文章信息
- 王丹丹, 陈恬, 许亮国.
- WANG Dan-dan, CHEN Tian, XU Liang-guo.
- Yeast two-hybrid方法筛选VISA相互作用蛋白
- Screening of VISA Interacting Proteins by Yeast Two-hybrid System
- 中国生物工程杂志, 2017, 37(6): 63-69
- China Biotechnology, 2017, 37(6): 63-69
- http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20170610
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文章历史
- 收稿日期: 2017-02-27
- 修回日期: 2017-04-16
2. 江西师范大学生命科学学院 南昌 330022
2. College of Life Sciences, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China
先天免疫系统是机体抵抗入侵病原体的第一道防线,先天免疫对入侵病原体的检测及随后特异性免疫的启动都是至关重要的,在机体抗感染的过程中发挥着重要的防御功能。RLRs(包括RIG-Ⅰ, MDA5等)存在于细胞浆内,是监测细胞内病毒RNA的感应器。研究结果表明,VISA是连接RIG-Ⅰ与下游信号转导通路的一个接头蛋白。VISA定位在线粒体外膜上, 由540个氨基酸组成,具有3个主要功能域:N端的CARD域(CARD domain: aa 10~77), 中间的脯氨酸丰富区域(Proline-rich region: aa 107~173) 和C端的跨膜域(Transmembrane domain: aa 514~535), 同时还存在3个TRAF(TRAF2, TRAF3, TRAF6) 相互作用结构域(TRAF interacting motifs)。病毒感染细胞后,VISA的CARD域能与RIG-Ⅰ和MDA5暴露的CARD域相互作用,通过这种CARD域之间的相互作用,VISA被招募到RIG-Ⅰ分子上,然后通过VISA招募下游不同的信号转导分子[1-2]。CARD域对VISA转导下游通路,激活下游的NF-κB和IRF3等转录因子起非常重要的作用,实验证实缺少CARD域的VISA短截体不能有效地进行下游信号转导。在细胞内过表达缺少跨膜域的VISA短截体也不能进行信号转导,而将VISA分子的跨膜域换成BCL2跨膜域的嵌合体VISA具有和野生型一样的信号转导功能,这说明C端的跨膜域对于VISA蛋白正确定位在线粒体外膜上,对VISA进行有效的信号转导是必需的[2]。研究表明,VISA是涉及IFNβ信号通路关键的接头分子。VISA对于RIG-Ⅰ介导的信号通路具有不可或缺的作用,VISA对于非TLR3依赖的信号通路是不可缺少的,同时VISA也参与TLR3激发信号通路,但不参与TLR4和TNF激发的信号通路[1]。
综上所述,对VISA抗病毒信号通路的研究在近年来取得了比较大的进展,但对于VISA信号转导的详细机制还不十分清楚,还有一些问题需要解决。要了解VISA信号转导通路中更多的细节,更全面了解VISA的作用机理,一个最好的方法就是继续寻找新的与VISA相互作用蛋白,因此本研究用VISA蛋白的全长做诱饵(Bait),利用酵母双杂交系统来筛选293 T细胞cDNA表达文库,以期筛选到新的VISA相互作用蛋白,通过免疫共沉淀实验和双荧光素酶报告系统在293T细胞中验证筛选到的阳性克隆与VISA相互作用的真实性。通过对VISA与新的互作蛋白的作用机理研究能进一步阐明VISA在抗病毒信号通路中的作用细节。
1 材料与方法 1.1 材料酵母AH109由武汉大学舒红兵教授惠赠;诱饵载体pGBT9由本实验室保存;由pACT2载体构建的293T细胞cDNA筛选文库购自Clontech公司;用于转化的ssDNA(Salmon Sperm DNA,鲑鱼精子DNA)购自上海索莱宝生物科技有限公司;YPD Broth全营养培养基、CSM-TRP缺陷培养基、CSM-TRP-LEU缺陷培养基、CSM-HIS-LEU-TRP缺陷培养基以及YNB无氨基酸酵母氮源均购自MP Blomedlcals公司;酵母双杂交用琼脂粉(Agar)购自Fisher Scientific公司;PEG(分子量为3 350)、3-AT(3-amino-1, 2, 4-triazole)、LiAc、Tris·base、EDTA、DMSO、D-(+)-Glucose及筛选试验中用到的其它常用生化试剂购自Sigma公司;酵母质粒提取试剂盒(Yeast Plasmid Kit)购自OMEGA及索莱宝生物科技有限公司;DNA测序由华大基因公司完成。哺乳动物细胞表达载体pRK5-Flag、pRK5-HA由本实验室构建并保存;作为PCR模板的cDNA文库购自Clontech公司;引物由上海生工公司合成;Taq DNA聚合酶混合液(2×Taq plus PCR Master Mix)琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、DNA纯化试剂盒、质粒小提试剂盒均购自天根公司;琼脂糖(Agarose)购自Bioexpress公司;Endo-Free质粒小提试剂盒购自OMEGA公司;限制性内切酶均购自NEB(New England Biolabs)公司;T4 DNA连接酶购自Promega公司及TaKaRa公司;LB琼脂培养基(LB Agar)购自Solarbio公司;LB肉汤培养基(LB Broth)购自GENEray公司;用于阳性克隆筛选的氨苄青霉素(Ampicillin)购自Sigma公司;感受态细胞(DH5α)由本实验室参照《分子克隆实验指南》第四版(J.萨姆布鲁克等著,2012) 的有关实验方法制备。人胚肾293T细胞(Human embryo kidney 293) 由武汉大学舒红兵教授惠赠;细胞培养用的DMEM培养基、小牛胎儿血清FBS(Fetal bovine serum)、0.05%及0.25%胰酶液(Trypsin)以及配制双抗的青霉素(Penicillin)和链霉素(Streptomycin)均购自GIBCO公司;100mm细胞培养皿、一次性移液管等均购自Greiner公司;细胞标准磷酸钙转染中2×HBS(pH7.12) 和2.5M CaCl2试剂所需药品购自Sigma公司。实验所用硝酸纤维素膜(NC膜)购自Millipore公司;磁珠ProteinG-Sepharose购自GE healthcare公司;免疫共沉淀所用抗Flag标签(anti-Flag)单克隆抗体购自Sigma公司;脱脂奶粉购自LabScientific公司;Western blot中所用一抗为抗Flag标签(anti-Flag)、抗HA标签(anti-HA)单克隆抗体,均购自Sigma公司;所用二抗为HRP偶联标记的羊抗小鼠IgG(anti Mouse IgG),购自PIERCE公司;Immun-Star HRP化学发光试剂盒(Immun-Star HRP Chemiluminescent Kit)购自Bio-Rad公司,实验结果由化学发光成像系统扫描获得。萤火虫荧光素酶报告基因质粒IFNβ-Luc购自Strategene公司;海肾荧光素酶报告基因质粒pRL-TK-Renilla购自Promega公司;仙台病毒(Sendai virus, SeV)由武汉大学舒红兵教授惠赠;双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Dual-Luciferase Reporter Assay System)购自Promega公司。
1.2 方法 1.2.1 构建pGBT9-VISA诱饵载体用SalⅠ/NotⅠ酶切pRK5-Flag-VISA质粒, 利用胶回收试剂盒回收小片段。用SalⅠ/NotⅠ酶切pGBT9, 利用胶回收试剂盒回收大片段T4DNA连接酶连接大、小片段并转化大肠杆菌DH5 α。用TIANGEN质粒小提试剂盒抽提质粒从DH5 α中抽提质粒pGBT9-VISA。
1.2.2 酵母菌转化以及阳性克隆挑选利用PEG/LiAc法将1μg pGBT9-VISA和100μg ssDNA转化AH109酵母感受态细胞, Trp-缺陷固体培养基30℃培养2d。长出的克隆为AH109[p GBT9-VISA]。挑取AH109[p GBT9-VISA]菌株制作感受态细胞, PEG/LiAc法大规模转入10mg 293T ds cDNA和100mg ssDNA,取1/1 000体积的菌体混合液涂布于Leu-/Trp-plate培养2d检测转化效率,其他菌体混合液His-/Leu-/Trp-/3-AT plate(3-AT浓度2.5mmol/L)30℃培养7~10d。挑取克隆于2ml Trp-medium 220r/min摇床培养1~2d,用YEAST小提试剂盒抽提质粒。
1.2.3 PCR产物测序及生物信息学初步分析用GAD通用引物对抽提到的各酵母克隆的质粒进行PCR,PCR反应条件是94℃,4min; 94℃ 30s, 57℃ 30s, 72℃ 1min, 共35个循环; 72℃延伸5min, 4℃ ∞。回收PCR产物并送华大基因测序,对测序结果进行NCBI BLAST数据库进行比对并对比对结果进行分析。
1.2.4 候选基因全长克隆到哺乳动物细胞表达载体pRK5-Flag上利用分子克隆技术将筛选到的候选基因全长克隆到带Flag标签的哺乳动物细胞表达载体pRK5-Flag上。根据NCBI上已发表的候选基因的序列及pRK5表达载体多克隆位点设计PCR引物。我们于5′端引物引入SalⅠ限制性酶切位点GTCGAC序列,3'端引物引入NotⅠ限制性酶切位点GCGGCCGC序列,将设计的引物序列提交给上海生工合成。从人293T细胞cDNA文库中PCR扩增得到候选基因全长CDS序列,PCR反应条件是94℃2min; 94℃ 30s, 55℃ 30s, 72℃ 1.5min, 共35个循环; 72℃延伸5min, 4℃ ∞。电泳后用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行PCR产物的回收。PCR产物SalⅠ/NotⅠ酶切后用DNA产物纯化试剂盒对酶切产物进行纯化,pRK5-Flag表达载体酶切后进行电泳,用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对大片段进行回收,T4 DNA连接酶连接PCR酶切纯化产物和胶回收的载体, 并转化大肠杆菌DH5 α,于含80μg/ml Amp(氨苄青霉素)的LB平板37℃培养箱倒置培养18h左右。挑单克隆于2ml含80μg/ml Amp的LB液体培养基220r/min 37°摇床培养20h,用TIANGEN质粒小提试剂盒抽提质粒,利用HindIII/XhoⅠ限制性内切酶对提取的重组质粒进行酶切鉴定。将鉴定正确的克隆接种到50ml含80μg/ml Amp的LB液体培养基中扩大培养,并利用Endo-Free质粒大提试剂盒提取、纯化质粒以备其他实验用。
1.2.5 免疫共沉淀和免疫印迹实验100mm培养皿培养人293T细胞,采用标准磷酸钙转染法分别将构建好的质粒共转染至293T细胞,于5% CO2的二氧化碳培养箱37℃培养20~24h后,收细胞,加入裂解液[20mmol/L Tris·HCl、150mmol/L NaCl、1% NP-40、1mmol/L EDTA、10μg/ml抑肽酶(aprotinin)、10μg/ml亮抑蛋白酶肽(leupeptin)、饱和Na3PO4(1:100)、1mmol/L苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride)、30mmol/L NaF,pH 7.5]400μl,4℃ 1h裂解细胞后,离心,获得的上清分两份,其中一份上清体积350μl,加人装有预处理过的磁珠(沉降体积约20μl)、20μl 1×TBS[1×TBS(1L):8g NaCl、0.2g KCl、3g Tris·base,pH 7.5;]及0.4μg anti-Flag单克隆抗体的EP管中,25r/min、4℃翻转过夜。再10 000r/min离心1min,去上清,沉淀物用裂解液洗2次,加入2×SDS上样缓冲液后煮样并跑胶,再用免疫印记法检测蛋白;剩下的另一份上清体积50μl直接加入等体积2×SDS煮样并跑胶,用免疫印记法检测蛋白。以下为免疫印迹(Western blot)实验过程:SDS-PAGE电泳:配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶(10%的分离胶和5%的浓缩胶)。在电泳槽内倒入1×Western Running Buffer[1×Western Running buffer(5L):Tris base 15.143g、Glycine 93.84g、SDS 5g,加水溶解至5L水],每孔上样量20μl,蛋白marker取1μl,先80V电泳20min,再150V电泳40min。
转膜:转膜槽中加入1×Transfer Buffer(Glycine 14.5g、Tris base 29g、SDS 1.85g,加水定容4500ml再加入甲醇500ml),电压200V,电流0.35A,转膜1.5h。
孵一抗:转膜后,含Tween20的1×TBS水平摇床洗膜1min,再5% milk 4℃摇床上封闭1h,接着孵育抗体,用于免疫共沉淀的膜则是孵anti-Flag(1:4 000比例用5% milk稀释);免疫印迹的两张膜分别孵的一抗是anti-Flag(1:4 000比例用5% milk稀释)和anti-HA(1:2 000比例用5% milk稀释)4℃摇床上孵育过夜。
洗膜:含Tween20的1xTBS,洗膜4次,每次洗膜5min。
孵二抗:二抗是HRP偶联标记的羊抗鼠anti-Mouse IgG,(1:2 000比例5% milk稀释)水平摇床上,孵育1~2h。
洗膜:含Tween20的1×TBS,洗膜4次,每次洗膜5min。
显色:用Immun-Star HRP化学发光试剂盒进行显色,化学发光成像系统扫描显色。
1.2.6 双荧光素酶报告实验同样采用标准磷酸钙转染法将构建好的质粒、IFNβ-Luc(萤火虫荧光素酶报告基因质粒)及pRL-TK-Renilla(海肾荧光素酶报告基因质粒)共转染至接种于24孔板的293T细胞,于5% CO2的二氧化碳培养箱37℃培养,仙台病毒(SeV)介导的荧光素报告基因分析实验在转染12h后,实验组加入仙台病毒处理细胞12h,收细胞,利用单管荧光检测器检测细胞裂解液中荧光素酶活性,其它荧光素报告基因实验在转染24h后,收集细胞进行荧光素酶活性检测,具体步骤参照Promega双荧光素酶报告基因检测试剂盒使用说明书。
2 结果 2.1 酵母双杂交筛选结果得到阳性酵母克隆后,抽提质粒DNA, PCR扩增目的基因片段,测序,Genebank分析,挑选候选基因。在本次酵母双杂交实验中筛选到了包括Sec13L1 (NM_001136026.2) 在内的8个候选基因(本文未一一列出)。图 1为PCR扩增产物电泳图中部分,经测序比对分析图中1号克隆比对结果为Sec13L1(NM_001136026.2)。
2.2 候选基因全长扩增以及其哺乳动物表达载体构建根据NCBI已发表的Sec13L1(NM_001136026.2) 序列设计引物,分别在5′端插入SalⅠ酶切位点,3′端插入NotⅠ酶切位点,引物序列如下:
5′引物:AAAGTCGACAATGAGAGAACCTGTGCTT
3′引物:AAAGCGGCCGCTCACTGCTCGTTCTGCTGGCC
利用以上设计好的Sec13L1引物从人的混合cDNA文库中扩增候选基因Sec13L1全长,电泳结果显示PCR扩增产物条带大小正确(如图 1a所示),用SalⅠ/NotⅠ酶切消化后克隆到SalⅠ/NotⅠ酶切回收的PRK5-Flag载体上并转化到大肠杆菌DH5α感受态中。挑单克隆1号~6号,通过HindⅢ/XhoⅠ双酶切鉴定, 酶切产物电泳结果表明条带大小正确,所获得的克隆为阳性的重组质粒(如图 2中C所示),送华大基因测序,结果显示所有克隆均正确,且融合区域的阅读框序列完全正确,选1号克隆用Endo-Free质粒大提试剂盒大提质粒备用。
2.3 免疫共沉淀验证蛋白间的相互作用为了鉴定候选基因Sec13L1与VISA互作真实性,将pRK5-Flag-Sec13L1质粒分别与空载体Vector,pRK5-HA-VISA,pRK5-HA-TBK1,pRK5-HA-RIG-Ⅰ, pRK5-HA-IRF3各质粒共转染至293T细胞,用免疫共沉淀法(Co-immunoprecipitation, Co-IP)检测到候选基因蛋白Sec13L1与VISA蛋白相互作用。用anti-HA进行免疫沉淀,再用anti-Flag对沉淀物进行免疫印迹分析,结果显示pRK5-Flag-Sec13L1质粒和pRK5-HA-VISA质粒共转染实验组检测到条带, 同时pRK5-Flag-Sec13L1质粒和pRK5-HA-IRF3质粒共转染实验组也检测到微弱条带(如图 3的上图版所示);对于全细胞裂解液WCL(whole cell lysate),分别用anti-HA和anti-Flag进行免疫印迹分析(分别如图 3的下图版所示),结果显示各实验组共转染的质粒与图 3上表达条带相符。免疫共沉淀实验结果表明,Sec13L1与VISA蛋白存在互作,此外还检测到Sec13L1与IRF3蛋白有作用,未检测到Sec13L1与TBK1,RIG-Ⅰ这两个基因蛋白相互作用。
2.4 Sec13L1过表达增强VISA对IFNβ启动子的激活双荧光素酶报告基因系统是采用萤火虫和海洋腔肠荧光素酶这两个报告基因共同检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用。此前Xu等[1]已报道VISA能激活IFNβ启动子,本研究通过双荧光素酶报告基因系统实验发现在293T中单独过表达Sec13L1不激活IFNβ启动子,而与VISA共转染到293T细胞中时,过表达Sec13L1能加强VISA对IFNβ启动子的激活,并且呈剂量依赖性,随着转染Sec13L1量的增加,IFNβ启动子被VISA激活的作用增强。实验结果显示,与只转染VISA的对照组相比,转染了VISA同时分别共转染Sec13L1 0.2μg、0.4μg、0.8μg三组实验组与只转染VISA的对照组比较,差异有显著性(P < 0.05),且其中转染Sec13L1的量越多的组与对照组的差异更显著;转染了VISA同时转染Sec13L1 0.1μg与对照组的差异不显著(P > 0.05),如图 4所示。
3 讨论通过RIG-Ⅰ受体感知RNA病毒参与的复杂信号通路级联反应利用了线粒体抗病毒信号通路接头分子VISA蛋白来协调先天性宿主抗病毒应答,最后诱导了IFN和NF-κB信号通路诱导的抗病毒和炎症反应应答。VISA位于线粒体外模,和过氧化物酶体,内质网,自噬小体有关联,并且在这些位置协调了RLRs下游信号通路事件。VISA不仅在诱导抗病毒和炎症反应通路中起到关键作用,它同时还和细胞凋亡,新陈代谢功能有关[4]。虽然目前已经了解VISA接头分子对于先天免疫应答RNA病毒有必要作用,但是其作用的分子机制并不是很清楚。本实验通过酵母双杂交系统,用pGBT9-VISA全长作为诱饵筛选VISA相互作用一些新的蛋白,结合免疫共沉淀和双荧光报告系统等实验验证阳性克隆与VISA互作。通过免疫共沉淀实验,结果显示得到的阳性克隆中Sec13L1能与VISA相互作用,双荧光报告系统研究中发现Sec13L1蛋白对VISA激活IFNβ启动子有正调控作用。此外,免疫共沉淀实验中还检测到Sec13L1与IRF3蛋白有作用,这说明VISA介导的抗病毒信号通路中涉及更复杂的蛋白质互作网络。RIG-Ⅰ类受体存在于细胞胞浆内,能识别病毒RNA,RIG-Ⅰ类受体包括RIG-Ⅰ,MDA5和LGP2。病毒被RIG-Ⅰ识别后,RIG-Ⅰ能发生构象变化从而被激活,激活的RIG-Ⅰ转到线粒体上,与线粒体膜上接头蛋白分子VISA结合,RIG-Ⅰ和VISA结合后作为一个信号平台招募下游更多信号转导分子,IRF3能被招募到这个信号平台上[1]。研究发现VISA与Sec13L1蛋白存在互作,Sec13L1涉及VISA介导的抗病毒信号通路,这提示病毒激活VISA时,Sec13L1也能被招募到VISA信号平台上,Sec13L1和IRF3能通过VISA信号平台发生相互作用。对Sec13L1蛋白和VISA相互作用机理的研究无疑能进一步阐明VISA在抗病毒信号通路中的作用细节,细化先天性抗病毒信号通路蛋白网络。
Sec13L1蛋白属于含WD重复序列的SEC13蛋白家族,它是内质网和核孔复合物组分,对发生于内质网的囊泡运输蛋白是不可缺少的。Sec13L1蛋白在多种细胞隔间内起作用,包括核孔复合物,COPII包被小泡,以及在细胞核中作为一个转录调控蛋白,但目前对于Sec13L1的作用机制并不太清楚。Moreira等[5]通过研究一个低水平表达sec13蛋白的突变鼠模型发现体内sec13表达降低产生了特异性的免疫缺陷,这些突变鼠表现出巨噬细胞MHCI和MHCII低水平的表达, 受刺激的T细胞IFN-γ和IL-6的表达降低,脾脏IFN-γ+CD8+T细胞数降低,相反的是在这些突变鼠中可溶性的膜结合TGF-β以及血浆血球蛋白的产生量很高。此外,在这些突变鼠中CD19+CD5-CD95+和CD19+CD5-IL-4+B细胞的频数降低,而被刺激和免疫时,在这些突变鼠中所观察到的一些缺陷有所补偿。TGF-β的表达水平维持高的状态表明在某些免疫细胞中sec13负调控TGF-β的表达以及它的抑制免疫功能。总之,sec13调控了炎症反应中有关键作用的免疫因子的特异性表达。He等[6]通过对转染pEGFP-N1-X(含HBx全长的真核质粒)和pEGFP-N1的两种HepG2的比较观察发现,转染了pEGFP-N1-X的HepG2细胞中Sec13L1表达增强,虽然目前还不了解其中的分子机制,但提示Sec13L1可能与HBx诱发的肝癌发生有着某种联系。本研究发现Sec13L1蛋白能与VISA互作,并增强VISA诱导的IFNβ产生,此外免疫共沉淀实验表明IRF3和Sec13L1也存在互作关系,这些结果表明Sec13L1参与了先天性抗病毒信号通路,而目前还没有这方面的研究报道,这对Sec13L1蛋白的功能也做了进一步补充。研究发现SEC13L1蛋白和VISA蛋白互作,并正调控VISA激活IFNβ启动子,这也为研究VISA介导的抗病毒先天免疫信号通路调控机制提供新的方向。
虽然本研究发现Sec13L1能通过增强VISA诱导的IFNβ产生参与调控先天性抗病毒通路,但其具体的作用机制目前并不清楚,很多问题仍待解决,比如VISA和Sec13L1在细胞中发生作用的位置,二者相互作用的分子机制,Sec13L1在信号通路中的上下游关系等。
[1] | Xu L G, Wang Y Y, Han K J, et al. VISA is an adapter protein required for virus-triggered IFN-β signaling. Mol. Cell, 2005, 19(6) : 727–740. DOI:10.1016/j.molcel.2005.08.014 |
[2] | Seth R B, Sun L J, Ea C K, et al. Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-κB and IRF3. Cell, 2005, 122(5) : 669–682. DOI:10.1016/j.cell.2005.08.012 |
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