2017, Vol. 37文章信息
- 时桂芹, 周文珊, 任菲.
- SHI Gui-qin, ZHOU Wen-shan, REN Fei.
- 微生物发酵提高SOD产率的研究进展
- Research Progress on Increasing SOD Production by Microorganism Fermentation
- 中国生物工程杂志, 2017, 37(4): 115-124
- China Biotechnology, 2017, 37(4): 115-124
- http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20170416
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文章历史
- 收稿日期: 2016-12-22
- 修回日期: 2017-02-02
SOD是一类重要的保护机体免受氧化损伤的抗氧化酶，它能够催化超氧阴离子 (O2-·) 等自由基发生歧化反应，消除超氧阴离子的毒性，因而在医药、食品和化妆品添加剂等方面有着广阔的应用前景[1]。目前，对SOD的生产研究已成为国际学术界研究的热点，但国内SOD主要从动物血液及肝脏中提取, 与国外还存在较大差距，尤其是有关微生物SOD的理论与应用研究报道极少，对微生物SOD的研究尚未有突破性进展[2-3]。鉴于动物血液来源困难又容易污染, 而微生物可以人工培养的优点, 因此目前研究者把研究热点放在微生物发酵法制取SOD上。本文论述了近年来研究者为获得高产SOD进行的菌种选育、培养基与培养条件优化及分离和纯化方法的改进，以期为相关研究人员和企业的进一步研究提供一定的参考。
1 微生物SOD的种类和分布SOD催化中心结合有不同的金属离子，是一类金属酶, 按其结合金属离子的不同可以分为4种：Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD和Ni-SOD。它们的分布也有很大差别，其中Cu/Zn-SOD大部分分布于真核细胞的叶绿体基质及细胞质中，呈一种蓝绿色，且Cu/Zn-SOD在细菌、植物和动物中的编码基因不尽相同[4]；Mn-SOD大多数分布在细菌中及真核生物的线粒体中，呈紫红色；而Fe-SOD大多数存在于原核生物和少数植物中，呈黄褐色，编码Fe-SOD的基因序列在原核生物和植物叶绿体中相似性很高[5, 6]。而Ni-SOD只在链霉菌属和蓝细菌中发现，对其研究也相对较少，通过序列分析发现这些Ni-SOD大多存在于海洋生物中[7]。
SOD在微生物中分布较广泛，需氧微生物、耐氧微生物及某些厌氧微生物中都有SOD的存在。SOD含量已经在多种微生物中进行了测定，研究结果表明SOD含量在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中差异不大，在放线菌和细菌中其含量也同样没有明显差异，但厌氧细菌中SOD含量明显低于好氧的原核微生物，并且严格的厌氧细菌 (如泥生绿细菌、甲烷杆菌) SOD含量几乎为零。不仅菌体的需氧程度与SOD含量密切相关，耐氧能力与SOD含量也有很大关系，一般菌体耐氧能力与SOD含量呈正比，此外原核生物SOD含量明显低于真菌[8]。因而可以得出SOD含量在微生物类群中的基本规律:原核生物的SOD含量一般低于真核微生物, 厌氧微生物显著低于好氧微生物[9]。
2 微生物SOD基因的表达规律生物体内的Fe-SOD和Cu/Zn-SOD大多数是组成型表达，含量也比较稳定，而Mn-SOD多数会被诱导表达[10]，其表达量大多会受外界条件的影响，且一种形式的SOD酶表达受抑制，会导致其他形式SOD酶表达的增加。总的来说，原核生物SOD基因会受其生长条件和表达调控及所处环境的影响，真核生物则与其生长发育阶段及体内激素等相关，而微生物来源的SOD的表达与微生物的生长发育阶段及所处的营养条件有直接的关系。例如，Mn-SOD只在菌体处于静止期，或培养基中添加的Fe不足，或加入Mn或Fe的鳌合剂不足时才开始转录。此外，研究表明细胞新陈代谢的变化和刺激的反应也会大大影响SOD的表达[11]。由于生物是个复杂的有机生命体，SOD基因的表达受到生物体内多个因素和外界环境的共同影响。
3 提高SOD产率的策略 3.1 SOD高产菌株的选育大量研究表明原核微生物SOD含量明显低于真核微生物，丝状真菌低于酵母SOD含量，厌氧微生物低于好氧微生物，严格厌氧微生物体内SOD含量几乎为零。优良菌种的选育是微生物发酵法生产SOD的重点，利用常规诱变育种和生物工程技术可以得到优良的生产菌株。
3.1.1 常规诱变育种获得高产菌种传统的诱变育种方法大致可分为两大类：一是化学诱变，主要用一些化学诱变剂处理，如叠氮化钠、硫酸二乙酯、亚硝酸盐、亚硝基胍和甲基磺酸乙酯等；二是物理诱变，如放射线诱变、紫外线诱变和超声波诱变等。抗性筛选时常用的抗性筛选物有乙硫氨酸、氯化锌、甲硫氨酸和三氮唑等。
研究表明酵母、细菌及霉菌都能作为制备SOD的出发菌株，但研究较多的是酵母菌。例如，1株SOD高产酵母菌ZDF-48经单倍体分离、诱变和群体杂交等手段被选育出来，SOD产量为1 350U/g湿菌体，对其进行培养条件优化后，产量可提高至2075U/g湿菌体[12]；杨明琰[13]从50株不同种属的酿酒酵母中筛选出一株生物量及SOD含量均较高的酵母菌B94，以其为出发菌进行了原生质体紫外线诱变，亚硝基胍及60Co-γ射线复合诱变育种，结果得到一株高产突变株CNU94，其SOD含量为1 872U/g湿菌体，较出发菌提高134%，且遗传性能稳定，是一株有生产潜力的高产SOD菌株；2株生物量和SOD含量都较高的酿酒酵母菌株采用常规筛选方法也从300多株不同种属的酵母菌中筛选出来。后经单倍体分离, N-甲基-N-亚硝基-N′-硝基胍 (MNNG) 诱变和群体杂交等手段, 从中选育出一株细胞生物量略高于实验出发菌，SOD高达1 350U/g湿菌体的高产菌株[14]。
细菌属于原核生物同样可以通过诱变育种的方法获得高产菌株。沈阳农业大学迟乃玉等[15]从200多株不同种属的乳酸菌中筛选到一株SOD产量较高的菌株，经复合诱变，在优化培养条件下，SOD含量达9 100U/g湿菌体 (NBT光化还原法)。大肠杆菌同样也可以作为出发菌株，通过紫外线诱变处理，选育出SOD高产菌株 (编号：ECM3)，其SOD酶活达4 098.1U/g，为实验出发菌株的2.1倍，经连续传代5次后仍能稳定产酶[16]。
3.1.2 基因工程育种获得高产菌株基因工程法是获得应用所需要SOD产品的有效途径。近年来，美国、日本、英国和德国相继开发了微生物基因工程产品，并进行了临床实验。基因工程育种技术可实现超远缘杂交，是一种可预先设计和控制的育种新技术，其筛选标记广泛、机理较明确、高产菌株的筛选率比较高，近20年来发展较快，国内也有许多学者正在致力于研究利用这种技术来提高SOD产量。目前，能够操作的菌株有大肠杆菌、毕赤酵母、乳酸乳球菌等，通常采取对SOD合成酶系的改造，进而提高SOD的含量。天然SOD在应用方面受到很大限制，因人体注射后会产生异体蛋白免疫原性，不易被人体接受，且天然SOD来源也很有限。而SOD基因工程产生的酶是广开酶源, 获得无抗原性的人源SOD的有效途径，还能降低成本。
为了提高SOD的表达量，陈伟等[17]运用E.coli BL21(DE3)/pET28a (+)-SOD重组表达系统，获得了重组SOD表达蛋白的工程菌。在优化条件下，菌体密度达到最高并且目的蛋白表达量为全菌体蛋白的52.90%，比基础培养基发酵条件高出0.68倍。李鹤宾等[18]同样也是利用E.coli BL21(DE3)/pET28a (+)-SOD重组表达系统，将来源于嗜热栖热菌 (Thermus thermophilus) wl的Mn-SOD基因克隆至pET-28α (+) 表达载体，并对其发酵培养基和发酵条件进行了优化，结果表明：在优化条件下，工程菌的SOD活性达1 969.9 U/ml，比活力达1 081.8U/mg。Tan等[19]利用E.coli BL21(DE3)/pRSET-A-SOD重组表达系统，将乳酸乳球菌的SOD基因克隆到pRSET-A表达载体，获得了高活性的蛋白表达。因厌氧细菌中SOD含量明显低于好氧的原核微生物，据报道有研究者将好氧菌蓝藻细菌的SOD全长序列进行扩增，并与pET-26b相连转入E.coli宿主菌中，该重组蛋白在pH7.8时活性是最高的[20]。一株含SOD的菌株P.sp.ANT506从南极微生物Pseudoalteromonas sp.中筛选出来，并与pET-28(a+) 连接，将其转入表达宿主菌E.coli BL2(DE3)，优化并验证了rPsSOD活性最高时的发酵条件：0.047%吐温-80、6.16g/L胰蛋白胨、11.38g/L乳糖、5g/L酵母粉、10g/L NaCl、pH7.5，这将为SOD重组菌的大规模发酵提供重要参数[21]。Dhar等[22]扩增了类鼻疽伯克霍尔德菌Fe-SOD全长序列，并与pDEST17表达载体相连，转入大肠杆菌表达系统中，结果表明Fe-SOD的活性大大提高，并对百草枯农药有一定的抗药性。Zhu等[23]将结肠炎耶尔森杆菌SODA、SODB和SODC克隆到pET28a (+) 载体上，转入表达菌株E.coli BL2(DE3)，并对其培养条件进行了优化，发现SODA和SODB在温度为4℃和pH值分别在6.0和4.0时酶的活性是最高的。嗜热性土芽孢杆菌SOD同样也被克隆到表达菌株E.coli BL2(DE3) 中，重组蛋白具有较好耐热性及pH范围耐性[24]。还可以通过定点诱变的方法先将基因序列发生定点突变，再将其转入到大肠杆菌表达系统中，闫震[25]就是利用这种方法分别改变编码C36株菌体内SOD第103位和188位氨基酸的密码子，并将具有碱基置换位点的SOD基因连接到表达载体PUC18上，转化入大肠杆菌JM109中，分别构建重组表达菌株G309T和A562G，结果表明，C36菌体中的Mn-SOD，其单体第188位的异亮氨酸对提高SOD稳定性发挥的作用更明显。
国外对重组人SOD研究较早，Takahashi等[26]将人的Mn-SOD基因连接到含tac-PL杂合启动子的载体上，转入大肠杆菌表达系统中，其表达量为7.7×105U/L，而只含PL启动子的质粒，表达水平仅为2.1×105U/L。Gorecki等[27]同样将人Mn-SOD转入大肠杆菌中表达，表达量为25%，分子质量为22kDa。Bae等[28]首次将人EC-SOD与麦芽糖结合蛋白 (MBP) 及蛋白质二硫键异构酶相连，转入大肠杆菌表达系统中，获得了可溶性EC-SOD蛋白的高表达，并利用MBP和阴离子交换亲和层析进行蛋白的纯化，获得高活性的EC-SOD蛋白。Marisch等[29]将人SOD作为模式蛋白，比较了三种工业化E. coil表达菌株[BL21(DE3)、RV308(DE3) 和HMS174(DE3)]的生长特性、生产力、产品质量及系统的总体稳定性。我国重组人SOD研究起步较晚，施惠娟等[30-31]分别以人胎肝组织及人肝细胞株 (L02) 总RNA为模板，以RT-PCR法获得hCu/Zn-SOD和hMn-SODcDNA，构建表达质粒pETSOD，并导入E. coil细胞中使之表达，分别获得了38%和50%的高表达率且有活性。
以上的研究都是利用E. coil进行的表达，它是属于原核表达系统，而酵母是真核表达系统，其表达的SOD是可溶性蛋白，且N-末端是乙酰化的, 与天然SOD的结构一致, 但E. coil没有乙酰化功能。所以酵母表达外源蛋白的生物环境更接近于天然产物，且没有内毒素污染的问题，因此用酵母表达人SOD具有很好的实用价值。但人Cu/ZnSOD在甲醇酵母中表达时，其表达量及酶活均没有E. coil表达量高。母茜[32]选用啤酒酵母工业菌株YSF31为材料，采用自克隆技术构建了一个新的啤酒酵母工程菌株，得到的新菌株同YSF31比较双乙酞含量有所降低，SOD的表达量升高，抗老化的能力增强。Raimondi等[33]为了开发SOD的微生物产品，将SOD与多拷贝质粒YG-KmSOD1相连转到马克斯克鲁维酵母工程菌中，获得了高产的SOD酵母工程菌，当培养基中添加Cu2+和Zn2+时，SOD最高产量可以达到8.8×105 U/L。Wang等[34]将SOD和GSH相连构建SOD分泌质粒，将其转入酵母工程菌中，发酵后获得比宿主菌二乙酰和乙醛含量分别低42%和29%的发酵液，分泌型SOD的活性明显升高。将梅花鹿的Cu/ZnSOD与表达载体pPIC9K相连，再克隆到毕赤酵母中，在5ml发酵罐中可以获得3500 U/ml活性，通过DEAE-650 C和Superdex75两步逐步层析，产率达到13.8%[35]。平菇Mn-SOD同样也被克隆到毕赤酵母中，并对重组蛋白的培养条件进行优化，发现pH6.0、甲醇浓度为0.7 % (v/v)、诱导时间为第6天时，酶的活性可以达到156.9 U/mg[36]。
启动子及其他载体元件能够显著影响目的基因转录的强度与持续性，进而影响目的蛋白产率。为了获得Cu, Zn-SOD基因的高表达，Hallewell等[37]分别将Tacl启动子和酵母甘油醛磷酸脱氢酶启动子转入大肠杆菌和酵母表达系统中，指导Cu/Zn-SOD基因获得了高效表达，产生了可溶性且具有正常酶活性的人的Cu/Zn-SOD。Yoo等[38]将人Cu/ Zn-SOD基因与含3-甘油醛磷酸盐脱氢酶基因启动子相连，并克隆到酵母表达菌中, 重组质粒产生约占总细胞蛋白6%的人Cu/Zn-SOD, 且表达的SOD具有酶活性。
3.2 培养基与培养条件优化提高SOD产率为了进一步使菌株产量增加，可以在筛选高产菌株的基础上再对菌种的培养基以及培养条件进行优化，并且引入一些数理统计方法及试验设计，可以有效地设计试验方案。
3.2.1 细菌细菌的培养条件 (培养时间、培养基配方、培养温度和摇床转速等) 都会对SOD的产量影响很大，培养基配方尤其重要。李兰等[39]从4种不同的枯草芽孢杆菌菌株中筛选出1株SOD产量较高的菌株，以高产菌株作为出发菌株进行SOD活性的研究，最终确定最佳发酵培养基配方。结果表明:初步优化的培养基条件为25%的葡萄糖、0.6%的酵母粉和0.1%的玉米浆，此条件下，高产菌株SOD产量达到203.7U/ml。刘剑利等[40]通过稀释平板法从土壤中分离筛选到1株SOD高产菌株，并进一步研究碳源、氮源、碳氮比、接种量和装液量对发酵产酶的影响。发酵条件优化结果表明产酶最佳条件为：最佳碳源为玉米粉，最佳氮源为蛋白胨，碳氮比4:1，接种量8%，250ml三角瓶装液量70ml。不仅大肠杆菌产SOD的培养基成分可以优化，乳酸菌和芽孢杆菌产SOD的培养基配方同样也可以优化，进而获得产量较高的SOD。对一株高产SOD乳酸菌SD06S的发酵培养基进行了优化。该菌株最适产酶培养基为:酵母膏5 g/L、蛋白胨13.82 g/L、葡萄糖20.14 g/L、乙酸钠2 g/L、磷酸二氢钾2.5g/L、CuSO4·5H2O 0.28g/L、ZnSO4·7H2O 0.5g/L、吐温－80 1.5ml/L，其最高酶活为4206 U/g。通过对产SOD菌株SD06S发酵培养基优化研究, 显著提高了SOD活力[41]。自然条件下筛选出的产SOD活性较高的菌株，可以先进行鉴定，再对该菌株的产酶培养基进行优化，结果表明，当培养基主要成分玉米浆粉、海带浆、葡萄糖和硫酸锰质量浓度 (g/L) 分别为4.5、4.11、2.10和0.62时，SOD活性最高达到203.38 U/ml[42]。李晓艳等[43]在单因素实验基础上, 采用Plackett-Burman (PB) 设计、Box-Behnken (BB) 设计和响应面分析法 (RSM)，对发酵培养基进行优化。结果显示，植物乳杆菌CLP0279产低温SOD最佳发酵培养基 (g/L)：玉米粉25.0、磷酸二氢钾2.6、磷酸氢二钾1.83、硫酸铜0.011、硫酸锌0.014，在最佳培养基条件下产酶活力达到194.82 U/ml，是优化前的1.36倍。
为了获得高产SOD，除了优化培养基配方外，还可以对培养温度、培养转速和pH值等进行优化。胡滨等[44]对筛选的高产SOD大肠杆菌菌株进行发酵培养, 探索了培养时间、培养温度和摇床转速等对大肠杆菌细胞培养生产SOD的影响。结果显示：培养时间16 h、摇床转速200 r/min、培养温度38 ℃，产酶量达到最高，可达7 740 IU/g湿菌体。除了大肠杆菌以外，产SOD的乳酸菌同样也可以优化发酵条件，找出最适发酵条件为：28~32℃、pH=7.0、发酵24h后静止培养[45]。阚国仕等[46]对一株产Mn-SOD的耐碱芽孢杆菌Bacillus sp.110-3的发酵条件进行了优化。通过对培养基碳源组成、氮源组成、碳氮比例以及培养基始初pH和金属离子对菌株Bacillus sp.110-3产Mn-SOD的影响进行研究，确定了培养基的最佳组成为：玉米粉4%、蛋白胨1%、酵母膏0.5%、氯化钠1%、Mn2+100μmol/L、pH6.0~8.0。Baez等[47]探讨了高浓度氧对大肠杆菌Sod表达的影响，结果发现随着溶氧量浓度的升高SodC、Cu/ZnSod和SodA的表达量高于对照组，而FeSod的表达量低于对照组。
3.2.2 酵母菌当细胞生长到对数生长后期时，菌体内酶的含量达到最高，此时菌体生物量也基本为最高，所以较适宜的培养时间为对数生长的后期。另外，培养的温度及培养基的pH也会对产酶量有较大影响。金连豆等[48]在单因素试验基础上，确定了海洋胶红酵母菌Rhodotorula sp.CD-008产超氧化物歧化酶的最佳发酵条件。结果表明，pH、转速、温度对酶活力有显著影响，最优发酵条件为pH 5.34、转速150r/min、温度21.40℃，优化后发酵液酶活力达到6 430.52 U/g湿菌体，比优化前提高了1.53倍。宫莉等[49]从数株酵母菌中选出了一株细胞生物量和SOD含量都较高的菌株，研究了该菌株产SOD较适宜的培养基组成、pH值和时间等发酵条件。结果表明，最适碳源是麦芽糖、最适氮源是蛋白胨、最佳pH值为4.0~5.0、最适发酵时间是12~15 h，优化了发酵条件，易于快速选育高产SOD酵母菌。
微量金属离子对菌体的生长、微生物SOD的合成及酶活性能都有一定影响，其原因可能是SOD属于一种金属酶，它可以作为酶的金属辅基。因此有必要确定微生物所产SOD的种类后，再适当添加不同的金属离子，进而增加SOD产量。氧对细胞SOD合成也有较显著的促进作用，通过通风提高供氧能力可以增加微生物SOD含量。王岁楼等[50]研究了金属离子与通气量对耐高温酒精活性干酵母 (TH-AADY) SOD摇瓶发酵的影响。结果表明, 金属离子和通气量 (装液量) 等均对AADY摇瓶发酵的生物量和SOD含量有较大的影响，在初步优化的发酵条件下, 细胞生物量为39.6g/L, 菌体SOD含量为1 948U/g，发酵液产酶能力为7.7×104U/L。刁治民等[3]也研究了金属离子和装液量对酵母菌SOD发酵的影响，结果表明，金属离子和装液量等对酵母发酵的生物量和SOD含量也有较大影响。在初步优化发酵条件下，细胞生物量为33.90g/L，菌体SOD含量为1 871.68U/L，发酵液产SOD能力为6.34 ×104U/L。
除了培养温度、培养基pH、金属离子及通气量对SOD的产生有较大影响外，培养基成分中的氮源也大大影响SOD产量。阳辛凤等[51]探讨了培养温度、装液量、时间、氮源类型等发酵条件对SOD高产酵母菌株Yb0101产酶的影响。结果表明，温度30℃、装液量40ml、发酵时间21h发酵后所得的粗酶液SOD活力最高。尿素浓度为0.2%和0.4%以及硫酸铵浓度为0.2%时，SOD活力均增加，但生物量均减少。王伟霞等[52]从海洋中筛选出1株产SOD能力较强的酵母菌菌株Y9，研究了不同碳源、氮源、碳氮比和金属离子对其细胞生物量及产SOD的影响。结果表明，菌株Y9产SOD最适发酵条件为pH6.5、Mn2+浓度150μmol/L、500ml三角瓶装液量60ml、接种量为10%, 在此优化条件下，菌株Y9的SOD总量可达2 280.2U/L, 比初始产量提高了14.2%。周建琴[53]利用25株酵母菌进行产SOD的筛选，得到1株高产SOD的菌株，并通过单因素试验确定其适宜的培养基组成、pH值、发酵时间等条件。结果表明，最适宜的碳源为麦芽糖，氮源为蛋白胨，碳氮比为6:1，发酵时间为18 h，pH值为5.0。Kimoto-nira等[54]评价了培养基中的糖类对乳糖乳球菌SOD活性的影响，结果表明乳糖乳球菌SOD活性受糖类的影响是菌株依赖性的，并且商业化乳糖乳球菌活性的增强可以通过糖类的筛选进行混合酸发酵或者改变其能量分布，进而增强奶制品的产量。
3.3 分离纯化技术优化提高SOD产率发酵法生产SOD早在80年代美国和日本就先后进行了开发，发酵法提取纯化SOD的工艺相对复杂一些，因为SOD为胞内酶，至少需要6步才能获得较纯化的SOD，一般经过细胞破碎、离心、盐析、透析、离子交换层析 (2~3次) 和凝胶层析等才能达到比活>3 000μ/ mg[9]，SOD的回收率只有30%左右。文献[9]中Grunow将分离工艺从6步简化到5步，研发了冻融法破碎细胞及疏水色谱纯化工艺，使SOD回收率达到68 %，但此方法很难放大。谭天伟等[55]开发了4步法 (包括异丙醇释放、超滤浓缩、0.8倍丙酮沉淀、丙酮2次沉淀4步) 提取SOD的分离纯化新工艺，使SOD比活达到389μ/mg，SOD总收率为66 %。一般来说，不同的微生物细胞分离纯化SOD的方法和步骤是不一样的。
3.3.1 细菌SOD的分离纯化邢德明等[56]通过硫酸铵沉淀、超滤、Sephadex-G100、DEAE-Sepharose FF等方法对一株产SOD相对较高菌株SD006中的SOD进行分离纯化，纯化后酶活达37 959.2 U/g。刘建荣等[57]以金属离子螯合剂乙二胺四乙酸 (EDTA) 代替超声法使重组大肠杆菌菌体释放，并采用透析法复性包涵体，经凝胶色谱纯化后，目的蛋白纯度约为90%，酶比活力为5 400 U/(mg蛋白)。朱文杰等[58]从东方弧菌518菌株中先以硫酸胺分级沉淀取得粗酶，再经DE-52 DEAE-纤维素柱层析，并以5~500 mol/L磷酸钾缓冲液作线性梯度洗脱，再次分级沉淀而获得纯化的SOD。Benov等[59]利用渗透震扰破壁法从大肠杆菌中提取SOD，产物活力可以达到3 700U/mg。Pagani等[60]利用溶菌酶超声波辅助破壁法从固氮菌中提取Fe-SOD，获得粗提物活力7.1U/mg。
3.3.2 酵母菌SOD的分离纯化酵母破壁方法种类很多，包括超声波破壁、氯仿-乙醇法破壁、酶裂解法、细胞自溶法以及甲苯破壁法。杜娜等[61]以葡萄酒泥酵母为原料，采用超声波辅助蜗牛酶酶解葡萄酒泥酵母细胞壁分离提取SOD，并对其工艺进行优化，分离提取得到的SOD比活力达192.27 U/mg。祝霞等[62]同样以葡萄酒泥酵母为基料，采用超声波对酵母细胞进行破壁的方法分离提取SOD，分离提取得到的SOD比活力最高为169.32 U/mg。苏昕等[63]也利用超声波破壁抽提获得酵母SOD粗酶液，采用硫铵盐析、丙酮沉淀、Sephadex G-100凝胶过滤和QAE-Sephadex A-50离子交换柱层析，分离得酵母SOD，其比活力为1 073.5U/mg。Yoo等[64]利用硫酸铵-甲醇萃取和DEAE-纤维素柱层析法分离提取了酵母中的重组人SOD1，粗提物活力为82U/mg。Nedevaa等[65]利用热处理、透析、离子交换色谱和聚焦层析方法分离纯化了酵母Cu/ZnSOD，其酶活力可以达到996U/mg。
3.3.3 真菌SOD的分离纯化武金霞等[66]采用硫酸铵分级盐析、DEAE-Cellulose-52离子交换柱层析、Sephadex G-150分子筛柱层析分离纯化了双孢蘑菇 (Agaricus bisporus) 子实体SOD，获得酶的比活力为5 512.6U/mg。Wang等[67]通过 (NH4)2SO4沉淀、阴离子交换层析、阳离子交换层析和凝胶过滤层析4步法提取纯化了蛹虫草中的SOD，酶的活力达到52.8U/mg。Ozturk等[68]采用二乙胺乙基纤维素离子交换色谱法及交联葡聚糖凝胶过滤层析法将白腐菌中的SOD分离出来，粗提物酶的活力达到42.5 U/mg。Tolfo等[69]将绿僵菌中的Cu/Zn SOD提取出来，粗提物酶活力达到282.60U/mg。
4 展望自1938年首次发现SOD以来，其研究领域不断扩展，研究内容不断深化。目前，SOD作为药用酶用于临床已有深入研究，但由于其制备纯化工艺复杂，生产成本高，因而在食品中应用不广泛，鉴于从微生物中提取SOD存在诸多优点，例如：微生物生产方法原料低廉易得、工艺简单易行、产量高、质量优等优点。近几年，国内外在微生物发酵生产SOD的菌种选育、高产菌株的开发、发酵工艺的优化以及SOD的应用等方面的研究都取得了一定的进展。随着研究的不断深入SOD的应用前景将更为广阔，应用范围将逐渐涉及到以下几方面：如：(1) 临床应用方面将进一步阐明SOD在体内的抗氧化过程，延长SOD在体内的半衰期，减少其对机体的毒副作用等；(2) 食品工业方面，要确保口服SOD有效性，使之不被胃蛋白酶分解等；(3) 化妆品应用方面，要准确地测定SOD的活性大小，同时要明确化妆品基质对SOD活性和稳定性的影响等。今后，微生物发酵生产的SOD不仅可以不经过传统的纯化工艺直接用于食品及化妆品，还可直接用于乳品发酵、生产功能性食品及微生态制剂等，今后随着研究的进一步深入利用微生物生产SOD将逐步实现产业化。
致谢 本研究由河南省普通科技攻关项目 (名称：高表达SOD对酿酒细胞老化过程中生理生化的影响及其在啤酒风味改良中的应用研究) 和郑州市普通科技攻关项目 (名称：啤酒酵母超氧化物歧化酶的克隆表达及其在啤酒生产中的应用研究141PPTGG399) 支持，特此致谢。| [1] | 刁治民. 超氧化物歧化酶的研究及应用. 青海科技, 1995, 2(1) : 1–7. Diao Z M. Study and application of superoxide dismutase. Qinghai Science and Technology, 1995, 2(1) : 1–7. |
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