中国生物工程杂志  2017, Vol. 37 Issue (4): 98-103

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王志明.
WANG Zhi-ming.
疫苗递送技术的研究进展
The Progress in the Study of Vaccine Delivery Technology
中国生物工程杂志, 2017, 37(4): 98-103
China Biotechnology, 2017, 37(4): 98-103
http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20170413

文章历史

收稿日期: 2016-11-15
修回日期: 2016-12-17
疫苗递送技术的研究进展
王志明     
华北制药集团新药研究开发有限责任公司 抗体药物研制国家重点实验室 石家庄 050015
摘要: 迄今为止疫苗在人类和动物传染性疾病的控制和预防中依然发挥着其他药物种类难以企及的重要作用。疫苗设计成功的基础在于有效地递送抗原物质以诱发强有力的保护性免疫反应,而疫苗递送载体的合理应用可以加强、改善、甚至改变抗原物质所诱发的免疫应答过程,从而带来优化疫苗接种效果,简化免疫接种程序等有益效果。目前研发中常用的疫苗递送载体可以分为生物载体(如病毒与细菌)与化学载体(如微针与脂质体)两类,在不同递送系统使用方面的重要考虑是有效地利用载体的装载能力和相应特性来达到理想的免疫效果。目前疫苗递送技术的快速进展为现代疫苗的发展提供了有力的技术支撑。
关键词: 疫苗递送     生物载体     化学载体     脂质体     微针    
The Progress in the Study of Vaccine Delivery Technology
WANG Zhi-ming     
NCPC New Drug Research and Development Co., Ltd. State Key Laboratory of Antibody Drug Development, Shijiazhuang 050015, Chian
Abstract: Vaccines remain a cornerstone for the control and prevention of infectious disease in both humans and animals so far. Fundamental to the success of vaccination is the efficient delivery of antigenic cargo needed to elicit robust and proactive levels of immune response. The delivery vector can accentuate, improve, even alter the process of immune response. Such a capability would then offer the potential to optimize vaccination outcomes. The reasonable application of the delivery carrier also can improve the prevention efficiency, simplify the immunization program and so on. Vaccine delivery systems currently used in R & D can generally be categorized into biological (e.g. viral or bacterial) and chemical vectors (e.g. microneedle or liposome). An important consideration in adopting delivery technology is effectively using the capabilities and features of the chosen vector to achieve an ideal effect of vaccination. Now the rapid progress of vaccine delivery technology provides a powerful technical support for the development of modern vaccines.
Key words: Vaccine delivery     Biological vectors     Chemical vectors     Liposome     Microneedle    

疫苗是抵御微生物感染最理想的手段,成本最低,对机体的损害最小。迄今人类消灭的传染病,都是通过疫苗实现的,世界上尚无借非疫苗方法消灭某种传染病的先例。疫苗的免疫效果取决于抗原与佐剂的选择、接种途径及递送系统等诸多方面,其中疫苗递送系统 (vaccine delivery system) 是指一类能够将抗原物质携带至机体的免疫系统,并在其中较长时间储存和发挥其抗原作用的物质。递送系统用于疫苗设计的优点,除通过改变抗原提呈方式,招募抗原提呈细胞等途径提高疫苗的免疫效果外,还可以通过保护抗原、影响抗原定位、储存与缓释抗原成分等作用,较长时间地刺激免疫系统,减少免疫次数,简化接种程序,提高预防接种效益等,具有非常重要的现实意义。疫苗递送系统可以分为生物载体与化学载体两类[1],在递送系统使用方面的重要考虑因素是有效地利用载体的装载能力和相应特性来改善或增强传统疫苗制剂的效果。

1 生物载体递送疫苗

生物载体疫苗也被称为活载体疫苗,是应用基因工程技术以非致病性微生物作为载体来表达外源抗原,目前研究较为广泛的生物载体主要为病毒和细菌。该类疫苗向宿主免疫系统提交抗原物质的方式与自然感染时的真实情况很接近,诱导产生体液免疫和细胞免疫,甚至黏膜免疫。生物载体疫苗兼具活疫苗的免疫效力高、成本低及灭活疫苗安全性好等优点,是未来疫苗研制与开发最为活跃也最有希望的发展方向。

虽然具备上述的诸多优点,生物载体在实际应用中始终伴随有不可避免的限制,如致癌性、广泛的趋向性以及某些生物载体难以实现规模化生产等。

1.1 病毒载体

病毒是在漫长的自然进化过程中存活下来的没有细胞结构的最小、最简单的生命寄生形式。它们通常可以高效率地进入特定类型的细胞,表达自身蛋白并产生新的病毒粒子,因此病毒可经过改造而成为转移和表达外源基因的载体。未经改造的病毒侵染宿主细胞能将自身的基因组携带至胞内,并利用宿主细胞完成自身繁殖,最终可使人类产生疾病,因此疫苗设计中所用的病毒载体是去除了其基因组中的致病基因,保留其携带基因进入宿主细胞的功能,将理想的外源基因组装进去而成为一种病毒载体。疫苗设计中使用的病毒载体要求低毒、高效、大容量,可控制基因转导及表达。目前用于疫苗研究的病毒载体主要包括痘病毒载体、腺病毒载体等。

1.1.1 痘病毒载体疫苗

痘病毒 (poxvirus) 在病毒学、免疫学和疫苗学等方面发挥着十分重要的作用。1798年,英国医生Edward Jenner从牛痘病毒 (cowpox virus) 中制备活疫苗用于预防天花 (smallpox,variola) 并获得成功,奠定了免疫学的基础。1980年,世界卫生组织宣布人类消灭了天花,建议不再进行天花的疫苗接种。而这一年人类利用重组DNA技术成功地将痘苗病毒 (vaccinia virus,VV) 开发成为一个高效表达外源基因的病毒载体,这种载体可以用于疫苗的研制,为与痘病毒无关的疾病预防与控制提供了重要的技术手段。痘病毒是所有病毒中最大的病毒,病毒基因组为线状双链DNA,约130~375kb,含有约185个开放读框 (ORF)。

由于痘病毒较强的免疫原性,作为疫苗载体时会掩盖所携带抗原的免疫应答,一系列改良减毒痘病毒被用作疫苗载体,其中使用最为广泛的是正痘病毒属 (orthopoxvirus) 的改良安卡拉痘苗病毒 (modified vaccinia virus Ankara, MVA)[2]与纽约痘苗病毒 (New York attenuated vaccinia, NYVAC),禽痘病毒属 (avipox virus) 中的鸡痘病毒 (fowlpox virus, FPV) 与金丝雀痘病毒 (canarypox, ALVAC)。痘病毒作为病毒表达载体具有插入外源基因容量大、易于构建多价疫苗、易于建立符合GMP要求的大规模生产工艺等优点,最为重要的是痘病毒可有效地刺激机体的体液免疫反应与细胞免疫反应,目前至少有百余种外源基因在痘病毒载体中获得了较好的表达[3]

由于较为宽松的监管要求与更有效的效果评价体系,目前至少9种应用于畜牧领域的重组痘病毒载体疫苗已经商业化,包括6种ALVAC载体疫苗,2种FPV载体疫苗与1种VV载体疫苗,这些疫苗主要递送引起牲畜传染疾病的病毒病原体相关抗原:狂犬病病毒 (rabies virus)、新城疫病毒 (Newcastle disease virus)、禽流感或马流感病毒 (avian or equine influenza virus)、西尼罗河病毒 (West Nile virus)、犬瘟热病毒 (canine distemper virus) 与猫白血病病毒 (feline leukaemia virus)[4]。表达禽类病原体主要免疫原的重组鸡痘病毒 (recombinant fowlpox virus,rFPV) 是第一个商品化的活载体疫苗种类,用于禽类传染疾病的预防具有显著的疫苗成本效益。这些活载体疫苗有效地递送目的病毒的血凝素或表面糖蛋白,激发动物机体的适应性免疫反应,提供有效的保护。

1.1.2 腺病毒载体疫苗

腺病毒 (adenovirus, Ad) 是基因治疗药物研发中较常使用的载体,腺病毒粒子直径为70nm~90nm,无包膜。虽然基因治疗药物与疫苗研发中对载体免疫原性要求截然相反,相对于其他病毒载体,Ad作为疫苗载体具有许多优点:(1) 具有高效的免疫原性,在哺乳动物体内可同时诱导固有免疫和适应性免疫应答;(2) 其基因组较大,易于进行DNA重组操作;(3) 腺病毒DNA不整合到宿主染色体上,不会引起插入突变;(4) 腺病毒致病性小,重组腺病毒结构稳定。目前Ad作为载体被广泛应用于重要感染性疾病及恶性肿瘤的疫苗研究,然而,由于Ad在自然界的广泛传播,机体对载体的预先免疫反应是阻碍腺病毒载体疫苗在临床中应用的主要问题。

正在进行临床前研究与进入临床试验阶段的腺病毒载体疫苗除了针对HIV与EBOV,还有流感病毒 (influenza virus)、登革热病毒 (dengue virus) 与丙型肝炎病毒 (hepatitis C virus),除病毒感染之外,腺病毒载体疫苗也被开发用于结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis) 引起的感染与恶性疟原虫 (Plasmodium falciparum) 引起的疟疾。AdHu-5由于其出色的免疫原性与安全性,是腺病毒载体疫苗研究初期最为广泛使用的血清型,但鉴于人群中广泛存在的中和抗体,AdHu-5载体疫苗在临床上的应用受到了极大限制。现在的研究正在转向较为少见的人腺病毒血清型,如AdHu-26、AdHu-35,或者非人灵长类腺病毒,如黑猩猩腺病毒。

除了广泛使用的痘病毒与腺病毒疫苗递送载体,其他病毒载体疫苗的研发也取得了令人瞩目的成绩,如2016年7月Merck公司研究开发的埃博拉病毒 (Ebola virus, EBOV) 疫苗V920(rVSV delta G-ZEBOV-GP) 获得了美国FDA授予的候选疫苗突破性疗法认定,以及欧洲药品管理局 (EMA) 授予的PRIME (重点药物,Priority medicines) 资格,目前已启动临床Ⅲ期研究,据报道将在两年内完成至少12个临床研究。V920就是重组水泡性口炎病毒 (recombinant vesicular stomatitis virus, rVSV) 载体疫苗,该疫苗采用反向遗传学技术开发,所使用的VSV没有VSV本身的糖蛋白,其本身的糖蛋白基因被埃博拉扎伊尔型的糖蛋白所取代,所以人体对这种载体的免疫力比较弱,故而会对EBOV应答得比较好。在药效学研究中该疫苗只需要一次接种,就可以对豚鼠和非人灵长类达到100%的保护率,而且没有出现病毒血症[5],目前已完成的临床研究表明该疫苗具有良好的安全性,为目前尚无疫苗可用的传染病疫苗上市带来了希望。

1.2 细菌载体

以沙门氏菌 (Salmonella spp)、李斯特菌 (Listeria monocytogenes) 和卡介苗等细菌以及细菌菌影[6]作为疫苗载体已越来越引起研究者们的兴趣,细菌除了具有病毒载体的相关优点外,还具有培养构建方便,外源基因容纳量大,刺激细胞免疫力强等优点,细菌载体本身 (如细胞壁成分与大分子成分) 就是强有力的天然佐剂,具有巨大的应用潜力。构建细菌载体疫苗需要把外源基因插入合适的质粒,转化进细菌,或将外源基因直接整合至细菌染色体,由于细菌在形态结构与遗传物质各个方面的复杂程度远胜于病毒,细菌为载体的疫苗比重组病毒载体疫苗的研究难度更大。同时,细菌载体以质粒表达系统表达疫苗的保护性抗原时,遇到的最大问题是消除抗性压力和稳定性表达的问题,目前解决这些问题的通常方法是通过基因重组技术,构建宿主-载体平衡致死系统,以此来表达疫苗的保护性抗原,这种技术已经广泛应用于不同种属的减毒疫苗的开发研制过程中。

1.2.1 李斯特菌载体疫苗

李斯特菌 (L. monocytogenes) 是一种革兰氏阳性细菌,在人类和动物中引发侵袭性感染的李斯特菌病,特别是在免疫功能受损或低下的情况。目前,一些减毒李斯特菌已被用于递送多种病毒和肿瘤相关抗原,包括人乳头瘤病毒 (human papillomavirus, HPV)16E7、HER-2/neu、高分子量黑色素瘤相关抗原、前列腺特异性抗原 (prostate specific antigen, PSA) 等。在小鼠肿瘤模型中的临床前研究表明,这些载体疫苗具有显著的免疫原性,能引起靶抗原阳性的相关肿瘤消退。重组Lm-HPV16 E7 (ADXS11-001) 在宫颈癌患者中开展了临床Ⅰ期试验,试验数据显示了这种载体疫苗良好的安全性和有效性,具有潜在的开发价值[7]。分泌表达人CD24的减毒李斯特菌载体疫苗能够有效地增强Th1与Th2型免疫反应,减轻疾病症状,延长荷瘤小鼠的生存时间[8]

1.2.2 沙门氏菌载体疫苗

沙门氏菌 (Salmonella) 是革兰氏阴性菌,目前两种血清型的沙门氏菌用来作为疫苗载体:鼠伤寒沙门氏菌与人伤寒沙门氏菌。在自然感染过程中,沙门氏菌通过口服途径进入宿主,入侵滤泡相关上皮内专门的抗原输送膜细胞 (M细胞),寄生于小肠的Peyer's结,进入肠道相关淋巴组织,迁移至肠系膜淋巴结,并传播到肝脏和脾脏。沙门氏菌表达多种PAMPs (如鞭毛素与脂多糖),引发广泛的固有免疫反应与适应性免疫反应,还能刺激黏膜免疫,可通过口服给药而避免注射途径,因此作为疫苗载体更具吸引力。已报道的研究中所携带抗原来源包括感染性细菌、病毒、肿瘤相关抗原[9],尽管开展了众多的临床前试验,但鲜有进入到临床试验阶段[10]

虽然都是胞内感染,李斯特菌和沙门氏菌表达抗原后的亚细胞定位不同所引发的免疫反应也不相同。通过吞噬作用进入抗原提呈细胞后,李斯特菌能够从噬菌小体逃逸直接进入感染细胞的细胞质,载体携带抗原会作为内源性抗原被细胞表面上的MHCⅠ类分子结合展示,产生较强的细胞免疫应答。而沙门氏菌缺乏吞噬体逃逸机制,载体携带抗原作为外源性抗原与MHC Ⅱ类分子结合展示主要引发Th2型免疫反应,由此带来的不同也决定了它们作为疫苗载体有不同的应用[11]

1.2.3 乳酸菌载体疫苗

目前,重组细菌疫苗所用的活载体多为减毒致病菌,在使用安全问题上存在一定的隐患。因此人们把目光集中在一些安全无害的细菌上,期望利用其作为载体研制更为安全的疫苗。乳酸菌 (lactic acid bacteria,LAB) 长期应用于食品工业各个领域,比如发酵制品的生产和保存,是一种公认的安全级 (generally recognized as safe, GRAS) 微生物。目前,对于乳酸菌来说,除了利用基因工程菌进行食品发酵之外,其作为载体递呈治疗性蛋白或抗原的功能已成为研究热点。

乳酸乳球菌 (lactococcus) 与乳酸杆菌 (lactobacilli) 是乳酸菌应用于疫苗递送载体研究中的模式菌株,尤其是作为黏膜免疫疫苗的理想载体具有独特的优势:首先,常用的疫苗生物载体,如沙门氏菌和痘病毒等,大多数是病原菌,即使是减毒病原体依然具有一定危险性,而乳酸菌是一种食品级微生物,尤其是对于特定人群如老年人、婴幼儿来说有具有更好的安全性;其次乳酸菌是革兰氏阳性菌,不产生脂多糖等促炎物质,因此具有弱抗原性,其作为载体本身不会引起强烈的免疫应答;再者,乳酸菌自身分泌蛋白较少,从而减少了对外源分泌蛋白的干扰,而且不产生胞外蛋白酶,从而保证分泌蛋白不被降解,保证其结构和功能的完整性;另外乳酸菌在所有肠段都具有代谢活性,直接接触肠粘膜,促进外源蛋白向黏膜的呈递。

表达HPV-16(human papillomavirus type 16) E7抗原的乳酸球菌载体疫苗在预防病毒性疾病方面显示了重要的应用潜力[12],表达β-乳球蛋白 (β-lactoglobulin, BLG) 的乳酸球菌载体疫苗[13]在预防与治疗慢性消化性疾病、表达抗氧化蛋白的乳酸杆菌载体疫苗[14]在治疗胃肠道炎症疾病方面,在相关的动物模型试验中都显示了良好的疗效。第一个进入人体试验阶段的乳酸菌载体疫苗为治疗克罗恩病的重组表达IL-10的乳酸球菌载体疫苗[15],但是在临床ⅡA阶段,该疫苗在黏膜愈合方面与安慰剂组并没有显示出统计学上的显著差异。虽然乳酸菌是运载外源抗原的理想载体,可通过滴鼻或口服在黏膜水平将相关抗原提呈宿主免疫细胞,但是乳酸菌载体疫苗从试验研究走向临床应用还面临着许多需要解决的技术难题。

2 化学载体递送疫苗

化学疫苗载体具有安全性好、低成本、易规模化等生物载体没有的显著优点,应用于疫苗研究的化学载体主要包括微针、脂质体、纳米颗粒聚合物等,但化学载体的研究总体还处于起步阶段,还存在着较多未解决的问题。其中,最大的问题是转染效率低,靶向性差。其中,发展较为迅速的包括脂质体与微针。

2.1 脂质体

脂质体是由磷脂和其他极性两性分子以双层脂膜构成的密闭的、向心性囊泡,它对与其结合或偶联的蛋白或多肽抗原具有免疫佐剂和载体的作用。脂质体具有天然靶向性,可将抗原靶向网状内皮系统,从而优先被抗原提呈细胞摄取;而且对包裹的抗原有缓释作用,减少抗原的剂量及接种次数;更具有抗原提呈作用,脂质体内高浓度抗原可独立激活某些T细胞。鉴于脂质体的制备成本和价格,已上市的脂质体药物多数集中在毒性较大的抗癌和抗感染药物领域,在疫苗领域上市的脂质体疫苗为流感疫苗InflexalⅤ与甲肝疫苗Epaxal。

目前对脂质体载体疫苗的研究主要集中于传统的亚单位疫苗的改造[16-18],如运用先进的脂质体生成技术生产的钴卟啉-磷脂双分子层脂质体,通过亲和络合可以方便地将脂质体与His标签的多肽抗原混合,该方法赋予合成或基因工程产生的His标签多肽表面方向性 (surface orientation),而该脂质体出众的抗原装载能力更使其能够递送多价蛋白疫苗,或赋予该递送载体疫苗更高的免疫特性,该脂质体为高频突变病原体 (如肺炎链球菌) 相关疫苗的研发提供了一个颇有潜力的技术平台[19]。由于脂质体本身在结构系统上具有可变性,可以满足许多不同的功能的需求,脂质体作为疫苗递送载体的优势将得到继续发展。

2.2 微针

除少数几种口服疫苗,疫苗最常见的给药方式为皮下注射。这种方法虽然有效,但皮下注射通常给患者带来额外的疼痛,在注射点容易造成皮肤局部损伤,也必须由受过专业训练的医护人员操作,因此用药的依从性会下降,尤其是需要多次给药的疫苗种类。

微针给药是近年来发展的一种新型给药系统。疫苗微针外表就像一张纹身贴,表面分布着多列微针,微针是微米级尺寸的微小突起,一般由可溶性生物兼容材料制备而成,疫苗以内嵌或涂层的方式装载。把疫苗微针贴在皮肤上,微针穿过皮肤角质层,到达活性表皮层,由于未触及真皮层的神经末梢和血管,因此不会产生疼痛感,也更安全。而且该皮肤层包含丰富的抗原提呈细胞网络 (network of APCs),相对于传统疫苗通过注射器注射到肌肉,微针疫苗递送到具有丰富免疫细胞的皮肤层,会产生更好的免疫效果。而且固体形态的微针可装载药物在室温下保存,无需低温保藏,大大降低了运输和存储成本。

目前的研究中微针已经能够有效地递送各种疫苗:减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗与DNA疫苗[20],例如最近的一项研究利用可溶性聚电解质多层膜制备微针,装载HIV的DNA抗原,能够在皮肤中的给药部位储存与缓释抗原成分,较长时间地刺激免疫系统[21]。由于其独特的给药途径,微针能够严重影响免疫应答的类型,如装载M2e-TLR5融合蛋白的微针更加倾向于引发Th1型反应,与通过鼻腔给药引发Th1/Th2型免疫反应相比,对流感的预防效果更好[22]。这种对免疫反应的影响可用于疫苗的生产以及提高现有疫苗的有效性。

3 总结与展望

从全球范围来看,新药研发的难度在持续增加,开发速度和成效明显放缓,由此释药系统研究与开发成为制药行业发展最快的领域之一,药物递送技术的研发走在了创新的最前沿。疫苗递送系统的运用能够改善或者改变传统疫苗的免疫应答,优化疫苗接种的效果,简化疫苗接种程序等。常用疫苗递送系统中,病毒载体、细菌载体与以脂质体和微针为代表的化学载体在实际应用中各有优势、劣势、不同的应用范围,合理地应用疫苗递送载体可在很大程度上达成疫苗的改善目标。随着现代生物技术与材料科学的进展,多种技术手段用于发展新的疫苗递送载体,疫苗递送载体的技术进展也必将为疫苗领域的创新注入新的活力。

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