骨髓间充质干细胞是一类多能干细胞，在骨髓中含量最丰富。在体内外相应诱导条件下，可分化为软骨、骨肌、肌肉、脂肪等组织^[1-2]。而由于其具有来源丰富，易于分离培养，免疫原性低等特点，它成为骨损伤疾病及组织工程中理想的“种子细胞”^[3]。小鼠胚胎成纤维细胞 (mouse embryonic fibroblasts, MEFs) 在体内外具备MSCs特征，是研究MSCs的相关实验的重要细胞^[4-6]。

BMP4是TGFβ超家族的一员，在体内外具有促进成骨的能力^[7]。Notch信号在进化上是一条保守的信号通路，相邻细胞上的Notch配体与受体相互作用传导信号，对细胞的分化，增殖和凋亡发挥重要作用^[8]。目前研究发现，Notch信号在MSCs成骨分化过程中发挥着重要作用，已发现其促进BMP2，9诱导的MSCs成骨分化^[9-13]。那么Notch对其他成骨BMPs是否有相同的作用，其类似的信号通路呢？研究发现高密度细胞接触激活Notch信号后，其配体DLL1的表达增高，AdDLL1能激活Notch信号^{[11, 14]}。有研究报道DLL1可以与Notch1结合激活Notch信号，而dnNotch1能抑制Notch信号^{[13, 15]}。所以课题研究应用γ-secretase的抑制剂DAPT和dnNotch1下调Notch信号，用AdDLL1上调Notch信号。故本研究拟采用Notch化学抑制剂DAPT、AddnNotch1下调Notch，AdDLL1上调Notch探讨Notch信号对另一重要的成骨BMPs中的BMP4诱导MSCs成骨分化、增殖的影响及可能的机制，以了解Notch在成骨BMPs诱导成骨中作用的广泛性，为其在临床BMPs的应用提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 细胞株及腺病毒

MEFs细胞、AdRFP，AdGFP，AdDLL1，AddnNotch1，AdBMP4均由芝加哥大学何通川教授惠赠并由本实验室保存，人结肠癌细胞株HCT116，人胚肾293细胞株 (HEK293) 由重庆医科大学分子实验室保存。

1.1.2 试剂

DMEM/HIGH GLUCOSE培养基 (Hyclone公司)，胎牛血清 (Gibco公司)，免疫细胞化学染色试剂盒 (中杉金桥公司)，ALP染色试剂 (Sigma公司)，RNA提取试剂Trizol (Invitrogen公司)，引物 (Invitrogen公司合成)，p-Smad1/5/8抗体 (Cell Signaling Technology公司)，DAPT_565784(Calbiochem公司)，茜素红S、维生素C和β-磷酸甘油 (Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与处理

复苏HCT116，MEFs细胞，培养于含10 %胎牛血清、1 %青霉素/链霉素 (P/S)、DMEM高糖培养基中。37 ℃、5 % CO₂条件下培养。待细胞贴壁生长并融合至80 %左右时，用胰蛋白酶消化传代。

1.2.2 条件培养基的制备

HCT116细胞培养于直径100 mm的培养皿中，待细胞融合至70 % ~ 80 %时，加入AdGFP或AdBMP4，控制感染率为80 %，在4 h后换成无血清无抗生素的培养基，分别在24 h和48 h后收集培养基，离心取上清4 ℃保存备用，上清内含有一定浓度的BMP4蛋白，AdGFP的条件培养基作为空白对照。

1.2.3 ALP活性测定与染色

将MEFs细胞以2×10⁴/孔接种至24孔板，细胞融合至30 %左右时，加入AdRFP，AdDLL1或AddnNotch1后换液，待红色荧光出现后 (约36 h)，加入适当量的BMP4-CM，培养5~7天后进行ALP活性定量与ALP染色分析。ALP染色：弃去培养基，每孔200 μl ALP染色液，避光，约10~30 min后观察染色情况。ALP活性定量分析：弃去培养基，加入细胞裂解液100 μl/孔，静置10 min。刮下细胞裂解物并收集至EP管，13 000 r/min离心5 min。另一EP管中加入ALP底物与Lupo Buffer混合液 (1:3)20μl，加入5μl裂解上清，混匀，避光45~60 min后检测。

1.2.4 茜素红S染色测定细胞钙盐沉积

MEFs细胞以2×10⁴/孔接种于24孔板，细胞融合度达到30 %时加入不同的处理因素，6 h后换液，同时加工作浓度50μg /ml维生素C、10mmol /L的β-磷酸甘油，继续培养14d进行茜素红S染色:弃去孔板中的培养基，PBS洗3次后用0.05 %戊二醛固定10 min，去离子水洗3次后加入0.4 %茜素红S，染色5~10 min，弃染液，去离子水终止反应并洗涤，显微镜下观察、成像。

1.2.5 RT-PCR

培养MEFs 3天后收集细胞，用Trizol试剂提取细胞总RNA，通过琼脂电泳验证mRNA的质量并进行定量，取1 μg RNA逆转录为cDNA，稀释5倍。PCR: 10 μl体系，反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，20~30个循环；72 ℃ 10 min。2 %琼脂糖凝胶跑电泳，凝胶成像，引物见表 1。

1.2.6 结晶紫染色

细胞培养待汇合至30 %左右时，加入处理因素，分组同前，培养36 h后行结晶紫染色，弃去培养基，PBS洗2~3遍，加入4 %多聚甲醛 (500μl/孔)，固定15 min，加入0.05 %结晶紫溶液 (400μl/孔)，染色15 min后观察染色情况，弃去染色液终止反应，加入去离子水洗3遍，显微镜下观察、成像。

1.2.7 免疫细胞化学

将MEFs细胞接种至24孔板，细胞融合至30 %左右时，加入AdRFP，AdDLL1，6 h换液后加入DAPT，处理3天后，加入适当量的BMP4的条件培养基处理1 h后进行免疫细胞化学染色，操作方法按照试剂盒说明书。

1.2.8 流式细胞术检测细胞周期

弃去培养基，胰酶消化，用预冷的PBS洗涤细胞3次，离心去上清，70 %预冷的乙醇重悬细胞，4 ℃过夜，上机检测。

1.3 统计学分析

采用SPSS17.0进行统计分析，实验独立重复3次，数据以平均值和标准差 (±S) 表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验，检验水准P=0.05。

2 结果 2.1 DAPT阻断Notch信号抑制BMP4诱导的MSCs早期成骨分化呈剂量依赖

BMP4-CM处理MEFs细胞后，再加入浓度1、5和10μmol/L抑制剂DAPT处理细胞7天后，DAPT能够呈浓度依赖性地抑制BMP4诱导的MEFs细胞的ALP活性 (图 1)。

2.2 Notch信号对BMP4诱导的MSCs早期成骨分化的影响

用10μmol/L的抑制剂DAPT处理MEFs细胞或用AdDLL1，AddnNotch1或AdRFP感染MEFs细胞，感染效率大约30 %，待红色荧光表达后加入BMP4-CM，诱导成骨分化5天和7天后检测ALP活性和染色的变化，结果显示，DAPT和dnNotch1抑制BMP4诱导的早期成骨分化指标ALP的活性和染色 (P＜0.05)(图 2)，而DLL1能促进BMP4诱导的ALP的活性和染色 (P＜0.05)(图 2)。

2.3 Notch信号对BMP4诱导MSCs的成骨相关基因的影响

用抑制剂DAPT或AdDLL1处理BMP4诱导的MEFs细胞3天后，RT-PCR检测成骨相关基因ALP, Col1a1，Runx2的表达，结果显示，DAPT抑制BMP4诱导的成骨相关基因的表达，而DLL1促进BMP4诱导的成骨相关基因的表达 (P＜0.05)(图 3)。

2.4 Notch信号对BMP4诱导MSCs的晚期成骨分化的影响

DAPT或AdDLL1处理BMP4诱导的MEFs细胞14天后，茜素红S染色检测成骨晚期指标钙盐沉积，结果显示，DAPT或DLL1能分别抑制或促进BMP4诱导晚期成骨分化 (图 4)。

2.5 Notch信号对BMP4诱导成骨分化过程中的经典信号通路的影响

免疫细胞化学检测细胞处理3天p-Smad1/5/8的蛋白表达 (图 5)。与对照组相比，BMP4和BMP4+DLL1组细胞核内的蛋白表达明显增高，而BMP4+DLL1组的蛋白表达要明显高于BMP4单独处理组。BMP4+DAPT组细胞核内的蛋白表达明显低于BMP4+DMSO组。

2.6 Notch信号对BMP4诱导成骨分化中细胞增殖的影响

DAPT或AdDLL1处理BMP4诱导的MEFs细胞，分别于36h后结晶紫检测细胞增殖和3天后流式细胞术检测细胞的增殖情况。结晶紫染色结果 (图 6a) 显示DLL1具有一定的促MEFs增殖的作用而DAPT具有一定的抑制作用；同样，FCM检测细胞周期 (图 6b)，发现BMP4+RFP, BMP4+DLL1, BMP4+DMSO, BMP4+DAPT的增殖指数G2+S期分别是30.03%，40.47% 29.80%，20.61%。结果显示，DLL1早期具有一定的促BMP4诱导的MEFs细胞增殖的作用而DAPT具有一定的抑制作用。

3 讨论

间充质干细胞是一类多能干细胞，在体内外相应的诱导环境下可以分化为骨，软骨，脂肪，肌肉等组织。因此在再生医学研究中具有重要的作用和地位。研究显示MSCs在成骨BMPs的作用下，可以向成骨细胞分化。其中BMP2和7已经应用于临床，然而由于成骨BMPs诱导MSCs成骨的机制尚不清楚，临床应用效果亦并不如预期，因此进一步明确成骨BMPs诱导MSCs成骨分化的机制，对于改善BMPs在临床中的应用具有重要的意义。MEFs是胚胎成纤维干细胞，由于其具有干细胞的特征，是研究MSCs的重要细胞^{[2, 6]}。本研究用于MSCs成骨分化的研究。

Notch信号是胚胎发育过程中高度保守的信号通路，Notch信号通过调节胚胎干细胞的分化，增殖与凋亡过程，调控哺乳动物的体节发生^[8]。在哺乳动物中，Notch的配体有Jagged1, 2和DLL1，3，4，受体有Notch1-4。Notch与相邻细胞上的配体结合，在γ-内分泌酶 (γ-secretase) 的作用下剪切Notch的胞内段 (Notch intracellular domain，NICD)，NICD进入细胞核与CSL结合进而调控下游靶基因Hey1，Hes1的表达^[16-17]。研究报道Notch信号在骨重建过程中发挥重要作用。我们的研究及一些国外学者的研究都显示Notch单独没有诱导MSCs成骨分化；然而我们发现Notch能够明显促进BMP 9诱导的MSCs成骨，是BMP9诱导MSCs成骨分化中重要的影响因素^[11]。这一现象也在BMP2诱导的MSCs成骨分化中发现^[10]，是否Notch信号在所有的成骨BMPs诱导分化中都具有不可取代的作用呢？Notch信号对其他成骨BMPs，包括BMP4诱导成骨分化的影响目前还不清楚。

BMP4是TGFβ超家族的一员，能诱导间充质干细胞成骨分化，也是成骨BMPs中的一员^[18]。在成骨分化过程中，BMP4在原始间质细胞和前成骨细胞中高表达，而在成熟的成骨细胞中不表达。BMP4可以诱导原始间质细胞分化为脂肪，软骨，骨细胞^[19]。有研究显示，BMP4依赖于Notch信号表达靶基因Hes1，Hey1，而另一方面，SMADs可以增强NICD介导的转录活性进而促进Notch的靶基因的表达^[20]。也有文献报道，BMP4诱导的抑制成肌分化过程中Notch信号发挥着重要作用^[21]。这些研究都提示BMP4和Notch之间有密切的关系，那么在BMP4诱导的MSCs成骨分化中，Notch是通过什么样的机制发挥怎样的作用呢？

我们的研究结果显示 (1) DAPT抑制BMP4诱导的早期成骨分化，且呈浓度依赖性；(2) DLL1促进BMP4诱导的成骨分化，DAPT和dnNotch1抑制BMP4诱导的成骨分化；(3) DLL1促进BMP4诱导的成骨相关基因ALP, Runx2，Col1a1的表达，DAPT抑制这些基因的表达；(4) DLL1促进BMP4诱导的细胞核内p-Smad1/5/8的表达，而DAPT抑制其表达；(5) DLL1促进BMP4诱导的细胞增殖，而DAPT抑制BMP4诱导的细胞增殖。研究提示Notch信号通过BMP/Smads信号通路促进BMP4诱导的MSCs成骨分化，在此过程中也有促细胞增殖的作用。其与Notch信号在BMP9和2诱导成骨分化的结果相似，提示Notch信号在促进成骨BMPs诱导成骨中可能存在相同的作用和机制。

本研究作为Notch在成骨BMPs诱导成骨中的作用及机制研究的一部分，但仍需进一步完善Notch在BMP6, 7中的作用研究，才能最终证实Notch在成骨BMPs诱导成骨中的作用广泛性。从而为临床上采用BMPs进行骨组织工程的方法和策略，提供理论和实验依据。