胚胎干细胞 (embryonic stem cells, ESCs) 分离自着床前的囊胚内细胞团细胞，在体外能够无限地进行自我复制式地增殖 (自我更新)，同时还保持着分化为三个胚层来源的各种类型细胞的潜能 (分化)，现已成为研究基因功能、筛选药物和制造疾病动物模型的强有力的工具，具有重要的社会和经济价值^[1-2]。第一株胚胎干细胞于1981年分离自小鼠 (mouse ESCs, mESCs)^[1-2]，此后mESCs广泛应用于各类研究中，成为重要的干细胞研究材料。目前人们对于胚胎干细胞如何维持自我更新状态已做了多方面研究，并探索出一些体外维持其处于未分化状态的体系，如含LIF的有血清培养体系^[3]，以及含GSK3抑制剂CHIR99021和MEK抑制剂PD0325901的无血清培养体系 (即2i)^[4]。但目前人们对于mESCs如何退出自我更新状态、向特定发育阶段分化了解得还不够清楚。

生长阻滞和DNA损伤诱导蛋白45γ(Growth arrest and DNA-damage-inducible protein GADD45 gamma，Gadd45g) 是GADD45蛋白家族三成员之一，也叫做细胞因子应答基因6(CR6)^[5-7]，可影响细胞周期，负调控细胞生长^{[6, 8]}。此前，关于Gadd45g的研究主要集中在肿瘤以及神经前体发育^[8-10]等方面，发现Gadd45g可以抑制肿瘤细胞生长，促进其凋亡^{[8, 10]}，这种抑制作用部分通过影响LIF/JAK/STAT3信号通路来实现^[8]，而LIF/JAK/STAT3也是维持ESCs自我更新状态的重要信号通路之一^{[3, 11]}；此外，对于非洲爪蟾胚胎发育的研究发现，Gadd45g密切参与囊胚期细胞退出多能性状态、向终末细胞分化的过程^[12]，但目前关于Gadd45g在ESCs中的作用尚无相关报道。本研究通过在mESCs中过表达Gadd45g，发现其可以抑制细胞的增殖速率，促进mESCs向中内胚层分化，且这种促进作用可能是通过抑制STAT3的磷酸化而实现的。研究结果将扩大人们对ESCs内部调控机制的认识，有利于未来ESCs的基础研究和安全应用。

1 材料与方法 1.1 材料

46C小鼠胚胎干细胞系，由剑桥大学Welcome Trust Center的Austin Smith教授馈赠。KOD Hot Start DNA Polymerase PCR试剂盒 (EMD Millipore公司)；BglⅡ、XhoⅠ和T4连接酶 (TaKaRa公司)；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒抽提试剂盒 (TIANGEN公司)；LTX脂质体 (Invitrogen公司)；碱性磷酸酶检测试剂盒 (Sigma公司)；Puromycin (Invitrogen公司)；α-tubulin (1:200)、Gadd45g (1:200)、Oct4(1:50)、Nanog (1:100)、FLAG (1:1 000)、STAT3(1:1 000) 和Phospho-STAT3(1:2 000) 等抗体购自Santa Cruz、ReproCELL、Sigma和CST等公司。

1.2 mESCs的培养与传代

mESCs的有血清培养体系为：DMEM (Gibico)、10%胎牛血清 (Hyclone)；1×MEM (Invitrogen)、2 mmol/L L-glutamine (Invitrogen)、0.01 mmol/L β－巯基乙醇 (Sigma) 以及1000 U/ml LIF (Millipore)。mESCs的无血清培养体系为：1×N₂, 1×B27(Invitrogen)、DMEM/F12(Invitrogen)、Neurobasal^® Medium (Invitrogen)、2mmol/L L-glutamine (Invitrogen)、0.01mmol/L β－巯基乙醇 (Sigma) 以及3μmol/L CHIR99021(Sigma)、1 μmol/L PD0325901(Sigma)。在接种细胞前，培养皿用0.1%的Gelatin (Sigma) 进行包被。当细胞的覆盖密度达到70%~80%时，用胰酶 (Invitrogen) 消化成单个细胞进行传代培养。

1.3 Gadd45g重组质粒的构建、转染和筛选

Gadd45g蛋白编码区的克隆引物为Gadd45g-Forward：5′-ATGACTCTGGAAGAAGTCCGTGGC-3′；Gadd45g-Reverse：5′-TCACTCGGGAAGGGTGATGCT-3′。在上下游引物两端分别添加BglⅡ和XhoⅠ限制性内切酶位点，并连入携带Flag标签蛋白的PiggyBac (PB) 系统。Flag标签蛋白为编码8个氨基酸 (DYKDDDDK) 的亲水性多肽，可与目的蛋白Gadd45g融合表达，为后续验证提供方便，通过检测Flag蛋白是否表达即可判断Gadd45g存在与否，而对照组中单独存在的Flag则因分子量过小而不会被检测到。利用LTX脂质体将重组质粒转染进mESCs，两天后加入终浓度为2 μg/ml的Puromycin药物进行筛选。

1.4 细胞计数

事先在培养皿中接种一定数量的细胞，在计划的天数利用胰酶进行单细胞消化，离心重悬后，吸取一定量的悬液至血细胞计数板，在显微镜下进行计数 (对于压线细胞，采取计上不计下，计左不计右的原则进行计数)、记录和统计。细胞数目 (个/ ml)=(四角大方格细胞总数/4)×10⁴。

1.5 Western blot检测

收集各组细胞，利用添加了蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞，利用BCA法测定总蛋白浓度。用4%~12%的SDS-PAGE梯度胶分离蛋白组分。利用湿转系统将蛋白转移至PVDF膜上，经过封闭、一抗孵育、PBST洗脱、HRP标记的二抗 (1:2 000) 孵育、PBST再洗脱等步骤后，ECL化学发光及X光片曝光，经显影和定影处理，最终获得清晰条带。

1.6 荧光实时定量PCR (qRT-PCR)

用Trizol法抽提细胞总RNA, 参照TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (TransGen) 试剂盒说明书进行第一链cDNA合成。荧光定量PCR参照TransStart Tip Green qPCR SuperMix (TransGen) 试剂盒执行。GAPDH基因表达水平作为内参。引物序列见表 1。

1.7 碱性磷酸酶染色

弃掉对照组和实验组细胞培养液，加入4%多聚甲醛室温固定2 min。参照说明书将碱性磷酸酶检测试剂盒中的两种染液按照48:2的比例混合。弃掉多聚甲醛，加入混合染液，室温避光30 min。PBS漂洗后在显微镜下观察。

1.8 免疫荧光

弃掉培养液，4%多聚甲醛室温固定20min。PBS漂洗后加入封闭液 (含5% BSA，0.2% Triton X-100的PBS)，37℃温箱孵育1h。加入含有一抗的稀释液，4℃过夜。次日PBS漂洗3次。添加携带荧光基团的二抗 (1:500，碧云天) 以及Hoechst (1:5 000, Invitrogen) 染料的稀释液，37℃避光孵育1h。PBS漂洗后在荧光显微镜下观察拍照。

1.9 统计学处理

实验数据用mean±SD表示，采用SPSS 15.0统计分析软件进行统计检验，组间比较用t检验，P＜0.05时认为组间差异显著，P＜0.01时认为组间差异极显著，结果具有统计学意义。

2 结果 2.1 Gadd45g稳定表达细胞株的建立

借助LTX，将空白对照质粒PB，以及携带两个Flag标签蛋白的Gadd45g重组质粒 (PB-2Flag-Gadd45g) 分别转染进46C mESCs中。经Puromycin药物筛选一周后，qRT-PCR和Western blot检测结果显示：PB-2Flag-Gadd45g实验组中可检测到Flag蛋白的表达，Gadd45g在转录和蛋白水平的表达量显著增高 (图 1a, b)，说明过表达Gadd45g的mESCs系构建成功。

2.2 Gadd45g对mESCs生长速率的影响

血清和LIF培养体系下，在不同的细胞培养皿中接种起始数目相同的细胞，每2天一次对细胞进行计数，以观察细胞的生长情况。结果显示：PB-2Flag-Gadd45g mESCs的生长速度较PB mESCs缓慢 (图 2)，说明Gadd45g减缓了胚胎干细胞的增殖速率，对胚胎干细胞的生长具有抑制作用。

2.3 Gadd45g对mESCs碱性磷酸酶活性的影响

PB-2Flag-Gadd45g mESCs经过两次传代之后，在血清和LIF培养体系下，细胞边缘形态变成纤维状。为了验证这些细胞的自我更新状态，我们进行了碱性磷酸酶染色实验，因为未分化的mESCs具有很高的碱性磷酸酶活性，该特性可作为细胞是否处于自我更新状态的判断依据。结果显示：PB对照组细胞形成的克隆排列密集且边缘较为清晰，具有很高的碱性磷酸酶活性，而PB-2Flag-Gadd45g 细胞染色较浅或丢失 (图 3)，因此上调Gadd45g会降低mESCs的碱性磷酸酶活性水平。

2.4 Gadd45g对mESCs自我更新标志基因表达的影响

mESCs在自我更新状态下高表达Oct4、Nanog、Klf2等基因。利用qRT-PCR和免疫荧光技术检测过表达Gadd45g后上述标志基因在细胞中的表达情况。结果显示：与PB对照组细胞相比，PB-2Flag-Gadd45g细胞中Oct4、Nanog、Klf2在转录水平上的相对表达量较低 (图 4a)；而在蛋白水平上，过表达Gadd45g的细胞中OCT4和NANOG的表达量亦有所降低 (图 4b)，因此上调Gadd45g会抑制mESCs自我更新标志基因的表达。

2.5 Gadd45g对分化基因表达的影响

在PB-2Flag-Gadd45g细胞的碱性磷酸酶活性和自我更新标志基因表达都降低的情况下，我们继续应用qRT-PCR来检测细胞中分化基因的表达情况。结果显示：与PB对照组细胞相比，内胚层和中胚层的标志基因在PB-2Flag-Gadd45g细胞中都明显上调，而外胚层标志基因的表达未出现变化 (图 5)，说明在自我更新的维持条件下，过表达Gadd45g会促进mESCs向中内胚层分化。

2.6 Gadd45g对mESCs中STAT3磷酸化水平的影响

由以上结果可知，在LIF和血清的培养条件下，过表达Gadd45g会诱导mESCs向中内胚层分化，而LIF主要通过激活STAT3来促进mESCs的自我更新，因此我们尝试去检测STAT3的活性，即STAT3第705位酪氨酸磷酸化水平是否出现变化。Western blot结果显示：上调Gadd45g不会改变STAT3总的蛋白表达水平，但是STAT3的磷酸化水平对照组细胞出现了下降 (图 6a)，说明Gadd45g通过抑制STAT3的磷酸化，使LIF/STAT3信号通路的激活受阻。为排除由于细胞状态变化而导致STAT3磷酸化水平改变的可能性，我们在N2B27/2i条件下进行了验证，结果显示：在2i的培养条件下，上调Gadd45g依然抑制STAT3的磷酸化水平 (图 6b)。而LIF/STAT3可以通过抑制中内胚层的形成来维持mESCs的未分化状态^[12]，所以Gadd45g可能通过部分抑制STAT3磷酸化来诱导mESCs退出未分化状态，向中内胚层方向分化。

3 讨论

胚胎干细胞能够在体外无限地进行自我更新式的增殖，同时保持着分化成不同类型细胞的潜能，因而在临床医学上具有远大的应用前景。而了解其内部的调控网络与机制是将来安全应用ESCs的基础，现已成为再生医学领域的研究热点。目前已鉴定出一些可以调控mESCs自我更新和分化的转录因子，如Tfcp2l1, Esrrb, Nanog和Gbx2等，这些转录因子可以替代一些外源性的细胞因子来促进mESCs的自我更新^[13-15]，而Axin2, Otx2和Tfe3等则会诱导mESCs退出自我更新程序^[16-18]。本研究结果首次表明Gadd45g可以促进mESCs向中内胚层分化，这种促进作用可能是通过抑制STAT3磷酸化来实现的。

Gadd45蛋白家族参与细胞周期调控，抑制细胞的生长与增殖^[5-6]，这已被广泛认知，例如，当细胞受到刺激损伤后，p53基因产物被磷酸化，通过激活p21和Gadd45，诱导细胞生长停留^[19-21]。在本研究中，Gadd45g对于mESCs同样具有抑制增殖的作用，其内部机制的阐明有待后续深入探究。在发育与分化方面，Gadd45g高表达于脊椎动物的神经前体细胞，通过调控细胞周期蛋白活性，如CDK1和Cyclin B1等，促进神经元的分化和神经系统的发生^[22-23]；此外，Gadd45g影响小鼠性别的决定和发育，但缺失Gadd45g基因的小鼠不会胚胎致死，说明其对于多能性干细胞的维持来说不是必需的^[24]，而且有研究表明Gadd45g在mESCs内的表达被多能性基因Oct4抑制，其表达会随着mESCs的分化而升高^[25]，这与我们的研究结果相一致，说明Gadd45g具有促进mESCs分化的作用。在肿瘤细胞中，Gadd45g会负调控LIF/JAK/STAT3信号通路来抑制肿瘤细胞的生长。而LIF/JAK/STAT3也是维持ESCs未分化状态的重要信号通路之一。LIF与受体结合后招募膜蛋白gp130形成异聚体，随即激活gp130蛋白上的JAK，激活的JAK将磷酸化STAT3第705位酪氨酸，随后磷酸化的STAT3发生二聚化，进入核内激活相应靶基因的表达，从而促进mESCs维持自我更新状态^[11]。在mESCs中，LIF通过激活STAT3抑制中内胚层的分化，而血清中的成分，如BMP4，则会阻断外胚层的形成，因而将mESCs维持在未分化状态^[11]。本研究中，我们发现在LIF和血清的培养体系下，上调Gadd45g的表达会上调中内胚层标志基因的表达，并且会抑制STAT3的磷酸化，但外胚层标志基因的表达水平不发生改变；为排除细胞状态变化的干扰，我们在2i无血清培养体系中也重复了相关实验，发现Gadd45g同样会抑制STAT3的磷酸化。因此，Gadd45g诱导mESCs向中内胚层分化部分是通过抑制STAT3磷酸化而实现的 (图 6c)。

综上所述，本研究首次探讨了Gadd45g在ESCs中的作用及部分机制，对于更加深入和全面地了解ESCs内部信号调控网络具有重要意义。但目前仍存在一些问题有待进一步探索：Gadd45g以何种方式抑制STAT3磷酸化？该过程是否直接抑制自我更新基因或诱导分化基因表达？下调Gadd45g的表达将对mESCs产生怎样的影响？在细胞周期调控方面，Gadd45g对ESCs的生长抑制作用又与哪些基因或蛋白相关？这一系列问题的答案将在后续实验中逐步阐明，而对于整个干细胞调控网络和细胞命运决定机制的不断揭示与丰富，则能为今后干细胞的安全应用提供有力保障。