间充质干细胞是一种具有多向分化能力的干细胞，它可以向成骨，成脂，成软骨，成肌等各向分化^[1-3]，并且因其具有来源广泛、易分离、易培养、免疫原性低的特点，是组织工程中最受青睐的种子细胞。骨形态发生蛋白 (bone morphogenetic proteins, BMPs) 是转化生长因子 (transforming growth factor, TGF-β) 超家族中的一员，它是一种外分泌蛋白，在胚胎的发育，神经系统完善以及出生后骨形成过程中起着重要作用^[4-5]。BMP2，BMP4，BMP6，BMP7均具有促进间充质干细胞向成骨分化的作用，其中，人重组BMP2、BMP7蛋白已经应用于临床治疗^[6-7]。课题组前期研究发现，在这些具有促成骨作用的BMP中，BMP9作用最强^[8]。BMP9有望成为临床上更有效的促成骨治疗因子，因此需要深入研究BMP9的促成骨机制从而为BMP9应用于临床提供可靠的支持。

血红素加氧酶 (hemeoxygenase，HO) 系统是一个微粒体酶系统，在人和哺乳动物体内广泛存在，参与整个生长发育过程和多种生理病理过程，是血红素降解起始酶和限速酶。HO有两种类型：诱导型 (HO-1)，组成型 (HO-2)。HO作用于血红素得到产物CO、Fe和胆绿素。胆绿素在体内立即被胆绿素还原酶还原成胆红素, 而铁离子诱导铁蛋白的合成^[9]。HO-1可以在多种刺激因素下 (亚铁血红素，组织内氧过多，内毒素) 反应增高，具有抗凋亡，抗氧化应激作用^[10]。在骨折愈合过程中，低氧诱导因子 (hypoxia-inducible factor, HIF-1) 和血管内皮细胞生长因子 (VEGF)、HO-1参与调控破骨细胞生成和骨再吸收；HO-1也能促进成骨细胞分化^[11-12]，但HO-1在BMP9诱导成骨分化的过程中的作用尚不清楚。因此，本研究主要探讨在BMP9诱导下，HO-1在间充质干细胞分化过程中发挥的作用。

1 材料与方法 1.1 材料

Hmox1基因模板，腺病毒穿梭质粒PAdTrace-TO4(卡那抗性)，大肠埃希菌DH10B，BJ5183感受态 (含有缺失E1和E3区的野生型腺病毒骨架质粒pAdEasy1的BJ5183感受态)，腺病毒Ad-BMP9、Ad-GFP和Ad-RFP，人胚肾HEK293细胞，小鼠胚胎成纤维细胞C3H10T1/2(本实验室保存)。

1.2 试剂

高保真酶PrimerSTAR购于TaKaRa公司，胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒购于Omega公司，限制性内切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ、Pme Ⅰ、Pac Ⅰ购于New England Biolab公司，DNA连接酶和脂质体转染试剂盒Lipofectamine 2 000购于Invitrogen公司，高糖型DMEM培养基购于HyClone公司，胎牛血清购于Gibico公司，一抗β-Actin购于天津三箭生物技术有限公司，一抗Hmox1购于ABcam公司，二抗辣根过氧化物酶标记的羊抗兔/鼠IgG购于北京中衫金桥公司，Trizol、普通PCR、SYBR试剂与逆转录PCR试剂盒均购于TaKaRa公司，Hmox1激动剂COPP、ALP染色试剂盒、茜素红、维生素C、β-磷酸甘油购自Sigma公司。

1.3 引物设计

引物设计见表 1。

1.4 质粒构建和细胞实验

1.4.1 穿梭质粒pAdTrace-TO4-Hmox1构建

首先PCR扩增出目的片段 (PCR反应体系50μl：PrimerSTAR buffer 10μl、PrimerSTAR 0.5μl、2.5mol/L dNTP 4μl、目的片段上下游引物各1μl、Hmox1质粒模板1μl、ddH₂O 32.5μl；反应条件：95℃预变性3min，92℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，循环30次，72℃延伸5min)，用BamH Ⅰ、Hind Ⅲ分别双酶切纯化回收的目的片段和穿梭质粒pAdTrace-TO4，T4连接酶连接后铺板 (含卡那霉素100mg/L)，12h后PCR筛选阳性克隆菌 (反应体系10μl：筛选引物各1μl、10×PCR buffer 1μl、2.5mol/L dNTP 3μl、rTaq 0.2μl、DMSO 0.6μl、ddH₂O 3.2μl)，阳性克隆菌扩增后提取的质粒送公司测序进行鉴定。

1.4.2 重组质粒构建和腺病毒包装

Pme Ⅰ酶切pAdTrace-TO4-Hmox1使其线性化，纯化后电转入含Adeasy-1骨架质粒的BJ5183感受态中进行重组，取适量涂布于LB琼脂平板 (卡那霉素100mg/L)，Pac Ⅰ酶切鉴定正确的重组质粒再次转化DH10B感受态扩增，最后Pac Ⅰ酶切重组质粒，经Lipofectamine 2 000介导转染人胚肾HEK 293细胞进行包装，一周左右大部分细胞变圆，30%细胞脱落，收集细胞反复冻融3次得到腺病毒，重复扩增直到病毒滴度增高。

1.4.3 细胞培养

C3H10T1/2、HEK 293细胞株在37℃，5% CO₂的环境下，用含10%胎牛血清与100U/ml青霉素和100μg/ml的链霉素的DMEM高糖培养基进行培养。

1.4.4 条件培养基的制备

接种结肠癌细胞HCT116于100mm×20mm培养皿中，待细胞融合率达到60%~70%，Ad-BMP9感染结肠癌细胞HCT116(控制24h病毒感染率50%左右)，4~6h后换无血清无抗生素DMEM培养基继续培养，分别于24h、48h离心收集上清备用，上清中含较高浓度BMP9蛋白。

1.4.5 Q-PCR

C3H10 T1/2做处理后，于72h提取细胞RNA，逆转录为cDNA后Q-PCR (SYBR酶) 检测相关目的基因表达。

1.4.6 Western blot

C3H10T1/2做处理后，于72h用蛋白裂解液裂解细胞提取细胞总蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳分离，PVDF膜上进行湿转，37℃用BSA封闭2h，一抗 (Hmox1抗体1:1 000，β-actin抗体1:1 000) 在4℃封闭过夜，洗膜3次，辣根过氧化物酶标记二抗 (1:5 000)37℃孵育1h，再次洗膜3次，按照ECL试剂盒配置显色液发光成像。

1.4.7 碱性磷酸酶染色及活性测定

将C3H10T1/2细胞以30%融合度铺在24孔板里，病毒或药物处理24h后加入BMP9条件培养基，于第5天按照说明书进行碱性磷酸酶染色及活性测定。

1.4.8 钙盐沉积实验

将C3H10 T1/2细胞以30%融合度铺在24孔板里，病毒处理24h后加入成骨诱导培养基 (含DMEM，10%胎牛血清，1%青/链霉素，10mmol/L β磷酸甘油及50mg/ml维生素C) 和BMP9条件培养基，在第14天进行茜素红染色：弃去培养基，PBS洗2次，0.05%戊二醛固定10min，去离子水洗2次，0.04%茜素红200μl每孔染色至出现红色物质，弃去染液并用去离子水洗涤3次。扫描并于显微镜下照相留存。

1.5 统计学分析

计量资料以均数±标准差 (x±s) 表示，组间比较采用单因素方差分析，用SPSS 17.0进行统计学处理。

2 结果 2.1 BMP9对C3H10T1/2细胞内源性Hmox1表达的影响

Ad-GFP和Ad-BMP9分别感染C3H10T1/2细胞72h后，RT-PCR和Western blot检测到Hmox1的mRNA和蛋白水平增加 (图 1a，图 1b)。

2.2 构建穿梭质粒

PCR方法扩增Hmox1基因编码序列 (870bp)，凝胶电泳检测条带位置 (图 2a)，与酶切处理的TO4质粒连接后转入DH10B感受态，菌落PCR筛选结果 (图 2b)，选1、2号送公司做测序鉴定，测序结果正确。

2.3 包装腺病毒

测序成功的穿梭质粒Pme Ⅰ线性化后转入BJ5183(含Adeasy-1骨架质粒) 同源重组，重组后的阳性质粒 (1, 2) 比Ad-easy质粒大 (图 3a)；选1、2号质粒做Pac Ⅰ酶切鉴定 (图 3b)；Pac Ⅰ酶切鉴定成功的1号质粒后经lipofectamine 2 000导入HEK 293细胞，第3天出现红色荧光 (图 3c), 第5天红色荧光越来越多 (图 3d)，说明病毒包装成功。

2.4 Hmox1腺病毒功能验证

Ad-Hmox1感染C3H10T1/2细胞，72h后提取蛋白，经Western blot检测发现Hmox1蛋白的表达增加 (图 4)。

2.5 Hmox1对BMP9诱导的C3H10T1/2早期成骨分化的影响

用Ad-Hmox1或Hmox1激动剂COPP处理BMP9诱导的C3H10T1/2细胞，在第5天检测碱性磷酸酶ALP活性及染色。结果显示，Ad-Hmox1处理组和RFP处理组相比ALP活性一样，Ad-Hmox1和BMP9共同处理组ALP染色和活性与BMP9组相比明显增高 (图 5a、5c)，BMP9和COPP共同处理组也比BMP9组的ALP染色和活性更强 (图 5b、5d)。说明用Hmox1处理对ALP活性没有影响，Hmox1可以明显促进BMP9诱导下ALP活性。

2.6 Hmox1对BMP9诱导的C3H10T1/2晚期成骨分化的影响

Ad-Hmox1处理BMP9诱导的C3H10T1/2细胞，在第14天茜素红染色检测钙盐结节。结果显示Hmox1能明显促进BMP9诱导下钙盐结节的形成 (图 6)。

2.7 Hmox1对BMP9诱导下C3H10T1/2细胞的成骨指标COL1A1的影响

Ad-Hmox1与BMP9共同处理C3H10T1/2细胞，提取3天的蛋白，Western blot检测COL1A1蛋白水平。结果显示两者联合作用可以明显增加COL1A1的蛋白表达 (图 7)。

3 讨论

课题组前期研究发现，BMP9可以直接或间接与多种转录因子相互作用，来促进间充质干细胞向成骨分化，如RUNX2^[13]。

Hmox1是一种热休克蛋白，作为重要的抗炎、抗氧化因子刺激因子在各种生理或病理情况下发挥作用^[14-15]，Hmox1表达下调促进破骨形成，引起骨量减少^{[16, 11]}。近几年研究报道Hmox1对成骨的作用，Ignazio等发现hMSCs在成骨诱导培养基作用下，Hmox1表达在第7天有降低，在第14、21天升高，COPP激动剂引起Hmox1的高表达可以明显促进MSCs的成骨分化，但是具体机制尚不清楚^[12]。成骨细胞分泌的VEGF通过上调Hmox1促进骨髓基质细胞的成骨分化^[17]。BMP9作用下间充质干细胞向成骨分化过程中，Hmox1扮演的角色是未知的，因此在本课题中，首先探讨BMP9作用下间充质干细胞向成骨分化过程Hmox1内源性表达变化，检测到Hmox1的mRNA和蛋白水平都明显增加，说明Hmox1的表达在BMP9诱导下间充质干细胞的成骨分化过程有作用。

但BMP9诱导间充质干细胞中Hmox1的表达变化在成骨分化过程起着怎样的作用以及具体机制尚不清楚，因此，本课题采用Ad-easy系统构建了表达红色荧光的过表达Hmox1的重组腺病毒，用Ad-Hmox1处理C3H10 T1/2细胞检测成骨早期指标ALP和晚期指标钙盐沉积的变化。结果表明，过表达Hmox1可以促进BMP9诱导下C3H10 T1/2细胞的成骨分化。

本研究利用腺病毒Ad-easy系统将携有红色荧光标签的穿梭质粒和含腺病毒E1、E3缺失区域的骨架质粒pAd-easy1同源重组，在293细胞中进行包装，成功构建出过表达Hmox1的腺病毒，并证实Hmox1可增强BMP9诱导下间充质干细胞的成骨分化。下一步将深入研究Hmox1对BMP9诱导下间充质干细胞成骨分化涉及的信号通路 (如Smad信号以及WNT，MAPK信号) 的影响，此外，后期还应从体内实验水平验证Hmox1对BMP9诱导C3H10T1/2细胞成骨分化的促进作用。临床上疾病或外伤导致的大面积骨不连，骨缺损都伴随着局部炎症反应，而Hmox1作为重要的抗炎、抗氧化因子在BMP9刺激下表达增高并且高表达Hmox1可以促进BMP9诱导下间充质干细胞的成骨分化，为BMP9应用于临床治疗提供了理论支持。