中国生物工程杂志  2017, Vol. 37 Issue (4): 26-32

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冯雪军, 龙琼, 唐增华, 黄惟巍, 刘存宝, 杨旭, 孙文佳, 白红妹, 马雁冰.
FENG Xue-jun, LONG Qiong, TANG Zeng-hua, HUANG Wei-wei, LIU Cun-bao, YANG Xu, SUN Wen-jia, BAI Hong-mei, MA Yan-bing.
重组小鼠白细胞介素-33的原核表达制备及其粘膜免疫佐剂活性
The Prokaryotic Expression of Recombinant Murine Interlukin (IL)-33 and Its Mucosal Immunization Affect as Adjuvant
中国生物工程杂志, 2017, 37(4): 26-32
China Biotechnology, 2017, 37(4): 26-32
http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20170404

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收稿日期: 2016-11-01
修回日期: 2016-11-16
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冯雪军, 龙琼, 唐增华, 黄惟巍, 刘存宝, 杨旭, 孙文佳, 白红妹, 马雁冰. 重组小鼠白细胞介素-33的原核表达制备及其粘膜免疫佐剂活性[J]. 中国生物工程杂志, 2017, 37(4): 26-32.
FENG Xue-jun, LONG Qiong, TANG Zeng-hua, HUANG Wei-wei, LIU Cun-bao, YANG Xu, SUN Wen-jia, BAI Hong-mei, MA Yan-bing. The Prokaryotic Expression of Recombinant Murine Interlukin (IL)-33 and Its Mucosal Immunization Affect as Adjuvant[J]. China Biotechnology, 2017, 37(4): 26-32.
重组小鼠白细胞介素-33的原核表达制备及其粘膜免疫佐剂活性
冯雪军1,2,3, 龙琼1,2,3, 唐增华1,2,3, 黄惟巍1,2,3, 刘存宝1,2,3, 杨旭1,2,3, 孙文佳1,2,3, 白红妹1,2,3, 马雁冰1,2,3     
1. 中国医学科学院、北京协和医学院 医学生物学研究所 昆明 650118；
2. 云南省重大传染病疫苗研发重点实验室 昆明 650118；
3. 云南省重大传染病疫苗工程技术研究中心 昆明 650118
收稿日期: 2016-11-01; 修回日期: 2016-11-16
基金项目: 云南省对外合作科技项目（2013IA005）、云南省应用基础研究重点项目（2011FA023，2016FA023）资助项目
通讯作者: 马雁冰，电子信箱：may@imbcams.com.cn
摘要: 目的 白细胞介素（IL）-33对树突状细胞、巨噬细胞及T细胞等免疫细胞具有重要调控作用。利用大肠杆菌制备重组小鼠的IL-33，并初步考察其作为粘膜免疫佐剂应用的潜能与特点。 方法 以IPTG诱导硫氧还蛋白（Trx）/IL-33融合蛋白在大肠杆菌DH5α中的表达，并通过Q-Sepharose离子交换和Ni++金属螯合亲和层析纯化Trx/IL-33，进一步经肠激酶切割获得成熟形式的IL-33。重组HBcAg混合纯化的IL-33后经滴鼻免疫小鼠，考察HBcAg特异的IgA及IgG1、IgG2a的应答。 结果 纯化的重组IL-33具有与标准品相当的促巨噬细胞RAW264.7表达TNF-α的体外细胞生物学活性。作为佐剂可显著增强滴鼻粘膜免疫激发的不同粘膜组织中HBcAg特异的IgA应答，以及血清与支气管肺泡灌洗液中特异IgG1的应答水平，而抑制IgG2a应答。 结论 利用大肠杆菌可制备活性IL-33，其具有粘膜免疫佐剂的应用潜能。
关键词: 重组     白细胞介素-33     表达     粘膜免疫     佐剂    
The Prokaryotic Expression of Recombinant Murine Interlukin (IL)-33 and Its Mucosal Immunization Affect as Adjuvant
FENG Xue-jun1,2,3, LONG Qiong1,2,3, TANG Zeng-hua1,2,3, HUANG Wei-wei1,2,3, LIU Cun-bao1,2,3, YANG Xu1,2,3, SUN Wen-jia1,2,3, BAI Hong-mei1,2,3, MA Yan-bing1,2,3     
1. Institute of Medical Biology, Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College, Kunming 650118, China;
2. Yunnan Key Laboratory of Vaccine Research & Developent on Severe Infection Disease, Kunming 650118, China;
3. Yunnan Engineering Research of Vaccine Research and Development on Severe Infection Disease, Kunming 650118, China
Abstract: Objective Interleukin (IL)-33 has important immunoregulatory effects on immune cells, such as dentritic cells, macropphage and T cells. The purpose is to prepare recombinant murine IL-33 in E.coli cells, and investigate the potentials and characteristics of IL-33 to be employed as an adjuvant in mucosal immunization. Methods The expression of fusion protein thioredoxin/IL-33 was induced by IPTG in DH5α cells, and the purification was performed through a chromatography procedure consists of Q-Sepharose ionic exchange and Ni++ chelating affinity. And then, mature IL-33 was released from the fusion protein by enterokinase treatment. The recombinant HBcAg was combined with IL-33 or not, and used to immunize mice intranasally. HBcAg-specific IgA, IgG1 and IgG2a were detected with ELISAs. Results Purified IL-33 displayed the similar bioactivity of stimulating RAW264.7 to express TNF-α as commercially derived recombinant IL-33. Purified IL-33 which served as an adjuvant significantly enhanced the HBcAg-specific IgA response in multiple mucosal tissues, as well as IgG1 levels in serum and bronchial alveolar lavage fluid, whereas reduced IgG2a levels. Conclusion Active IL-33 is successfully prepared from E.coli cells, and has a potential to be used as a molecular adjuvant in mucosal immunization.
Key words: Recombinant     Interlukin (IL)-33     Expression     Mucosal immunization     Adjuvant    

白细胞介素 (IL)-33是由Schmitz等[1]在2005年发现的一个IL-1家族的新成员，主要由树突状细胞 (DCs)，巨噬细胞，上皮细胞，成纤维细胞和平滑肌细胞表达[2]，在细胞坏死或损伤时释放，可起到“警报素”作用，促发一系列下游免疫反应。细胞释放的IL-33与Ⅱ型固有淋巴细胞ST2受体结合，激活MyD88和IRAK-1/4，导致NF-κB和MAPK途径的活化，产生Ⅱ型免疫反应细胞因子和趋化因子。此外，IL-33具有很强的刺激Th2的分化与激活的功能，同时也是特异的Th2细胞趋化物[3]。

研究还发现，IL-33能够影响DCs的成熟和活化[4]，包括诱导骨髓单核-巨噬细胞协同刺激因子的表达并促进CD11c+DCs的产生，以及促进DCs主要组织相容性复合物Ⅱ和CD86及IL-6等的表达[5]。IL-33作用于DCs、巨噬细胞、NK、CD8+CTLs等免疫细胞[6]，在抗病毒感染特异细胞免疫应答中具有重要作用[7-8]。有文献报道，以IL-33作为佐剂在HPV相关的肿瘤模型中，可以增强肿瘤抗原特异治疗性疫苗的抗肿瘤Th1/CTLs免疫应答，并且显著抑制肿瘤的生长[9-11]。

概言之，IL-33作用于DCs、NK、NKT、CTLs、Th2、嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞等免疫细胞，在固有免疫和适应性免疫中发挥着重要调节作用[3, 5, 10]，具有作为分子免疫佐剂的应用潜能。本研究旨在探讨小鼠来源的重组IL-33在大肠杆菌中的制备技术，并考察其对粘膜免疫所激发的特异抗体应答水平及类型的影响。

1 材料与方法 1.1 实验动物

6~8周龄Balb/c雌性小鼠，体重16~18g, 购自北京维通利华实验技术有限公司[编号：SCXK (京)2012-0001]，饲养于清洁级动物房。

1.2 质粒及细胞系

表达硫氧还蛋白 (thioredoxin, Trx)/IL-33融合蛋白的重组质粒pThioHisA/IL-33, 由本实验室构建并保存 (pThioHisA质粒购自Invitrogen公司)。大肠杆菌 (E.coli) DH5α感受态购自北京全式金生物技术有限公司。小鼠巨噬细胞系 (Raw264.7) 由昆明医科大学第二附属医院陈斌老师惠赠。

1.3 试剂

生物素化的羊抗鼠IgA、TNF-α、IgG1与IgG2a，抗体，购自eBioscience公司。亲和素偶联碱性磷酸酶，碱性磷酸酶底物购自Sigma-Aldrich公司。Q-Sepharose FF-、Ni++-Sepharose FF、Sephadex G25填料购自美国GE公司。DMEM细胞培养液购自HyClone公司。IL-33标准品购自Peprotech公司，肠激酶购自Sigma-Aldrich公司。

1.4 Trx/IL-33融合蛋白的诱导表达

将重组表达质粒pThioHisA/IL-33转化感受态DH5α，挑取单菌落并接种至LB液体培养基中，37℃，220r/min, 培养过夜，然后按照2%~5%的比例将菌液转接至新的LB液体培养基中，37℃, 280r/min摇床培养，至菌液OD600值为0.4~0.6时，加入IPTG至浓度为1mmol/L，诱导4~6h。离心收集菌体，离心条件为8 000 r/min，4℃，10min。所表达的目的蛋白经12%的SDS-PAGE电泳分析。

1.5 Trx/IL-33融合蛋白的纯化

离心收集的菌体用20mmol/L Tris-HCl (pH8.0) 重悬，超声波破碎。离心收集破碎上清，条件为4℃，12 000r/min，20min。将收集的上清经0.45μm的滤膜过滤后以Q-Sepharose FF阴离子交换进行纯化。经10个柱床体积达1mol/L NaCl (20mmol/L Tris-HCl, pH=8.0)，流速为1ml/min。利用自动部分收集仪收集样品并进行SDS-PAGE电泳分析。目的峰进一步经Ni++金属螯合亲和层析纯化，A液为含5mmol/L咪唑、0.3mol/L NaCl的20mmol/LTris-HCl (pH8.0)，B液为含500mmol/L咪唑、0.3mol/L NaCl的20mmol/LTris-HCl (pH8.0)。流速为1ml/min，0%~50% B液梯度洗脱，10个柱床体积，利用自动部分收集仪收集样品并经SDS-PAGE电泳分析。纯化的融合蛋白经Sephadex G25脱盐后，加入肠激酶，20℃水浴孵育12h以释放成熟形式的IL-33，进一步以Ni++金属螯合柱吸附切割出的硫氧化蛋白，流过液主要为纯化的成熟IL-33蛋白，经脱盐处理后冻存备用。

1.6 IL-33的生物活性检测

用系列稀释的商业化的小鼠重组IL-33和纯化获得的Trx/IL-33融合蛋白及成熟形式的IL-33，分别刺激培养的RAW264.7巨噬细胞 (浓度为1 ×105/ml，培养12 h后，收集上清，以ELISA检测上清中TNF-α的表达水平，并计算出三种形式的IL-33的半最大效应 (EC50) 值。ELISA采用夹心法按Ebioscience公司产品说明进行。简单过程如下，以抗小鼠TNF-α单克隆抗体包被酶标板，5% BSA封闭2h，加入样品孵育2h，加入生物素化的抗小鼠TNF-α单克隆抗体孵育2h，加入碱性磷酸酶标记的亲和素孵育1h，最后以碱性磷酸酶底物显色，酶标仪读取OD405值。

1.7 小鼠免疫

HBcAg病毒样颗粒的制备参考本室发表的研究论文所描述方法[11]。通过小动物麻醉机以异氟烷麻醉小鼠，将40 μl抗原溶液滴到小鼠两个鼻腔内，分HBcAg和HBcAg+IL-33两组，HBcAg剂量为50μg，成熟形式的IL-33浓度为1 μg，每两周免疫1次，共3次。末次免疫后隔周进行小鼠腿部隐静脉采血，用于检测HBcAg特异性抗体应答。

1.8 ELISA检测抗体水平

以实验室制备的HBcAg包被酶标板，50μl/孔，于湿盒中4℃过夜，用PBST (含5%的Tween20的PBS，pH7.2) 洗涤3次，加入含5% BSA的PBST室温封闭2h，PBST洗涤3次，加入小鼠血清或组织灌洗液，室温下孵育1h，PBST洗3次，再加入生物素标记的抗小鼠IgA、IgG1与IgG2a(1:10 000稀释)，最后，加入亲和素-碱性磷酸酶 (1:10 000稀释)，洗涤后加入碱性磷酸酶底物溶液，30 min后，在酶标仪上测OD405值。

2 结果 2.1 重组Trx/IL-33融合蛋白的表达

转化了质粒pThioHisA/IL-33的重组菌在IPTG诱导4h后，经SDS-PAGE分析显示，较之诱导前，诱导后在32kDa处有明显的表达条带，与预期的融合蛋白理论分子量32.38kDa相符 (图 1)。

图 1 重组Trx/IL-33融合蛋白的诱导表达 Figure 1 The expression of recombinant Trx/IL-33 fusion protein M: Molecular markers; 1:Pre-induction with IPTG; 2:Post induction
图选项
2.2 重组Trx/IL-33融合蛋白的纯化

超声破碎上清经Q-sepharose FF阴离子交换层析可以得到初步纯化的目的蛋白 (图 2)，纯度达到75%以上。根据电泳结果，将纯度相近的自动部分收集器收集的融合蛋白样品合并，进一步经过Ni++-Sepharose FF亲和层析纯化，纯度可以达到90%以上 (图 3)。

图 2 重组Trx/IL-33融合蛋白经Q-sepharose FF离子交换纯化 Figure 2 Purification of recombinant Trx/IL-33 fusion protein with Q-Sepharose FF ionic exchange chromatography M: Molecular makers; 1~9: Eluted protein samples
图选项
图 3 重组Trx/IL-33融合蛋白经Ni++-Sepharose FF亲和层析纯化 Figure 3 Purification of recombinant Trx/IL-33 fusion protein with Ni++-Sepharose FF affinity chromatography M: Molecular markers; 1~11: Eluted protein samples
图选项
2.3 非融合成熟形式IL-33的纯化

将纯化的Trx/IL-33融合蛋白用肠激酶处理，预计切割为硫氧化蛋白与成熟形式的IL-33，经Ni++-Sepharose FF亲和层析纯化后，硫氧还蛋白等被吸附到柱子上，而非融合的IL-33成熟蛋白直接穿过柱子。经SDS-PAGE分析，得到了纯的IL-33成熟蛋白，目的蛋白的表观分子量与预期的17.38kDa相符 (图 4)。

图 4 经肠激酶切割处理融合蛋白Trx/IL-33及Ni++-Sepharose FF亲和层析获得成熟形式的IL-33 Figure 4 Purification of mature IL-33 from Trx/IL-33 fusion protein after enterokinase treatment and Ni++-Sepharose FF chromatography M: Molecular markers; 1~3:Trx/IL-33 fusion protein after enterokinase treatment; 4~5:The flow-through samples from Ni++-Sepharose FF chromatography of enterokinase-treated fusion protein; 6~7:The thioredoxin and impure protein absorbed in the Ni++-Sepharose FF chromatography
图选项
2.4 IL-33的生物学活性检测

将商业化途径获得的重组IL-33及纯化制备的Trx/IL-33与成熟形式IL-33从50ng/μl开始倍比稀释，刺激培养的Raw264.7巨噬细胞，通过ELISA检测培养上清中TNF-α水平。以IL-33标准品刺激结果绘图作为代表显示IL-33刺激Raw264.7产生TNF-α的剂量效应 (图 5)。结果显示，IL-33标准品、Trx/IL-33融合蛋白、成熟形式IL-33的EC50值分别为3.037 ng/ml、12.97 ng/ml、1.186 ng/ml，表明纯化的IL-33成熟蛋白具有与商业化重组IL-33相当的细胞生物学活性。

图 5 ELISA检测IL-33刺激Raw264.7细胞产生TNF-α的剂量效应 Figure 5 Dose dependent production of TNF-α by Raw264.7 cells stimulated with recombinant IL-33
图选项
2.5 小鼠不同粘膜组织样品中HBcAg特异的IgA水平

采集经滴鼻免疫小鼠的支气管肺泡灌洗液 (BALF)，血清，阴道灌洗液，肠灌洗液样品，以ELISA检测HBcAg特异的IgA水平。结果显示 (图 6)，HBcAg作为模式抗原经鼻免疫小鼠后，在不同粘膜组织及血清中都诱导产生了特异的IgA抗体应答。以IL-33作为佐剂，可以增强HBcAg特异的IgA的水平，经Student t检验分析表明在BALF中IL-33显著增加了HBcAg特异的IgA水平，具统计学意义 (P＜0.05, n = 4 /组)。

图 6 经滴鼻免疫的小鼠不同粘膜组织中HBcAg特异的IgA应答 Figure 6 HBcAg-specific IgA responses to intranasal immunization in multiple mucosal tissues and serum
图选项
2.6 血清中HBcAg特异的IgG1和IgG2a水平

ELISA检测血清中HBcAg特异的IgG1和IgG2a的结果显示 (图 7)，经滴鼻进行HBcAg粘膜免疫，可诱导系统的特异性IgG1和IgG2a抗体应答。以IL-33作为佐剂，显著促进IgG1的水平增高 (Student t检验，P＜0.01, n = 4 /组)，而对IgG2a有轻微下调，导致IgG1/IgG2a比值显著增高 (Student t检验，P＜0.01, n=4/组)，提示IL-33作为佐剂经鼻粘膜免疫可调控Th1/Th2平衡，促进Th2样免疫应答。

图 7 血清中HBcAg特异的IgG1、IgG2a应答 Figure 7 HBcAg-specific IgG1 and IgG2a responses in serum
图选项
2.7 BALF中HBcAg特异的IgG1和IgG2a水平

进一步分析粘膜组织中HBcAg特异的IgG1和IgG2a水平，结果显示 (图 8)，以IL-33作为佐剂，可显著促进BALF中IgG1水平，而同时显著下调IgG2a(Student t检验，P＜0.01, n = 4 /组)，提示IL-33作为佐剂经鼻粘膜免疫调控了Th1/Th2平衡，可促进Th2而抑制Th1样免疫应答。

图 8 BALF中HBcAg特异的IgG1、IgG2a应答 Figure 8 HBcAg-specific IgG1 and IgG2a responses in BALF
图选项
3 讨论

IL-33具有显著的免疫调控作用，尤其作为“警报素”在组织损伤和病原侵入早期即产生应答，进而诱发机体免疫应答。IL-33对DCs、巨噬细胞、T细胞等重要免疫细胞的显著作用，提示其具有分子免疫佐剂的应用潜能。近来有文献报道IL-33在肿瘤疫苗研究中可显著提升肿瘤抗原特异的细胞免疫应答，展示了其促Th1/CTLs应答的潜能[12-13]。然而，很多研究也显示IL-33作用于II型固有淋巴细胞、Th2细胞、以及2型巨噬细胞等，在2型免疫的促发、维持、发展中发挥着极为关键的作用。因此，IL-33是促进Th1/CTLs应答还是Th2应答，可能取决于具体的组织与病理生理条件。因此，本研究旨在更多了解IL-33的免疫佐剂活性与特点。

粘膜是病原体侵入机体的重要途径，同时诱导粘膜及系统的全面免疫应答，应该能够提供较之单独诱导系统免疫更为有效的保护。因此，粘膜免疫及其诱导的研究具有重要意义。然而，目前尚缺乏安全有效的粘膜免疫佐剂，限制了经粘膜免疫接种诱导全面免疫应答的这一策略的有效应用。考虑到IL-33在呼吸道上皮中的组成型表达，及其关键的“警报素”效应，我们推测IL-33具有作为粘膜免疫佐剂的潜能。

首先，我们利用基因重组的方式，通过融合蛋白表达策略促进IL-33表达水平及有效折叠，经离子交换与金属螯合亲和层析两种不同分离纯化机理的层析，组合作用下使融合蛋白获得有效纯化。进一步，通过肠激酶处理，使硫氧还蛋白与IL-33成熟蛋白分离，再经过金属螯合亲和层析获得IL-33。理论上，金属螯合亲和层析获得的融合蛋白样品经肠激酶处理后，只有释放的IL-33不被亲和层析柱子吸附，因而可得到有效纯化。通过这样的技术流程，我们制备了大量高活性的重组IL-33蛋白，为进一步的小鼠免疫研究提供了基础。

Ag可在大肠杆菌中高效表达，并有效装配为病毒样颗粒。本课题组利用HBcAg作为载体，有效呈递了多个抗原表位，诱导了特异的体液与细胞免疫应答，在疾病模型中进行了有效的干预[11]。因此，在本研究中我们采用HBcAg作为模式抗原，考察IL-33潜在的免疫佐剂作用与特点。经滴鼻免疫，研究发现IL-33显著增强了特异IgA的应答。同时，IL-33显著提升了IgG1的水平，而抑制了IgG2a, 提示IL-33调控了Th1/Th2的平衡，其促Th2应答作用与研究报道的IL-33是重要的Th2应答推动者相符。此外，本实验室先前的研究显示，在哮喘模型中，以呈现IL-33分子的HBcAg免疫小鼠诱导特异的IL-33中和抗体，拮抗过敏原诱导的IL-33过度积累，可抑制Th2型过敏性炎症应答，增强了Th1与IgG2a应答，这与本研究IL-33促2型应答的结果一致。

总之，本研究实现了高活性IL-33的有效制备，并显示IL-33增强粘膜免疫抗体应答，具有粘膜免疫佐剂的应用前景，同时，具备调控Th1/Th2应答的特点。

致谢 感谢协和高校科研业务团队 (2012N08)、协和青年基金和中央高校基本科研业务费专项基金 (3332015047) 对本研究的资助。
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