2017, Vol. 37文章信息
- 窦一涵, 李映, 赵鹏, 范如婷, 田平芳.
- DOU Yi-han, LI Ying, ZHAO Peng, FAN Ru-ting, TIAN Ping-fang.
- 重组肺炎克雷伯氏菌转化甘油为聚3-羟基丙酸
- Metabolic Engineering of Klebsiella pneumoniae for the Production of Poly(3-Hydroxypropionate) from Glycerol
- 中国生物工程杂志, 2017, 37(6): 86-92
- China Biotechnology, 2017, 37(6): 86-92
- http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20170613
-
文章历史
- 收稿日期: 2016-12-27
- 修回日期: 2017-02-27
2. 北京联合大学生物化学工程学院 北京 100023
2. College of Biochemical Engineering, Beijing Union University, Beijing 100023, China
当环境中碳源过剩时，许多微生物在胞内合成聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates, PHAs)[1-2]。PHAs是一类由羟基脂肪酸单体聚合而成的线性聚酯。PHAs不仅具有从坚硬质脆到柔软弹性的不同材料学性能[3]，而且具备石化基塑料无法比拟的生物可降解性和生物相容性[4]。由于上述优良性能，PHAs已成为医用和食品工业等领域极具前景的新型材料[5-6]。聚3-羟基丙酸[poly (3-hydroxypropionate), P3HP]是PHA家族的新成员[7]，其单体3-羟基丙酸(3-HP)是重要的平台化合物[8]。化学合成P3HP包括内酯开环聚合和直接缩聚，因工艺成本高及毒性而限制了研发[9-10]。近年来P3HP的研究日益增多，其工程菌发酵一般采用廉价碳源，且无需添加昂贵前体物[11-12]。
肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)不仅能转化甘油为3-HP，而且生长快[13]，因此可作为构建P3HP工程菌的出发菌株。2015年，首次报道了一株经3-HP途径生产P3HP的重组肺炎克雷伯氏菌[14]。本研究分析了K. pneumoniae的生理生化特性，拟按图 1所示构建工程菌，精简了P3HP合成途径。以甘油为底物生产P3HP涉及3步酶催化[15]：(1) 甘油脱水酶(DhaB)催化甘油(Glycerol)生成3-羟基丙醛(3-HPA)；(2) 丙醛脱氢酶(PduP)催化3-HPA生成3-羟基丙酰辅酶A(3HP-CoA)；(3) 聚酯合成酶(PhaC)将3HP-CoA聚合为P3HP(图 1)。拟以肺炎克雷伯氏菌为宿主，异源表达鼠伤寒沙门氏菌Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2的丙醛脱氢酶(PduP)及罗尔斯通氏菌Ralstonia eutropha H16的聚酯合成酶(PhaC)，以甘油为碳源发酵生产P3HP。通过优化关键酶表达，提高甘油转化率和P3HP的产量。
|
| 图 1 以甘油为碳源合成P3HP的代谢途径 Figure 1 Biosynthetic pathway of P3HP from glycerol |
菌株K. pneumoniae AA405, S. enterica, R. eutropha及表达载体pET28a为本实验室保存。PCR引物由北京博迈德生物技术有限公司合成(表 1)。
1.2 试剂
DNA聚合酶购自TaKaRa公司；DNA Marker、蛋白Marker、细菌基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒购自博迈德生物技术公司；限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶购自New England Biolabs (北京)有限公司；硫酸卡纳霉素和3-羟基丙酸甲酯(3HP-Methyl)标准品购自宝如亿生物技术有限公司。
1.3 培养基及培养条件LB培养基(g/L)：酵母粉，5；胰蛋白胨，10；NaCl，10；固体LB培养基需加入15 g/L琼脂。甘油基本发酵培养基(g/L)：K2HPO4·3H2O，3.4；KH2PO4，1.3；(NH4)2SO4，4；MgSO4·7H2O，0.5；CaCO3，0.1；酵母粉，3；甘油，40；微量元素，1.25 ml。微量元素(g/L)：MnCl2·4H2O, 0.1；ZnCl2, 0.07；NiCl2·6H2O, 0.025；FeSO4·7H2O, 1；CoCl2·2H2O, 0.2；CuCl2·2H2O, 0.02；Na2MoO4·2H2O, 0.035；硼酸，0.06；饱和盐酸，4 ml。硫酸卡纳霉素：贮存液浓度，10 mg/ml；工作浓度50 μg/ml。
菌种活化：将保存的菌液按1%(V/V)接种于4 ml LB液体培养基，37℃ 200 r/min振荡培养12 h。若质粒携带抗性基因，需添加工作浓度抗生素。摇瓶发酵：活化后的菌液按1%(V/V)接种于含100 ml发酵培养基的锥形瓶(250 ml)，封口膜封口，37℃ 200 r/min连续培养24 h(第3 h后加入诱导剂IPTG)，每3 h取样检测。
1.4 重组菌构建基因扩增：从GenBank查阅S. enterica serovar Typhimurium LT2的醛脱氢酶基因(pduP)及R. eutropha H16的聚酯合成酶(PHA合成酶)基因(phaC)序列，Primer Premier 5设计引物(表 1)；用试剂盒提取细菌基因组，PCR扩增pduP和phaC基因。
重组载体pET-tac-pduP-phaC的构建：回收纯化pduP基因，提取质粒pET-tac，37℃下双酶切(BamH Ⅰ/EcoR Ⅰ)基因和载体2 h，切胶回收后加T4 DNA连接酶16℃连接4 h，热击转化至感受态细胞E. coli TOP10，经菌落PCR及琼脂糖凝胶电泳验证，获得含pET-tac-pduP的重组菌；同样方法获得含pET-tac-phaC的重组菌；双酶切(EcoR Ⅰ/Hind Ⅲ)上述两种质粒，以pET-tac-pduP为骨架，于pduP下游插入phaC，构建含两个关键酶基因的重组载体pET-tac-pduP-phaC。
重组载体pET-tac-pduP-tac-phaC的构建：以pET-tac为模板，PCR扩增tac启动子，用EcoR Ⅰ单酶切pET-tac-pduP-phaC和tac，在pduP和phaC基因之间插入tac启动子序列，转化感受态细胞E. coli TOP 10，筛选阳性克隆。载体构建思路如图 2。
|
| 图 2 重组质粒构建示意图 Figure 2 Diagram of vector construction for P3HP synthesis |
重组菌构建：提取重组载体pET-tac-pduP-phaC和pET-tac-pduP-tac-phaC，电击转化感受态K. pneumoniae，涂布含硫酸卡那霉素的固体平板，菌落PCR及琼脂糖凝胶电泳验证，获得重组菌K. p(pET-tac-pduP-phaC)和K. p(pET-tac-pduP-tac-phaC)，保存备用。
1.5 重组菌发酵对以下4株菌进行24 h摇瓶发酵：K. p(pET-tac-pduP-phaC)、K. p(pET-tac-pduP-tac-phaC)、野生型(K. p WT)和空质粒对照K. p(pET-tac)。每3 h各自取样2 ml，测定OD600及甘油剩余量，绘制细菌生长及甘油消耗曲线。另取24 h时的发酵液，通过SDS-PAGE验证蛋白表达情况。
P3HP的检测：用气相色谱测定P3HP [16]。取2 ml 24 h发酵液，离心，洗涤得菌体；加氯仿、甲醇-硫酸溶液(甲醇:硫酸=85:15) 各1 ml；99℃水浴锅回流加热4 h；冷却至室温后加1 ml无菌水，漩涡振荡30 s，静置分层，取下层氯仿层，即为待测样品；以3HP-Methyl标准品为对照，GC检测。检测条件：初始90℃，保持3 min，10℃/min升温至180℃，保持5 min。为进一步验证结果，采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)对样品组分进行测定。
2 结果与讨论 2.1 重组菌的构建PCR克隆鼠伤寒沙门氏菌的pduP基因(1 395 bp)，电泳如图 3a所示，1 500 bp附近有一清晰的条带，酶切，连接并转化感受态细胞，经菌落PCR验证，构建得到含有pduP的载体pET-tac-pduP。同样方法克隆罗尔斯通氏菌的PHA合成酶基因phaC(1 770 bp)，如图 3b所示，2 000 bp附近有一清晰条带，构建载体pET-tac-phaC。测序结果经DNAMAN软件比对分析，发现与目标序列一致，可用于蛋白表达。
|
| 图 3 基因克隆及重组质粒电泳 Figure 3 Electrophoresis of genes and recombinant plasmids PCR amplification of pduP (a) and phaC (b); Colony PCR analysis of recombinant plasmids pET-tac-pduP-phaC (c) and pET-tac-pduP-tac-phaC (d); M:DNA marker |
双酶切(EcoR Ⅰ/Hind Ⅲ)处理pET-tac-pduP和pET-tac-phaC，再经连接、转化、菌落PCR验证，得到同时携带pduP和phaC的重组载体pET-tac-pduP-phaC，如图 3c所示，在3 000 bp附近有目标条带，表明质粒上同时携带pduP和phaC。
在一个阅读框中串联表达多个基因时，后面基因的表达通常较弱。因此在pduP和phaC之间通过EcoR Ⅰ位点插入包含操纵基因的tac启动子序列，使两个基因的表达受独立操纵基因控制。成功构建表达载体pET-tac-pduP-tac-phaC，如图 3d所示，在3 000 bp附近有目标条带，避免了PHA合成酶基因phaC表达受抑制的可能性。
提取上述两种重组载体，电击转化至K. pneumoniae，构建重组工程菌K. p(pET-tac-pduP-phaC)和K. p(pET-tac-pduP-tac-phaC)，保存备用。
2.2 重组菌蛋白表达摇瓶发酵24 h的菌体进行SDS-聚丙烯凝胶电泳。从SDS-PAGE结果(图 4) 可知，丙醛脱氢酶PduP(49 kDa)在目标位置有明显条带，表达效果较好；PHA合成酶(64.3 kDa)条带浅，表达较弱。
|
| 图 4 SDS-PAGE Figure 4 SDS-PAGE analysis of protein expression M:Marker; 1:K. p WT; 2-K. p(pET-tac-pduP-phaC); 3: K. p(pET-tac-pduP-tac-phaC); arrows indicate PduP (49 kDa) and PhaC(64.3 kDa) |
对重组菌及对照菌进行摇瓶发酵，测吸光度(OD600)和甘油剩余量，绘制生长曲线(图 5a)及甘油剩余量曲线(图 5b)。通过分析和对比可知，4株菌在24 h内的甘油消耗大致相同。从生物量可知，重组菌K. p(pET-tac-pduP-phaC)及空质粒组稍低于野生型，推测是质粒的引入增加了负荷；重组菌K. p(pET-tac-pduP-tac-phaC)在6 h后生物量急剧上升，12 h进入平稳期，最大值为野生型的1.75倍。推测原因如下：其一，表达的丙醛脱氢酶将对细胞有毒的3-HPA转化为3HP-CoA，而强化表达PHA合成酶进一步拉动代谢流，减少了3-HPA累积；其二，P3HP是胞内大分子，可作为碳源促进菌体生长，因此在甘油消耗相同的条件下，细菌表现更高的生物量；其三，生产P3HP颗粒的菌体体积发生明显变化，可能对菌体浓度的测量造成一定干扰。
|
| 图 5 菌体生长及甘油剩余量曲线图 Figure 5 Growth and residual glycerol of recombinant strains |
取发酵24 h的菌液，经甲酯化反应将P3HP转化为3HP-Methyl后用气相色谱检测。如图 6所示，(a)、(b)、(c)分别代表 3HP-Methyl标准品、重组菌K. p(pET-tac-pduP-phaC)和K. p(pET-tac-pduP-tac-phaC)甲酯化样品的GC结果。从图 6可知，样品与标准品的出峰位置吻合，出峰时间(min)分别为：8.413s、8.399s、8.414s，初步认定发酵样品中含有3HP-Methyl；为确证此结果，用气相色谱-质谱联用检测样品，证实样品中对应出峰时间的物质为3HP-Methyl，即菌体产生了P3HP。根据GC结果，重组菌K. p(pET-tac-pduP-tac-phaC)出峰面积大于K. p(pET-tac-pduP-phaC)，与预期相符，即独立阅读框的引入，使PHA合成酶表达量增加，P3HP产量也相应增加。
|
| 图 6 气相色谱检测结果 Figure 6 Results of gas chromatography GC results of 3HP-Methyl standard (a), K. p(pET-tac-pduP-phaC) (b) and K. p(pET-tac-pduP-tac-phaC) (c) |
以氯仿为溶剂配制浓度为10、8、5、4、2、1及0.5(g/L)的3HP-Methyl标准品溶液，GC检测，绘制标准曲线(图 7)，峰面积计算样品中的3HP-Methyl含量，并换算为重组菌K. p(pET-tac-pduP-phaC)和K. p(pET-tac-pduP-tac-phaC)的P3HP产量，分别为0.054 g/L及0.091 g/L。
|
| 图 7 3HP-Methyl标准曲线 Figure 7 Standard curve of 3HP-Methyl |
(1) PCR克隆了S. enterica的醛脱氢酶基因pduP和R. eutropha的PHA合成酶基因phaC，构建共表达载体后转化K. pneumoniae，SDS-PAGE表明表达成功。
(2) 以甘油为唯一碳源摇瓶发酵，GC及气相色谱-质谱联用证实在K. pneumoniae成功构建了P3HP的合成途径。
(3)pduP和phaC共用tac启动子的工程菌K. p(pET-tac-pduP-phaC)产生0.054 g/L的P3HP，而pduP和phaC各自独用tac启动子的工程菌K. p(pET-tac-pduP-tac-phaC)产生0.091 g/L的P3HP。后者是前者P3HP产量的1.69倍。
| [1] | Wang Y, Yin J, Chen G Q. Polyhydroxyalkanoates, challenges and opportunities. Current Opinion in Biotechnology, 2014, 30(30) : 59–65. |
| [2] | Lee S Y. Bacterial polyhydroxyalkanoates. Biotechnology and Bioengineering, 1996, 49(1) : 1–14. DOI:10.1002/(SICI)1097-0290(19960105)49:1<1::AID-BIT1>3.3.CO;2-1 |
| [3] | Sudesh K, Abe H, Doi Y. Synthesis, structure and properties of polyhydroxyalkanoates:biological polyesters. Progress in Polymer Science, 2000, 25(10) : 1503–1555. DOI:10.1016/S0079-6700(00)00035-6 |
| [4] | Poirier Y, Nawrath C, Somerville C. Production of polyhydroxyalkanoates, a family of biodegradable plastics and elastomers, in bacteria and plants. Nature Biotechnology, 1995, 13(2) : 142–150. DOI:10.1038/nbt0295-142 |
| [5] | Chen G Q, Wu Q. The application of polyhydroxyalkanoates as tissue engineering materials. Biomaterials, 2005, 26(33) : 6565–6578. DOI:10.1016/j.biomaterials.2005.04.036 |
| [6] | Rai R, Keshavarz T, Roether J A, et al. Medium chain length polyhydroxyalkanoates, promising new biomedical materials for the future. Materials Science and Engineering:R:Reports, 2011, 72(3) : 29–47. DOI:10.1016/j.mser.2010.11.002 |
| [7] | Zhu B, Kai W, Pan P, et al. Polymorphic packing and dynamics of biodegradable poly(3-hydroxypropionate). The Journal of Physical Chemistry B, 2008, 112(32) : 9684–9692. DOI:10.1021/jp801538p |
| [8] | Li Y, Wang X, Ge X, et al. High production of 3-hydroxypropionic acid in Klebsiella pneumoniae by systematic optimization of glycerol metabolism. Scientific Reports, 2016, 6 : 26932. DOI:10.1038/srep26932 |
| [9] | Dunn E W, Lamb J R, LaPointe A M, et al. Carbonylation of ethylene oxide to β-propiolactone:a facile route to poly(3-hydroxypropionate) and acrylic acid. ACS Catalysis, 2016, 6(12) : 8219–8223. DOI:10.1021/acscatal.6b02773 |
| [10] | Yamashita M, Takemoto Y, Ihara E, et al. Organolanthanide-initiated living polymerizations of ε-caprolactone, δ-valerolactone, and β-propiolactone. Macromolecules, 1996, 29(5) : 1798–1806. DOI:10.1021/ma951400n |
| [11] | Andreeβen B, Lange A B, Robenek H, et al. Conversion of glycerol to poly(3-hydroxypropionate) in recombinant Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology, 2010, 76(2) : 622–626. DOI:10.1128/AEM.02097-09 |
| [12] | Wang Q, Liu C, Xian M, et al. Biosynthetic pathway for poly(3-hydroxypropionate) in recombinant Escherichia coli. Journal of Microbiology, 2012, 50(4) : 693–697. DOI:10.1007/s12275-012-2234-y |
| [13] | Wang K, Wang X, Ge X, et al. Heterologous expression of aldehyde dehydrogenase from Saccharomyces cerevisiae in Klebsiella pneumoniae for 3-hydroxypropionic acid production from glycerol. Indian Journal of Microbiology, 2012, 52(3) : 478–483. DOI:10.1007/s12088-012-0280-0 |
| [14] | Feng X, Xian M, Liu W, et al. Biosynthesis of poly (3-hydroxypropionate) from glycerol using engineered Klebsiella pneumoniae strain without vitamin B12. Bioengineered, 2015, 6(2) : 77–81. DOI:10.1080/21655979.2015.1011027 |
| [15] | Gao Y, Liu C, Ding Y, et al. Development of genetically stable Escherichia coli strains for poly (3-hydroxypropionate) production. PloS One, 2014, 9(5) : e97845. DOI:10.1371/journal.pone.0097845 |
| [16] | Brandl H, Gross R A, Lenz R W, et al. Pseudomonas oleovorans as a source of poly(β-hydroxyalkanoates) for potential applications as biodegradable polyesters. Applied and Environmental Microbiology, 1988, 54(8) : 1977–1982. |