人组氨酸磷酸酶蛋白PHP14(也称为PHPT1) 是在脊椎动物中发现的第一个蛋白组氨酸磷酸酶^[1-2]。除了PHP14的诸多底物如ATP循环裂解酶^[3]和G蛋白的β亚基^[4]被发现外，还发现其可能与多种分子如HSP90α相互作用^[5]，进而可能介导信号转导，参与疾病如肿瘤的发生和发展。

我们前期的研究发现，在肺癌细胞中干预PHP14表达，可以影响肺癌细胞的运动、浸润，甚至体内转移^[6-8]。并且相对于癌旁组织，PHP14在肺癌组织中高表达，表明PHP14不仅参与了肺癌细胞的运动和转移，可能还与肺癌成瘤相关^[9]。此外，我们还发现，在正常细胞NIH3T3细胞中过表达PHP14后能赋予NIH3T3细胞体外非锚定依赖性生长能力，表明PHP14具有将正常细胞恶性转化的能力^[10]。但PHP14在体内是否会影响肿瘤细胞的成瘤能力，其还影响了肿瘤细胞的哪些细胞特性，从而在肿瘤中发挥作用，还有待深入地探讨。

因此，本文首先在肺癌细胞A549中沉默了PHP14的表达，并探讨了其对肺癌细胞凋亡的影响。此外，我们还进一步通过小鼠体内成瘤实验，检测了PHP14沉默对肿瘤细胞体内成瘤能力的影响，以及其影响肺癌细胞凋亡的可能机制。

1 材料与方法 1.1 细胞、试剂和材料

A549、H446细胞为本实验室保存；包含PHP14-siRNA序列CGGACATCTACGACAAAGT的shRNA-PHP14载体构建如文献[6]所述；4~6周龄雌性裸鼠购自维通利华公司；Lipofectamine 2000 Transfection Reagent购自Invitrogen公司；嘌呤霉素购自Sigma公司；Annexin V凋亡检测试剂盒购自Abcam公司；兔抗Cleaved-Caspase-3单克隆抗体、兔抗Bcl-2单克隆抗体、兔抗P53抗体均购自Cell Signaling Technology公司；小鼠抗PHP14抗体和小鼠抗GAPDH单克隆抗体购自Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠、山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥有限公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 细胞培养、转染

在六孔板中每孔接种2×10⁵个/ml细胞，并在37℃ 5%二氧化碳培养箱中培养18~24h，使细胞达到对数生长期，达到70%~80%的细胞密度。将6孔板内的含10%胎牛血清的DMEM培养基更换为无血清DMEM培养基，并分别将4μg已测序验证的shRNA-PHP14表达载体用Lipofectamine 2000真核转染试剂转染，然后继续培养4~6h。在将细胞培养液换成新的含10%胎牛血清的DMEM培养基后，放入二氧化碳培养箱中培养24h。加入G418筛选2周，获得稳定克隆。

1.3 Annexin V和PI双染及流式细胞仪检测细胞凋亡

用0.25%不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰蛋白酶溶液消化细胞，制成单细胞悬液后移入1.5ml离心管中，2 000r/min离心5min；加入PBS洗涤细胞沉淀两次，收集1~5×10⁵个细胞；加入500μl的1×Binding buffer重悬细胞；加入5μl Annexin V-FITC混匀，然后加入5μl PI，混匀；室温，避光反应15min；1h内进行流式细胞仪检测，激发波长488nm，发射波长530nm。

1.4 小鼠皮下肿瘤模型

将5×10⁶个肿瘤细胞皮下接种到裸鼠的腋下区域(每组5只小鼠)。然后每3~5天测量皮下肿瘤大小，并计算体积。所有动物实验都在动物护理和使用委员会的批准下进行。

1.5 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

根据基因的开放阅读框(ORF)序列设计实时荧光定量PCR引物，PHP14上游为5′-TCAGTAGCCGTCGTTAGCC-3′，下游为5′-TGCGACTGTGAGTGTCTGGG-3′；Bcl-2上游为5′-GAGGATTGTGGCCTTCTTTG-3′，下游为5′-CCCAGCCTCCGTTATCCT-3′；GAPDH内参基因上游引物为5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′，下游为5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′。用Trizol试剂提取各组细胞总RNA并反转录成单链cDNA，以此为模板，运用UltraSYBR Two Step RT-qPCR Kit试剂盒进行扩增反应，利用2^-ΔΔCT法计算目的基因的相对表达量。

1.6 Western blotting

收集不同细胞系总蛋白质，分别取20~50μg蛋白质量的细胞总蛋白质样品及蛋白质分子质量Marker，将处理好的样品按照预定的顺序加入上样孔中。接通凝胶电泳仪的电源，初始电压60V；溴酚蓝染料的前缘进入分离胶上缘后提高电压至160V，继续电泳直至溴酚蓝泳出分离胶的下缘。第一抗体封闭4℃振摇过夜；用含0.1% Tween的Tris-HCl缓冲盐溶液(TBST)洗膜，第二抗体封闭室温下振摇60min；以TBST洗膜。化学发光与曝光。

1.7 统计学分析

实验数据用x±s表示，组间差异采用方差分析，应用SPSS 17.0统计软件进行处理。

2 结果 2.1 PHP14沉默肺癌细胞株的构建

为了探讨PHP14对肺癌细胞的影响，我们首先构建了包含PHP14 shRNA的表达载体，并稳定转染到肺癌细胞株A549中。如图 1所示，在A549中转染PHP14 shRNA后，相对于对照细胞，PHP14的mRNA和蛋白质水平都显著降低。

2.2 PHP14沉默可促进肺癌细胞诱导性凋亡

接下来，我们通过AnnexinV-FITC和PI双染标记，经流式细胞仪，分析了PHP14沉默对肺癌细胞凋亡的影响。结果发现PHP14并不能直接导致肺癌细胞凋亡。然而，当我们用双氧水(H₂0₂)诱导肺癌细胞A549凋亡时，发现更多的PHP14沉默细胞发生了凋亡(图 2)。表明PHP14沉默使肺癌细胞对诱导性凋亡更敏感了。

2.3 PHP14沉默可抑制肺癌细胞的体内成瘤能力

肿瘤细胞在体内的生长与体外培养不同，在体内，肿瘤细胞受到体内环境(如各种免疫细胞、生长因子、凋亡因子等)影响，会表现出与体外培养不一样的生长特性。我们发现，虽然沉默PHP14后，不能影响A549细胞的体外增殖能力，但显著抑制了A549细胞的体内成瘤能力(图 3)，推测可能受体内促凋亡因子作用，PHP14沉默的肺癌细胞凋亡增多，导致了其体内成瘤能力降低。

2.4 PHP14沉默影响肺癌细胞凋亡的可能机制

为了进一步研究PHP14调控肺癌细胞凋亡的可能机制，我们通过定量PCR和Western blotting检测了PHP14沉默后A549细胞中Bcl-2的表达，以及Caspase-3的表达情况。结果发现，在A549中沉默PHP14后，显著降低了Bcl-2的表达，但直接导致细胞凋亡的Caspase-3的表达没有改变，这与我们流式细胞仪的检测结果符合，表明PHP14沉默并不能导致A549细胞直接凋亡，但降低了细胞抗凋亡的能力。在另一种P53缺失的肺癌细胞H1299中，我们也得到了同样的结果。

3 讨论

凋亡是细胞对环境的生理性病理性刺激信号、环境条件的变化或缓和性损伤产生的应答有序变化的死亡过程^[11]。凋亡是多基因严格控制的过程，这些基因在种属之间非常保守，如Bcl-2家族、Caspase家族、癌基因(如C-myc)、抑癌基因(P53)等。凋亡过程的紊乱可能与许多疾病，如肿瘤、自身免疫性疾病等的发生有直接或间接的关系。许多因素都能诱发细胞凋亡，如射线、药物等^[12-14]。

本研究发现，在肺癌肿瘤细胞A549中沉默PHP14后，在诱发细胞凋亡的因素双氧水存在的情况下，可促进肺癌肿瘤细胞凋亡。进一步的机制研究发现，PHP14沉默可降低肺癌肿瘤细胞中凋亡相关基因Bcl-2的表达。体内成瘤实验也进一步证实，PHP14沉默对肿瘤的抑制作用，显示出降低的体内成瘤能力，推测PHP14沉默可能通过促进肿瘤细胞在体内的凋亡，从而抑制肿瘤在体内的生长。

我们以往的研究发现，PHP14是一个可以促进肺癌细胞运动、浸润、转移的蛋白质，并且其还能赋予NIH3T3细胞体外非锚定依赖性生长能力，表明PHP14具有将正常细胞恶性转化的能力^[6-10]。通过本文研究，我们更进一步证实了PHP14在肺癌肿瘤发生中的重要作用，即参与了肺癌肿瘤细胞的体内生长、成瘤，这拓宽了PHP14在肿瘤中的重要作用，也为我们将PHP14作为肿瘤抑制或者治疗靶点提供了实验依据。