2017, Vol. 37文章信息
- 周智愚, 王荣华, 金生振, 王红权, 肖调义.
- ZHOU Zhi-yu, WANG Rong-hua, JIN Sheng-zhen, WANG Hong-quan, XIAO Tiao-yi.
- 黄芪多糖免疫草鱼母本对子代IgM、C3和LSZ表达特性研究
- The Expression Characteristics of IgM, C3 and LSZ in the Offspring from Female Ctenopharyngodon idella Immuned by Astragalus Polysaccharides
- 中国生物工程杂志, 2017, 37(7): 34-41
- China Biotechnology, 2017, 37(7): 34-41
- http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20170708
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文章历史
- 收稿日期: 2017-03-13
- 修回日期: 2017-04-10
2. 水产高效健康生产湖南省协同创新中心 常德 415000
2. Collaborative Innovation Center for Efficient and Health Production of Fisheries in Hunan Province, Changde 415000, China
大多数卵生鱼类在发育早期，由于免疫器官尚未发育完善，应对外界水体环境威胁时需依赖自身非特异性免疫及母本所传递的免疫能力[1]。已有研究表明，通过免疫产前性成熟雌鱼如大菱鲆(Scophthalmus maximus)[2]、鲤(Cyprinuscarpio)[3]、罗非鱼(Oreochromis mossambicus)[4]、斑马鱼(Danio rerio)[5]等, 能显著提高母本特异性免疫因子免疫球蛋白M(immunoglobulin M, IgM)[6]、非特异性免疫因子溶菌酶(lysozyme, LSZ)[7]和补体C3(complement 3, C3)[8]的表达量并传递给后代，在子代早期发育中抵御水体病原微生物的入侵时发挥重要的免疫保护作用。
黄芪多糖(astragalus polysaccharide，APS)是由中草药黄芪根部所提取的主要活性成分之一[9]，具有调节免疫、抗病毒、抗肿瘤等作用[10]。黄芪多糖作为抗细菌、病毒的免疫增强剂在畜牧业及水产养殖上已广泛应用，如在饲料添加黄芪多糖能显著提高肉仔鸡血清中IgM、C3含量[11]，长期投喂黄芪多糖能增强鲫(Carassius auratus)[12]、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)[13]、仿刺参(Apostichopus japonicus)[14]黏液或血清中LSZ和C3活性。目前在鱼类还未见以中草药多糖进行母本免疫，提高子代免疫力的报道。
草鱼(Ctenopharyngodon idella)是我国产量最高的淡水鱼类。但病害频发，其中以草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus, GCRV)感染导致的出血病最为突出。当年夏花至2龄鱼种均可发病死亡，严重制约了草鱼养殖业可持续发展[15]。因此，为探讨黄芪多糖对草鱼母源免疫后相关免疫因子的代间传递规律和作用时效，以及子代GCRV攻毒的抗病能力。本实验在产前40d对草鱼母本连续投喂含0.2%黄芪多糖的亲本配合饲料，通过ELISA、RT-qPCR等方法检测草鱼母本血液及子代早期发育阶段中免疫因子IgM、C3、LSZ的蛋白质活性和mRNA水平，并分析人工感染GCRV后，2月龄草鱼脾脏和头肾中3种免疫因子mRNA水平；对鱼类母源免疫的应用和水产业可持续性发展具有重要的理论和实践意义。
1 材料与方法 1.1 材料实验草鱼亲本为湖南省湘阴巨丰渔业公司选购的长江原种，体质量(9.0±1.0) kg；黄芪多糖精制粉(90%)购自于南京泽朗医药科技有限公司；小鼠抗草鱼IgM μ链单克隆抗体由中国科学院水生生物研究所聂品研究员惠赠；GCRV106由中国水产研究院长江水产研究所曾令兵研究员提供。
1.2 方法 1.2.1 日粮设计及饲喂实验用日粮原料购置于湖南省望城县湘中饲料有限公司，根据草鱼亲本配合饲料营养标准配制基础饲料，试验日粮分别在基础日粮中添加最适浓度0.2%的黄芪多糖(根据宋文华等研究结果[16])。催产前40d，选取10尾健康、性腺成熟的雌性草鱼，随机分为2个处理，每个处理5尾，即饲喂基础日粮(对照组)和添加黄芪多糖试验日粮(实验组)。实验鱼均注射标记芯片，投喂期间添加少量黑麦草(Loliumperenne L.)同期饲养。
1.2.2 亲本催产及子代培育草鱼亲本于催产前一周停食，经挑选，实验组和对照组符合催产条件草鱼均为4尾。采用干法人工授精获得受精卵，实验组和对照组分池孵化，鱼苗3~15d投喂熟鸡蛋黄和豆浆，15d以后投喂鱼苗营养粉(大北农饲料，北京)。
1.2.3 母本及早期子代样品采集使用5ml一次性注射器尾静脉采集实验组和对照组产卵后母本血液4ml/尾，分两部分保存，用于荧光定量检测血液放入液氮中保存；用于生理生化指标检测血液于4℃、3 000r/min离心20min，收集血清，平行取3份，－80℃保存。采集对照组和实验组草鱼卵子、受精卵、3h(囊胚期)、6h(原肠胚期)、12h(神经胚期)、24h(器官形成期)、36h(脱膜孵化期)、3d(水花)、5d(卵黄囊消失期水花)、14d(乌仔)、28d(夏花)样品，每组胚胎或鱼苗随机选取5个/尾，每个阶段或时间点均平行取3份。放入无核酸酶匀浆管(Bertin，法国)分两部分保存，荧光定量检测样品放入液氮中保存；生理生化检测样品置于－80℃冷冻保存。
1.2.4 母本血液及早期发育子代中免疫因子活性检测取上述胚胎、幼鱼阶段样品每管加入1% DEPC处理的3~5粒陶瓷研磨珠，按照50mg:500μl比例加入1×PBS。使用均质仪(Bertin, 法国)匀浆，4 000r/min，10s/次，3次，匀浆液置于离心机4℃，10 000×g离心10min，收集上清液。采用酶联免疫双抗体夹心法检测实验组、对照组母本血清和胚胎、仔鱼上清液中IgM蛋白含量。IgM一抗工作液采用1:4 000稀释，以100μl/孔包被于酶标板(康宁, 美国)，4℃过夜孵育。洗涤后加50μl待测样品，37℃孵育30min，加辣根过氧化氢酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgM二抗50μl/孔，37℃孵育30min，洗涤方法同上。加50μl显色剂TMB(博士德, 武汉)避光显色15min，最后加入50μl 2mol/L H2SO4终止液，使用酶标仪(Thermo, 美国)调450nm的波长测量各样品孔OD值。使用(伊利康, 浙江)C3试剂盒，采用免疫比浊法测定上述样品中C3的活性；使用(南京建成, 南京)溶菌酶试剂盒，采用空白对照法测定上述样品中LSZ的活性。
1.2.5 母本血液及早期发育子代mRNA水平分析分别将研磨管中草鱼母本血液、胚胎、幼鱼阶段样品，依次加入1% DEPC处理的3~5粒陶瓷研磨珠和600μl裂解液，使用均质仪匀浆，4 500r/min，10s/次，3次，根据Mini BEST Universal RNA Extraction Kit(TaKaRa, 大连)操作要求提取总RNA，使用核酸蛋白仪(Eppendorf, 德国)和1%琼脂糖凝胶电泳检测所提取的总RNA浓度与完整性。使用RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo, 美国)合成cDNA第一链，产物－20℃保存用于荧光定量PCR检测。
根据GenBank中草鱼IgM、C3和LSZ基因序列，采用Primer 6.0和Oligo7.0软件设计特异性荧光定量引物(表 1)。使用CFX96 TouchTM Real-time PCR仪(Bio-Rad, 美国)进行实时荧光定量PCR检测，配置反应体系：SYBR Green I荧光染料(TaKaRa, 大连)10μl、上下游引物(10μmol/L)各0.4μl，稀释后的cDNA模板9.2μl。反应条件：95℃预变性30s；95℃ 5s，60℃ 40s，40个循环；熔解曲线从65℃升温至95℃，每5s增加0.5℃。数据收集使用CFX manager software 3.1(Bio-Rad, 美国)。基因的相对表达量通过2-△△Ct方法计算，采用β-actin作为参考基因。
| Primer name | Primer sequence 5 ′ -3 ′ |
| IgM-F | TGGTCATCAGGTGGCAAAT |
| IgM-R | GCGGCTGTCTTCCATTCTT |
| lysozyme-F | TTCGACAGCAAAACAGGACAACT |
| lysozyme-R | GATATGATGGCAGCAATCACAGC |
| C3-F | AATACGCCATTCCTGAGGTTTCC |
| C3-R | CTTCCACCATTTCACTGCCACTT |
| Actin-F | GCTATGTGGCTCTTGACTTCG |
| Actin-R | GGGCACCTGAACCTCTCATT |
1.2.6 GCRV感染后IgM、C3和LSZ在免疫组织的mRNA水平分析
2月龄实验组、对照组草鱼各选取90尾，暂养于室内循环水养殖系统，水温控制在(28±1)℃。按体重2%投喂普通草鱼饲料，暂养4周后，每尾注射0.2ml GCRV病毒液。采集注射0h、6h、12h、24h、48h、72h、96h，取实验组和对照组草鱼脾脏与头肾组织样品约100mg(每个时间点随机选取3尾)，平行取3份，按上述方法进行总RNA提取、cDNA第一链合成及荧光定量PCR检测。
1.2.7 统计学分析上述实验数据使用SPSS Statistics 19.0统计软件单因素方差(One-way ANOVA)进行显著性分析，采用GraphPad Prism 6软件作图。
2 结果 2.1 草鱼母本血液IgM、C3、LSZ活性和mRNA水平通过添加0.2%黄芪多糖饲料饲喂性腺发育成熟草鱼母本40d后，实验组血液中IgM、C3和LSZ的蛋白质活性均显著高于对照组(P＜0.05)，分别提高了2.6倍、1.6倍、2.0倍(图 1a)。实验组IgM mRNA水平高于对照组，但无显著差异，而C3和LSZ的mRNA水平上具有显著差异(P＜0.05) 分别提高了1.9倍、2.6倍(图 1b)。
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图 1
草鱼母本血液IgM、C3、LSZ蛋白质活性和mRNA水平
Figure 1
IgM, C3 and LSZ protein activity and mRNA expression in the maternal blood of Ctenopharyngodon idella
(a)IgM, C3 and LSZ protein activity 1:IgM; 2:C3; 3:LSZ (b)IgM, C3 and LSZ mRNA expression 1:IgM; 2:C3; 3:LSZ *: Significant differences (P < 0.05); n=3; mean±SD, the same below |
IgM蛋白活性在子代各发育阶段均出现不同水平的变化，呈现先下降后升高的趋势，实验组在各阶段均显著高于对照组(P＜0.05)。在卵子中，实验组IgM活性是对照组2.2倍；发育至5d仔鱼时，两组均降到最低值，但实验组IgM活性仍是对照组1.7倍；14~28d(乌仔-夏花)IgM活性快速升高，实验组是对照组的1.8倍(图 2a)。C3活性在卵子至24h胚胎阶段呈下降趋势，实验组显著高于对照组(P＜0.05)，卵子和24h胚胎分别提高了1.9倍和1.6倍(图 2c)。36h胚胎孵化后，没有显著差异；LSZ活性表达规律与IgM相似，实验组卵子、5d、28d仔鱼中分别提高了2.4倍、2.0倍、1.9倍(图 2e)。
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| 图 2 草鱼子代发育阶段中IgM、C3和LSZ蛋白活性和mRNA水平 Figure 2 IgM, C3 and LSZ protein activity and mRNA expressionin the development stage of Ctenopharyngodon idella (a) IgM protein activity (b) IgM mRNA expression (c) C3 protein activity (d) C3 mRNA expression (e) LSZ protein activity (f) LSZ mRNA expression 1: Released eggs; 2: Fertilized eggs; 3, 4, 5, 6:Embryo in 3h, 6h, 12h, 24h phase after incubation; 7, 8, 9, 10, 11:Larvas in 36h, 3h, 5d, 14d, 28d phase after incubation |
IgM mRNA在草鱼早期发育子代呈现先下调消失后上调的趋势，卵子中，实验组表达量是对照组2.4倍，受精卵中为3.3倍，而在之后的发育时期迅速下降，12h(神经胚期)至5d仔鱼(水花)未检测到IgM mRNA表达，14d(乌仔)重新出现至28d(夏花)表达升高但无显著差异(图 2-b)。C3 mRNA在对照组卵子至12h(神经胚期)未检测到表达，而实验组在卵子和受精卵中均出现不同水平的表达；实验组和对照组在24h(器官形成期)出现表达，在出膜期间，两组呈下降趋势且具有显著差异(P＜0.05)，而后迅速上升，但两组间无显著差异(图 2d)。LSZ mRNA在实验组的表达趋势与IgM mRNA相似，卵子中，实验组表达量是对照组的3倍，受精卵中为2.8倍，14~28d出现表达且呈上升趋势，且两组间具有显著差异(P＜0.05)(图 2f)。
2.4 2月龄草鱼GCRV攻毒后不同组织中IgM、C3和LSZ mRNA水平2月龄草鱼经人工感染GCRV后，IgM mRNA在脾脏(图 3a)和头肾(图 3b)均出现上调表达，病毒感染24h后，实验组IgM mRNA水平显著高于对照组(P＜0.05)；脾脏和头肾在72h出现表达峰值，为对照组的2.8倍和2.4倍。C3基因在脾脏(图 3c)中有两次上升趋势，而在头肾(图 3d)中表现为两次下降趋势，病毒感染后，实验组C3 mRNA水平在脾脏中和头肾中较对照组有一定的升高，但两组间无显著差异。LSZ mRNA在实验组和对照组的脾脏(图 3e)和头肾(图 3f)中均呈先下降后上升的趋势，但在时间的变化上具有一定的差异性。脾脏中，最低值出现在72h；而头肾最低值出现在24h，两组在0~12h有显著差异(P＜0.05)，之后差异不显著。
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| 图 3 2月龄草鱼感染GCRV后IgM、C3和LSZ mRNA水平 Figure 3 IgM, C3 and LSZ mRNA expression after two months of Ctenopharyngodon idella infected by GCRV (a)Transcription change of IgM in spleen (b) Transcription change of IgM in head kidney (c) Transcription change of C3 in spleen (d) Transcription change of C3 in head kidney (e) Transcription change of LSZ in spleen (f) Transcription change of LSZ in head kidney 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7:Larvas as 0h, 6h, 12h, 24h, 48h, 72h, 96h after infected by GCRV |
IgM是一类由B淋巴细胞分化产生并与抗原特异性结合，具有抑制病原活性、调节抗原提呈的特异性免疫因子，而非特异性免疫因子补体C3、LSZ在抑制病毒及溶菌活性中也具有重要的免疫作用[17]。在高等脊椎动物，如蛋鸡的研究表明，通过注射一定比例黄芪多糖后，添加组与对照组在血清中IgM、C3活性具有显著差异[18]。水产动物的研究也发现，在饲料中添加不同水平黄芪多糖投喂黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)、齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)和草鱼鱼种，血清及各免疫组织中LSZ、C3活力显著高于对照组[19-21]；通过注射适量黄芪多糖后，吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)和鲤免疫组织中LSZ基因的表达显著上调且高于对照组[22-23]。在本实验中，对产前40d草鱼母本饲喂黄芪多糖，能够提高血液中3种免疫因子的蛋白活性和mRNA水平，与GCRV疫苗免疫草鱼母本的结果类似(待发表)，说明黄芪多糖能够激活草鱼母本的免疫反应，增强3种体液免疫因子的富集表达，证实了以黄芪多糖作为免疫增强剂进行草鱼母源免疫的可行性。
已有研究表明，对性腺发育成熟的大菱鲆、金头鲷(Sparusaurata)和黄颡鱼雌鱼进行免疫，其后代中IgM的含量均有所升高，表明母源性免疫因子能够传递至后代[2, 24-25]。本研究结果显示，IgM蛋白活性在子代早期阶段呈先下降后上升趋势，且实验组均显著高于对照组，与疫苗进行母源免疫大菱鲆、金头鲷、黄颡鱼和草鱼(待发表)的结果相似，暗示了对比疫苗进行母源免疫，黄芪多糖也具有增强抗体IgM的代间传递效率，对早期发育子代起到免疫保护作用。雷雪彬等[26]发现，草鱼子代自身IgM阳性细胞最早出现于孵化后17d。本实验中，12h~5d仔鱼未检测到IgM mRNA，14d后重新出现表达，说明草鱼子代自主IgM mRNA需发育至特定时期才出现表达，与上述结果相类似。在自主IgM mRNA未出现之前，卵子、受精卵中检测到的IgM mRNA可能来源于母本的传递。海鲈(Dicentrarchuslabrax)的相关研究显示，在卵巢内，母源性IgM mRNA可能通过受体介导的方式存在于卵母细胞，可由卵巢因子激活转录将少量母源IgM mRNA翻译成蛋白质储存于卵内，延长母源性IgM蛋白作用时间，当成熟卵细胞排出卵巢后则转录停止[27]。有研究报道，以嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染性成熟的雌性斑马鱼，发现母体和子代体内的补体C3的活性显著增强[28]。本研究中，非特异性免疫因子C3活性在胚胎阶段，实验组显著高于对照组，说明黄芪多糖进行母源免疫也能够增强C3活性在草鱼代间的传递，可能在抵抗细菌和病毒感染中起到一定的保护作用；LSZ活性结果表明，在子代早期发育各阶段，实验组均显著高于对照组，与Hanif等[29]用细菌免疫金头鲷亲鱼，研究其后代溶菌酶活性结果相类似，这可能说明了黄芪多糖能有效提高母源性LSZ的垂直传递，提高子代免疫能力。本实验14d子代中，两组溶菌酶LSZ mRNA水平仍表现出显著差异性，结果与刘小宁等[30]用细菌免疫斑马鱼母本后子代LSZ mRNA传递结果相似。说明通过黄芪多糖饲喂，对子代非特异性免疫因子LSZ的垂直传递和免疫保护有重要意义，但其mRNA的传递规律还需开展后续工作证明。
人工感染GCRV结果显示，实验组脾脏和头肾各时期3种免疫因子mRNA水平均高于对照组。而且在48h后，实验组IgM mRNA水平在脾脏和头肾中与对照组具有显著差异，说明经饲喂黄芪多糖母本所产子代在应对GCRV病原时3种免疫因子免疫应答能力提高；头肾和脾脏中LSZ mRNA在0~12h两组有显著差异，但随病毒感染时间变化，实验组LSZ mRNA水平逐渐下降，与对照组无显著差异。这可能也预示了在子代自身免疫系统发育完善后，特异性免疫相比非特异性免疫能够发挥更重要的免疫保护作用。
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