文章信息
- 王冬冬, 张国利, 岳玉环, 吴广谋, 田园, 刘雨玲, 吉元刚, 王金鹏, 李建, 潘荣荣, 马洪圆.
- WANG Dong-dong, ZHANG Guo-li, YUE Yu-huan, WU Guang-mou, TIAN Yuan, LIU Yu-ling, JI Yuan-gang, WANG Jing-peng, LI Jian, PAN Rong-rong, MA Hong-yuan.
- 抗A型产气荚膜梭菌α毒素全人源双价单链抗体的构建、表达及其活性的初步研究
- Construction, Expression and Preliminary Study on Activity of Human Bivalent Single Chain Antibody Against the Alpha-toxin of Clostridium perfringens Type A
- 中国生物工程杂志, 2017, 37(4): 18-25
- China Biotechnology, 2017, 37(4): 18-25
- http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20170403
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文章历史
- 收稿日期: 2016-11-20
- 修回日期: 2016-11-30
产气荚膜梭菌产生的多种毒素常引起人类气性坏疽和食物中毒等各类肠道疾病,严重时可危及生命,其中A型产气荚膜梭菌产生的α毒素是最主要也是最关键的一类致病因子[1],目前仍没有有效的治疗方法。徐崇波等[2]利用细胞杂交瘤技术制备的单克隆抗体可以有效的中和CPA的溶血活性和致死性,但其为鼠源性抗体,在人体产生人抗鼠抗体反应 (HMAC),因此不能用于人。本实验室前期用全毒素CPA从噬菌体抗体库筛选获得抗该毒素的全人源单链抗体,在体外和体内均具有一定的中和毒素的活性。但由于只有一个抗原结合位点,其亲和活性相对较低,分子质量过小,易在肾脏清除,使绝大部分单链抗体在体内的稳定性降低,在没有充分发挥中和毒素作用前就已降解或被机体清除[3]。
基于单链抗体的优缺点,我们在已获得的抗A型产气荚膜梭菌α毒素 (CPA) scFv的基础上利用基因工程技术构建了全人源双价单链抗体sc (Fv)2,在原核表达系统中进行表达,并对其生物学活性进行了初步研究。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 质粒和菌株克隆宿主E.coli DH5α和表达宿主E.coli BL21(DE3) 以及E.coli HB2151/pIT2-scFv均为军事兽医研究所基因工程与生物技术应用研究室保存;克隆载体pMD-18T vector购自宝生物工程 (大连) 有限公司。
1.1.2 试验动物4~6周龄SPF级成年昆明系小鼠,18~22 g,雌雄各半,购自长春生物制品研究所有限责任公司,动物合格证号:SCXKC-(j)2011-0003。
1.1.3 试剂和仪器A型产气荚膜梭菌α毒素 (CPA) 和抗A型产气荚膜梭菌α毒素全人源scFv由本室制备;限制性内切酶NdeⅠ、BamHⅠ和Hind Ⅲ、T4 DNA连接酶均购自宝生物工程 (大连) 有限公司;质粒提取试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒购自爱思进生物技术 (杭州) 有限公司; Butyl Sepharose 4 FF、Chelating Sepharose Fast Flow、rProtein-A FF以及AKTATM prime层析纯化仪购自美国GE公司。
1.2 方法 1.2.1 引物设计与合成引物1~5由长春市库美生物有限公司合成,具体如下:引物1: CGCCATATGGCCGAGGTGCAGCTGTTGG (5′~3′,划线部分为NdeⅠ酶切位点);引物2: CGCGGATCCCCGTTTGATTTCCACC (5′~3′,划线部分为BamHⅠ酶切位点); 引物3:CGGGATCCGGAGGCGGAGGCTCAGCCGAGGTGCAG (5′~3′,划线部分为BamHⅠ酶切位点);引物4: CGGGATCCGGCGGAGGCGGATCAGGAGGCGGCGGCTCAGGAGGCGGAGGCTCA (5′~3′,划线部分为BamHⅠ酶切位点); 引物5:GCGAAGCTTTTA CCGTTTGATTTCCACCTTGGTC (5′~3′,划线部分为Hind Ⅲ酶切位点,斜体部分为终止子)。
1.2.2 重组质粒pET-28a-scFv的构建以载体pIT2-scFv为模板,引物1和引物2分别在其两端引入NdeⅠ和BamHⅠ酶切位点,经PCR扩增获得抗A型产气荚膜梭菌α毒素的单链抗体基因片段NdeⅠ-scFv-BamHⅠ, scFv先与pMD-18T Vector连接,再将质粒pMD-18T-scFv用NdeⅠ酶和BamHⅠ酶进行双酶切,与用相同酶酶切的pET-28a载体连接,构建重组质粒pET-28a-scFv。
1.2.3 重组质粒pET-28a-sc (Fv)2-5和pET-28a-sc (Fv)2-15的构建以载体pIT2-scFv为模板,引物3和引物5分别在其3′引入BamHⅠ酶切位点和短linker (GGGGS), 在5′端引入Hind Ⅲ酶切位点和终止密码子TAA。经PCR扩增获得BamHⅠ-短linker-scFv-Hind Ⅲ片段 (简记scFv-5),然后先与pMD-18T Vector连接,再将质粒pMD-18T-scFv-5用BamHⅠ酶和Hind Ⅲ酶进行双酶切,与用相同酶酶切的pET-28a-scFv连接,最终将构建的重组表达质粒命名为pET-28a-sc (Fv)2-5。以重组质粒pMD-18T-scFv-5为模板,引物4和引物5分别在其3′引入BamHⅠ酶切位点和长linker (GGGGS)3, 在5′端引入Hind Ⅲ酶切位点和终止密码子TAA, 经PCR扩增获得BamHⅠ-长linker-scFv-Hind Ⅲ片段 (简记scFv-15),接下来同上述方式,最终构建重组表达质粒命名为pET-28a-sc (Fv)2-15。
将两重组表达质粒做酶切鉴定及阳性菌落的基因测序鉴定,鉴定正确的单菌落提取质粒分别转化至表达菌株E.coli BL21(DE3), 并命名为E.coli BL21/pET-28a-sc (Fv)2-5和E.coli BL21/pET-28a-sc (Fv)2-15。两重组质粒图谱见图 1。
1.2.4 双价单链抗体的诱导表达将鉴定正确的阳性菌株E.coli BL21/pET-28a-sc (Fv)2-5和E.coli BL21/pET-28a-sc (Fv)2-15分别转接于5 ml LB培养基 (含0.1 % Kan抗性) 过夜培养,然后转接至TB培养基 (含0.1 % Kan抗性) 至OD600为0.6左右,加诱导剂IPTG至终浓度为1 mmoL/L,诱导表达5 h,5 000 r/min离心20 min。将获得的菌体超声破碎,8 000 r/min离心,上清和沉淀以及全菌液进行12 % SDS-PAGE分析,pET-28a (+) 空载体作阴性对照。
1.2.5 双价单链抗体的纯化确定以上两种双价单链抗体均为包涵体表达后,两者全按以下方案进行包涵体的纯化。包涵体蛋白用含低浓度尿素的洗涤缓冲液 (含30 mmol/L的Tris-HCl、0.5 mol/L NaCl、2 mol/L尿素和1.5 % Tween-20,pH 7.5) 洗涤,之后用含高浓度尿素的变性缓冲液 (含30 mmol/L的Tris-HCl、0.5 mol/L NaCl和8 mol/L尿素,pH 7.5) 溶解,30度摇床中缓慢振荡1 h使其充分变性溶解,8 000 r/min离心20 min,上清进行铜离子金属螯合层析纯化,将200 mmol/L咪唑洗脱的目的蛋白进行透析复性,复性液中尿素浓度按6、4、2、1、0mol/L的梯度依次进行 (间隔12h)。透析结束的目的蛋白液先经8 000 r/min离心20 min,去除析出的蛋白,上清经rProtein-A FF亲和层析纯化,再经分子筛S-75分离出去剩余少量杂蛋白,获得较纯的双价单链抗体,12 % SDS-PAGE分析每步纯化结果。纯化的终蛋白液于PBS (pH 7.2) 中透析过夜后超滤浓缩,经BCA法测定浓度。
1.2.6 双价单链抗体特异结合活性大小的检测Western blot检测法;取适量全毒素CPA进行蛋白电泳分离,电转至PVDF膜,3 %脱脂奶粉37℃封闭2 h;分别以纯化的sc (Fv)2-5和sc (Fv)2-15(按1:3 000稀释) 为一抗,HRP标记的Protein A (按1:5 000稀释) 为二抗,DAB显色。间接ELISA检测法,具体参考严丹丹等[3]的文献。在酶标板上每孔加入0.5 μg全毒素CPA,100 μl/孔,4 ℃包被过夜。PBS洗涤3次,之后用3 %脱脂奶粉常温下封闭2 h,再用PBS洗涤3次。分别在第一孔加入等摩尔的scFv、sc (Fv)2-5和sc (Fv)2-15作为一抗,然后依次倍比稀释,以抗His-tag的抗体作为二抗,以HRP标记的羊抗鼠抗体作为三抗,每孔加的抗体量均为100 μl且均在常温下孵育2 h, 每次孵育结束后均以PBS洗涤三次,最终以OPD显色并检测OD490值,每个样品做三孔取平均值。
1.2.7 体外毒素中和活性检测利用抗体可以体外中和CPA水解卵磷脂活性和溶血活性的特点, 通过卵黄稀释液和红细胞悬液的浑浊度来比较活性的抑制程度,具体方式参考Zhao等[4]的文献。水解卵磷脂活性抑制试验简述:新鲜卵黄液以8 000×g离心20 min,将上清用生理盐水按1:10倍比稀释,在细胞板上每孔加入100μl等摩尔 (16.128×10-7 mol) 的scFv-8B、sc (Fv)2-5和sc (Fv)2-15分别与10 μg CPA毒素于37 ℃温箱中孵育2 h后分别加到卵黄稀释液中,只加卵黄液和与抗体等量的生理盐水做阴性对照,只加卵黄液和等量CPA毒素做阳性对照,37 ℃孵育2 h,检测OD620。每个样本做三孔取平均值。红细胞溶解活性抑制试验简述:取小鼠新鲜的外周血,1 000×g离心10 min,下层红细胞用PBS (pH 7.2) 洗涤3次,然后稀释成2 %的红细胞悬液,于1.5 ml EP管中每孔加入100 μl。等摩尔 (16.128×10-7 mol) 的scFv-8B、sc (Fv)2-5和sc (Fv)2-15分别与10 μg CPA毒素于37℃温箱中孵育2 h后分别加到红细胞悬液中,只加红细胞悬液和与抗体等量的生理盐水做阴性对照,只加红细胞悬液和等量CPA毒素做阳性对照,37 ℃孵育2 h,反应后1 000 r/min离心5 min, 取上清检测OD540。每个样本做三孔取平均值。
1.2.8 体内生物活性检测方法参考Garcia等[5]的文献,先对小鼠进行抗体保护,之后间隔不同时间以2×LD50(LD50=1.168 mg/kg) 毒素攻毒,计算抗体保护率。具体操作步骤:取4~6周龄昆明小鼠随机分7组,每组6只 (雌雄各半),前三组静脉注射scFv (抗体与毒素的质量比为16:1),后三组注射等摩尔量 (2.41×10-5 mol) 的sc (Fv)2-15,分别于0 h, 2 h, 6 h后以2×LD50静脉攻毒,阴性对照组仅以同样剂量毒素静脉攻毒而未进行抗体保护。24小时内观察动物的死亡情况,计算保护率。
1.2.9 数据分析正态分布数据以均数±标准差 (x±s) 表示,t检验用于数据间的差异显著性分析。所有数据图表均由Graph Pad Prism 5软件设计。差异显著性P值:* P ≤ 0.05,** P ≤ 0.01,*** P ≤ 0.001,**** P ≤ 0.0001。
2 结果与分析 2.1 目的片段的PCR扩增结果以载体pIT2-scFv为模板,引物1和引物2扩增获得目的片段A (NdeⅠ-scFv-BamHⅠ);以载体pIT2-scFv为模板,引物3和引物5扩增获得目的片段B (BamHⅠ-短linker-scFv-Hind Ⅲ);以pMD-18T-scFv-5为模板,引物4和引物5扩增获得目的片段C (BamHⅠ-长linker-scFv-Hind Ⅲ)。扩增获得的三个基因片段经1%琼脂糖凝胶电泳分析,大小分别为730 bp、750 bp和780 bp左右,基本符合预期大小,经公司测序完全正确 (图 2)。
2.2 重组质粒pET-28a-sc (Fv)2-5和pET-28a-sc (Fv)2-15酶切鉴定重组质粒pET-28a-sc (Fv)2-5和pET-28a-sc (Fv)2-15均做三种酶切方式鉴定,分别经NdeⅠ和BamHⅠ双酶切、BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切以及NdeⅠ和Hind Ⅲ双酶切。酶切出的目的片段基本与预期大小一致,经测序鉴定重组质粒均构建正确 (图 3)。
2.3 双价单链抗体的表达及鉴定结果诱导表达的双价单链抗体sc (Fv)2-5和sc (Fv)2-15经12 % SDS-PAGE蛋白电泳分析,结果如图 4,与阴性对照相比,目的抗体均有表达,且裂菌上清中占很少一部分,绝大部分存在于裂菌后的沉淀中,说明目的抗体以包涵体的形式表达,灰度扫描显示,目的蛋白sc (Fv)2-5和sc (Fv)2-15分别占菌体总蛋白的13.88 %和14.29 %。
2.4 双价单链抗体的纯化纯化结果以sc (Fv)2-5纯化为例展示,sc (Fv)2-15的纯化过程与sc (Fv)2-5相同。菌体经裂解离心后获得包涵体蛋白,先洗涤和溶解包涵体,经铜离子金属螯合层析 (MCAC)、透析复性、蛋白A亲和层析以及分子筛获得较纯的目的蛋白,结果如图 5。
2.5 免疫结合活性检测结果纯化的目的抗体sc (Fv)2-5和sc (Fv)2-15经Western blot鉴定结果如图 6a,两者均与A型产气荚膜梭菌α全毒素CPA产生免疫印迹条带,说明纯化后的双价单链抗体与抗原CPA具有免疫结合活性。利用间接ELISA法比较等摩尔的scFv、sc (Fv)2-5和sc (Fv)2-15与抗原CPA的结合活性大小,从图 6b结果看出,sc (Fv)2-15与CPA的结合活性明显高于scFv和sc (Fv)2-5。
2.6 体外生物活性检测等摩尔的scFv、sc (Fv)2-5和sc (Fv)2-15与CPA毒素孵育后分别与卵黄液和鼠红细胞悬液作用,抗体中和CPA水解卵磷脂活性如图 7a所示,中和CPA溶血活性试验如图 7b所示:scFv-8 B、sc (Fv)2-5和sc (Fv)2-15均可有效中和CPA水解卵磷脂活性和溶血活性,且sc (Fv)2-15中和效果明显高于scFv-8B (P<0.01) 和sc (Fv)2-5(P<0.01)。
差异显著性P值:* P ≤ 0.05,** P ≤ 0.01,*** P ≤ 0.001,**** P ≤ 0.0001。
2.7 动物攻毒保护试验比较sc (Fv)2-15和scFv对小鼠攻毒保护率。预先用等摩尔量的抗体sc (Fv)2-15和scFv对小鼠进行预保护,不同时间后对小鼠静脉攻毒,结果发现,未用抗体保护的对照组小鼠全部死亡 (表格中未列出)。在用等摩尔 (2.41×10-5 mol) 的sc (Fv)2-15或scFv预保护小鼠后立刻 (即0 h) 用2×LD50的毒素量攻毒,两种抗体保护的小鼠几乎全部存活,说明使用该剂量的抗体sc (Fv)2-15或scFv均可以抵抗2×LD50剂量的毒素攻击。但随着抗体保护的时间延长,两种抗体sc (Fv)2-15和scFv的保护效果产生一定的差异,使用sc (Fv)2-15保护6 h后攻毒小鼠,保护率可达50%,而使用scFv保护6 h后攻毒的小鼠最终全部死亡 (表 1)。初步说明sc (Fv)2-15对小鼠的攻毒保护效果优于scFv。
3 讨论
基因工程抗体是目前医学领域研究最热的课题之一,现已在许多重大疾病的诊断和治疗方面展现出特殊的疗效。本实验前期尝试将抗体疗法应用于产气荚膜梭菌α毒素的治疗,从鼠源性单克隆抗体到全人源单链抗体均获得了一定的疗效,但是鼠源性单抗会在人体内产生人抗鼠抗体反应[6],而单链抗体结合力低且易被清除等,实际临床应用受到很大限制。本文利用分子克隆技术在人源单链抗体的基础上,构建并表达了基因工程双价单链抗体,在小鼠体外和体内均获得了较好的生物学活性,既彻底避免了鼠源性带来的不良反应,也提高了抗体治疗的效果。
在构建双价单链抗体的过程中,我们采用稳定性高的共价结合方式[7],同时充分考虑到中间连接肽 (Linker) 的长短对两端抗体结构的影响,设计了两种不同长度的连接肽G4S和 (G4S)3, 间接ELISA法检测以及体外活性试验均可看出,短连接肽连接的双价单链抗体与α毒素的结合活性明显低于长连接肽连接的双价单链抗体,我们考虑很可能是短连接肽影响了抗体构象的正确折叠。15个氨基酸的连接肽 (G4S)3是目前应用最好的连接方式[8],很少产生抗体两结合位点的空间位阻,同时也不会产生较强的免疫原性,从而稳定性和结合力均明显提高,从小鼠攻毒保护试验即证明了这一点。
考虑到原核表达操作简单且产量高的特点[9],试验中我们优先选择了大肠杆菌对构建的双价单链抗体进行了表达,但表达均以包涵体形式,非常不利于后期的蛋白纯化,而且会大大影响到最终蛋白纯品的活性,我们从诱导温度、诱导剂量等方面优化条件,试图增加可溶性表达量,但效果均不明显。为了促进蛋白可溶性表达,后期试验中可采取与TrxA、sumo等具有促进蛋白可溶性表达的辅助蛋白融合表达[10-11],从而提高蛋白的纯化收率和纯化后的生物活性。
本研究利用基因工程技术成功获得具有中和A型产气荚膜梭菌α毒素的全人源双价单链抗体,为该毒素引发的各类疾病的诊断和治疗奠定了基础。
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