX1酶活 Figure 6 Detection enzyme activity of AOX1 in different strains cultured in different medium (a) 0.5%glycerol medium (b) 0.5% glycerol + 0.5% methanol medium (c) 0.5% methanol medium |
巴斯德毕赤酵母表达系统目前已经被广泛的应用于外源蛋白的表达，统计资料表明，目前已经有超过1 000种外源蛋白在巴斯德毕赤酵母当中获得成功表达，而在这中以甲醇诱导型启动子PAOX1进行调控进而获得表达的外源蛋白约占总数的92.3%[16]，这表明，相比于其他组成型启动子而言PAOX1具有极高的启动效率。但是，由于PAOX1受到甲醇的严格调控，而甲醇作为一种危险的化学物质其在使用及存储过程中均存在一定危险性，因此，深入探讨甘油等对PAOX1的抑制机制具有极高的科学和实际意义。而甘油转运体作为细胞摄取胞外甘油的主要通路，其可以参与甘油对PAOX1的抑制。
在本研究中，我们通过生物信息学及相关实验确定了巴斯德毕赤酵母中的甘油转运体，并对其在甘油抑制PAOX1中的功能进行了初步研究，结果表明，gt1基因缺失可以在一定程度上缓解甘油对于PAOX1的阻遏作用，但是，在实验中我们发现，这种阻遏作用并不是彻底消除甘油对于PAOX1的抑制，因此我们推断，在甘油抑制PAOX1的过程中可能还有其他相关基因的参与。研究表明，Mxr1蛋白作为调控PAOX1的最主要的转录因子，其是aox1基因表达所必需的[12]，并且进一步研究结果表明，Mxr1p蛋白主要结合在PAOX1上的CYCCNR碱基[12, 17-18]，进而调控aox1基因的表达。在本研究中我们通过对Pgt1启动子序列分析发现，Pgt1启动子中也存在相似的结合位点，因此推测mxr1p蛋白可能通过调控gt1基因的表达来调控胞内甘油的含量进而调控Aox1基因的表达，而这也正是本研究后续实验所需要研究的。同时，研究表明，巴斯德毕赤酵母中对PAOX1的调控并不是由几个基因单独完成的，其涉及复杂的调控网络。例如，近年来研究发现，对PAOX1起调控作用的诸多转录因子大体可以分为转录激活因子(包括Mxr1、Trm2、Mit1及Prm1等)[19-21]及转录抑制因子(包括Mig、Nrg1等)[22-23]。并且这些转录激活因子及转录抑制因子之间存在相互作用。例如，研究发现，在PAOX1中Nrg1具有与Mxr1相同在结合位点。不同培养基中两者与PAOX1结合能力不同。例如，在甲醇培养基中，Mxr1与PAOX1结合能力强于Nrg1，但是在甘油培养基中，Nrg1结合能力强于Mxr1，而结合能力的差异最终导致PAOX1活性差异[23]。
总之，本文的研究确定了GT1是巴斯德毕赤酵母中的甘油转运体，并发现gt1的敲除可以缓解甘油对甲醇代谢的抑制作用。GT1是如何参与到甘油和甲醇代谢调控网络中的，还需进一步研究。
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