2017, Vol. 37文章信息
- 罗丹, 王莉娟, 孙秀璇, 张征, 陈志南.
- LUO Dan, WANG Li-juan, SUN Xiu-xuan, ZHANG Zheng, CHEN Zhi-nan.
- 应用CRISPR/Cas9技术构建miR-362敲除的95-D肺癌细胞株
- Construction of miR-362 Knockdown 95-D Cell Line by CRISPR/Cas9 Technology
- 中国生物工程杂志, 2017, 37(11): 94-100
- China Biotechnology, 2017, 37(11): 94-100
- http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20171113
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文章历史
- 收稿日期: 2017-06-14
- 修回日期: 2017-08-08
2. 空军军医大学(第四医科大学)细胞工程研究中心 西安 710032
2. Cell Engineering Research Center, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, China
肺癌是我国常见的、发病率和致死率均居首位的恶性肿瘤[1]。肺癌的发生发展是缓慢而持续的过程，涉及染色体稳定性、表观遗传学改变、基因表达调控等多因素、多信号通路的共同参与。近年来，随着高通量测序技术的发展，尤其是基因组、转录组等研究的不断深入，包括miRNAs在内的非编码RNA在肿瘤发生发展中的作用也受到人们的关注。
MicroRNAs(miRNAs)是一类非编码小分子RNA，通过与沉默复合体(RISC)结合介导靶基因mRNA降解或阻碍其翻译[2]。研究表明miRNAs在肿瘤细胞中广泛存在，并发挥着重要的促癌因子或抑癌因子的作用[3-5]。MiR-362定位于人基因组Xp11.23。研究表明，miR-362在胃癌中可作为促癌因子，通过激活NF-κB通路诱导细胞增殖和凋亡耐受[6]；然而，也有研究证明，miR-362在神经母细胞瘤中作为肿瘤抑制子，通过靶向PIK3C2B抑制肿瘤细胞的增殖、迁移[7]。为了明确miR-362在非小细胞肺癌演进中的作用机制，有必要建立完全敲除的细胞株。
基因编辑技术为在基因组水平进行定点操作提供了良好的方法。目前，常用的基因组编辑技术除了锌指蛋白(zinc finger protein, ZFP)技术、转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALEN)技术以外，RNA引导的CRISPR/Cas9核酸酶技术在基因编辑中的应用也越来越广泛。Cas9系统是微生物自我保护、防止外来微生物的侵入的一种独特机制，它是继ZFN和TALEN之后出现的更为快捷和有效的基因编辑工具。目前已发现的有三种CRISPR/Cas9系统，其中Ⅱ型系统研究最为深入、应用最为广泛，其可产生抗噬菌体的嗜热链球菌菌株(Streptococcus thermophiles strains)。该系统通过Cas9内切核酸酶在特定的靶向序列处引入双链断裂的(double strand break, DSB) DNA缺口，继而通过细胞内NHEJ途径(non-homologous end joining, NHEJ)和同源重组(homologous recombination，HR)途径两种DNA修复机制完成修复，其中NHEJ途径使基因组在DNA缺口处有碱基的插入或者缺失，造成移码突变，导致基因的敲除。而HR途径则以外源DNA为模板，使基因组DNA得到精确的基因修复或靶向基因的添加。
本研究采用了CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术，通过同源重组途径，并结合Cre/LoxP系统构建了miR-362敲除的95-D细胞株；并利用Transwell方法初步证明miR-362可促进非小细胞肺癌的迁移和侵袭，为进一步研究miR-362在非小细胞肺癌中的作用机制和功能奠定了基础。
1 材料与方法 1.1 材料人肺癌细胞系95-D为本实验室冻存。PX330质粒(Addgene公司)，donor vector (Mo Yin-yuan惠赠)，试剂：限制性内切核酸酶BbsI、T4连接酶(NEB公司)，质粒DNA小提试剂盒、DNA片段纯化试剂盒(Omega-biotek公司)，转染试剂Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)，miScript Ⅱ RT kit和miScript SYBR® Green PCR Kit(QIAGEN)。
1.2 方法 1.2.1 质粒构建基于pre-miR-362基因组序列，本文利用在线工具CRISPR design (http://crispr.mit.edu/)查找潜在的sgRNA序列，并在正义链的5′端添加CACC，反义链的5′端添加AAAC(表 1)，与BbsI酶切后形成的黏性末端互补。所有寡核苷酸链均由生工合成。将sgRNA寡核苷酸链经退火(95℃，5min后自然降至室温)，连入经Bbs I酶切回收的pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9表达载体。转化感受态细胞挑取单克隆，小提质粒并测序验证(由华大基因公司完成)。
| Primers | Sequences (5′-3′) |
| gRNA1 F | CACCTGGAACCTAGGTGTGAGTGC |
| gRNA1 R | AAACGCACTCACACCTAGGTTCCA |
| gRNA2 F | CACCCAGTGCAACACACCTATTCA |
| gRNA2 R | AAACTGAATAGGTGTGTTGCACTG |
| gRNA3 F | CACCAGGTGTGAGTGCTATTTCAG |
| gRNA3 R | AAACCTGAAATAGCACTCACACCT |
| gRNA4 F | CACCGGTTCCAAGGATTCAAGAGG |
| gRNA4 R | AAACCCTCTTGAATCCTTGGAACC |
| gRNA5 F | CACCAGGTTCCAAGGATTCAAGAG |
| gRNA5 R | AAACCTCTTGAATCCTTGGAACCT |
| gRNA6 F | CACCTGCTCCCCCTCTTGAATCCT |
| gRNA6 R | AAACAGGATTCAAGAGGGGGAGCA |
| gRNA7 F | CACCGCCTCTTTGAATCCTTGAAT |
| gRNA7 R | AAACATTCAAGGATTCAAAGAGGC |
| D362-F | CCCACAAACATACACAAAAGCAT |
| D362-R | TGGGCACACATGTACATGCAC |
| Cre-5.1-HindIII | AAGCTTGCCACCatgtccaatttactgaccgtac |
| Cre-3.1-XhoI | CTCGAGctaatcgccatcttccagcag |
| 362-seq-5.1 | Agtaagtaccttgtgtgaagaagaatg |
| 362-seq-3.1 | Cacacatgtacatgcacatgtt |
为构建miR-362的donor vector，我们利用pfu DNA聚合酶从基因组DNA中分别扩增了miR-362的上下游同源臂(约800bp)，所用引物见表 1，并插入到donor vector中，转化感受态细胞挑取单克隆，小提质粒并测序验证(由华大基因公司完成)。
1.2.2 T7 endonuclease I酶切实验将构建的PX330-gRNA载体分别转染至95-D细胞，培养48h后，利用DNA提取试剂盒(天根)提取基因组DNA。利用引物362-seq-5.1和362-seq-3.1(表 1)扩增含sgRNA作用靶点的DNA片段。反应条件:95℃ 5min; (95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s)×30; 72℃ 10min。用PCR纯化试剂盒(Omega bio-tek)纯化PCR产物。取200ng纯化PCR产物在NEB Buffer 2中变性、复性，反应条件变性95℃，5min，退火95~85℃ (-2℃/s)，85~25℃(-0.1℃/s)后，用T7内切核酸酶(NEB，M0302L) 37℃孵育15min，然后用2%的琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像。
1.2.3 细胞转染和筛选将95-D细胞以5×105/孔接种至6孔板中培养至细胞汇合度达到60%~70%，用lipofectamine2000将PX330-gRNA和DONOR-362共转入细胞中。培养一周后用0.5μg/ml嘌呤霉素进行加压筛选。筛选两周后，利用流式细胞仪将依据GFP信号将单个细胞分选至96孔板继续培养2~3周。分选获得的细胞经扩大培养后冻存。
1.2.4 用Cre酶去除重组LoxP位点利用HiScribe T7 ARCA mRNA Kit (with tailing) (NEB公司)按照说明书操作合成Cre mRNA。简要描述如下，利用引物Cre-5.1-HindIII和Cre-3.1-XhoI通过PCR扩增获得含有T7启动子区的Cre编码区。以纯化后的PCR片段产物为模板合成Cre mRNA。将前述筛选得到的95-D-KD-GFP的细胞种于6孔板中过夜培养后，将3μg Cre mRNA转染至细胞。转染3天后扩大培养。利用流式细胞仪分选不含绿色荧光的细胞。
1.2.5 RNA提取及实时定量PCR用Trizol(Thermo Fisher scientific)分别提取野生型和敲除型95-D细胞的总RNA，利用miScript Ⅱ RT kit(QIAGEN)逆转录成cDNA，并利用miScript SYBR® Green PCR Kit(QIAGEN)。检测miR-362在野生型和敲除型95-D细胞中的表达水平，实验以U6为内参。
1.2.6 Transwell细胞迁移实验将95-D和95-D-KD细胞用胰酶消化，PBS洗1~2遍，用无血清培养基重悬，调整细胞密度至5×105个/ml，取细胞悬液100μl加入Transwell小室，24孔板下室加入500μl含10%胎牛血清的培养基，置于37℃孵箱常规培养20h后，取出小室，经淋洗、固定、染色后于显微镜下计数，每样本计数5个视野取平均值，实验重复3次，统计学分析并绘制柱状图。
1.2.7 Transwell细胞侵袭实验用50mg/L Matrigel(1:5)稀释后，包被Transwell小室上室底部并风干，将饥饿24h的95-D和95-D-KD细胞常规消化离心后用无血清培养基重悬细胞，将细胞浓度调整为1×106个/ml，取细胞悬液100μl加入Transwell小室上室，24孔板下室加入500μl含血清培基，置于37℃孵箱常规培养20h后，取出小室，经淋洗、固定、染色后于显微镜下计数，每样本计数5个视野取平均值，实验重复3次，统计学分析并绘制柱状图。
1.2.8 数据处理及统计学分析实验数据用GraphPad Prism 5.0软件分析, 各组数据的统计学差异采用方差分析(Two-Way ANOVA)或t检验，P < 0.01为有显著统计学差异。
2 实验结果 2.1 sgRNA的设计和载体构建依据pre-miR-362基因序列，利用在线sgRNA设计软件，并分别在正义链的5′端添加CACC，反义链的5′端添加AAAC。设计合成了7条针对miR-362基因的sgRNA寡核苷酸链(表 1)。经退火后形成BbsI的黏性末端。将pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9载体经BbsI酶切回收后分别与7条sgRNA序列连接，经测序验证完成PX330-sgRNA载体初步构建。
为提高敲除细胞的筛选效率，我们构建了donor载体，拟通过同源重组将靶序列替换为标志序列(GFP和PU, the puromycin resistance gene)(图 1a)。该载体中GFP有助于利用流式分选阳性细胞，PU基因有利于筛选稳定发生同源重组的细胞，该载体中含有的LoxP位点有助于在Cre酶的作用下将筛选获得的稳定细胞中的标志序列切除。我们利用引物362-F-Xbal-F与362-F-BamHI-R和362-B-EcoR1-F与362-B-XhoI-R分别从95-D细胞的基因组中通过PCR技术扩增了pre-miR-362上下游各约800bp的基因序列(图 1b)，并将其分别连接至donor vector的XbaI和BamHI，以及EcoRI和XhoI酶切位点。转化至DH5α中，挑取单克隆，经测序验证完成Donor-362载体构建。
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| 图 1 利用CRISPR/Cas9系统构建miR-362敲除细胞系 Figure 1 Construction of miR-362 knockdown cell line by CRISPR/Cas9 technology (a) Schematic diagram of homologous recombined donor vector targeting miR-362 (b) Gel electrophoresis results of miR-362 after PCR amplification of pre-and post-arm of miR-362 (c) Detection of plasmids transfected with different CRISPR systems by T7E1 assay (d) MiR-362 expression levels in different clones (e) Fluorescence microscopy photographes of marker genes deleted by Cre techonology in 95-D-KD cells |
利用脂质体将构建的不同的px330-sgRNA载体转染至95-D细胞，72h后提取细胞基因组DNA，利用PCR方法扩增相应片段，通过T7E1 assay评介CRIPSR系统的剪切能力。结果显示：经T7 endonuclease I处理后，在sgRNA-3、sgRNA-5和sgRNA-7组中出现了两条带(图 1c)，提示sgRNA-3、sgRNA-5和sgRNA-7可引起靶点基因发生突变。选择sgRNA-7作为最终的打靶sgRNA。
2.3 建立稳定敲除pre-mir-362的95-D细胞株将PX330-MIR362-sgRNA7质粒和DONOR-362质粒共转染95-D细胞。为了减少DONOR-362载体随机整合至基因组的可能性，我们在转染1周后，用嘌呤霉素(0.5μg/ml)进行加压筛选。筛选1周后，利用流式细胞仪，根据GFP荧光信号将经嘌呤霉素加压筛选获得的阳性细胞分选至96孔板中(1细胞/孔)。经扩大培养后，我们在95-D敲除细胞中随机选取了10个克隆。分别提取细胞Total RNA，经miScript reverse kit反转录，通过实时定量PCR方法比较野生型95-D细胞和敲除型细胞中miR-362表达水平的差异。qRT-PCR结果显示(图 1d)，与野生型95-D细胞相比，在95-D-KO-GFP细胞的10个克隆中，除克隆2和克隆3以外，其余克隆株中miR-362的表达水平均显著低于对照细胞(P＜0.001)，表达水平降低到原来的1.29%~1.95%。表明通过CRISPR/Cas9系统成功获得了稳定敲除miR-362的95-D肺癌细胞株。因为所构建的DONOR载体中含有2个LoxP位点可用于去除发生同源重组的标志序列(GFP和PU)，我们通过体外转录获得了Cre重组酶mRNA，并将其转染到95-D-KD-GFP细胞的克隆8细胞中，以去除标志序列，最终获得了不含有GFP荧光的95-D-KD细胞(图 1e)。
2.4 95-D-KD细胞的基因序列特点分析为明确95-D-KD细胞的基因序列的特点，我们利用引物D362-F和引物D362-R通过PCR扩增了95-D-KD基因组中的相应片段，通过测序分析发现，与野生型pre-miR-362序列相比，95-D-KD细胞在第53位(T)和第54位(C)碱基间插入了长度为161bp的序列(图 2)。
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| 图 2 MiR-362敲除细胞系基因突变分析 Figure 2 Analysis of gene mutation in miR-362 knockdown cell line |
为了探讨miR-362的生物学功能，我们用transwell方法评价了野生型95-D和95-D-KD细胞在细胞运动方面的差异。如图 3所示，野生型95-D和敲除型95-D-KD细胞的迁移细胞数分别为132.7±3.2和62.3±6.1，侵袭细胞数分别为212.0±12.0和109.6±14.1。与野生型95-D细胞相比，95-D-KD细胞的迁移和侵袭能力分别下降了53.1%(P=0.000 6)和48.3% (P=0.000 2)。以上结果提示，敲除miR-362显著抑制了95-D细胞的迁移和侵袭能力，miR-362与细胞的运动能力密切相关。
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| 图 3 Transwell迁移和侵袭实验 Figure 3 Transwell migration and invasion experiments |
非编码RNA占据了人转录组的绝大部分，然而，其生物学功能尚不十分清楚。有证据表明非编码RNA在多种生物学活动中发挥着作用，如细胞周期、分化、死亡等，并且在肿瘤的发生发展中也起着重要的作用。目前对非编码RNA生物学功能的研究多采用过表达和RNAi等手段，但是，RNAi方法具有特异性差、效率不高、范围受限、作用时间有限等不足，影响了对分子功能的深入研究。而CRISPR/Cas9系统则可以从基因水平将靶基因彻底敲除，相比之下更具优势。
CRISPR/Cas9系统是目前常用的基因操作工具之一，该系统包括CRISPR相关核酸酶和单链向导RNA(single guide RNA，gRNA)[8]。CRISPR是一些相互间隔的短回文重复序列，常产生发卡结构，长度为21~48bp[9]，每个重复序列间存在外源性DNA靶点中与之结构相似的短重复序列，这决定了SRISPR系统的种类及靶基因的识别位点[10]。在DNA靶点内，每个典型间隔区与典型间隔相邻基序(protospacer adjacent motif，PAM)相邻[11]，常用的PAM包括NGG、NAG和NNGG[12]。Cas9核酸酶含有两个核酸酶结构域，HNH结构域和RuvC样结构域，可分别切割目标DNA链的一条单链[13]。CRISPR/Cas9发挥作用时，通过PAM序列使gRNA与靶位点识别，介导Cas9核酸酶与基因组稳定结合，引起靶位点切割，从而产生双链断裂，引起非同源末端连接(non-homologous end joining, NHEJ)或同源性定向修复(homology-directed repair, HDR)。CRISPR/Cas9系统可以同时对靶基因进行高效的基因敲除(knock-out)和基因敲入(knock-in)编辑。
成熟的microRNAs长度仅为约22nt，在实验中，我们以pre-miR-362作为模板设计建立CRISPR/Cas9系统，DNA测序结果表明CRISPR/Cas9系统作用后，在pre-miR-362第53位和第54位核苷酸间插入了长为161bp的碱基(图 2)，这可能影响了pre-miRNA的二级结构，进而影响了miR-362成熟的生物加工过程，最终导致miR-362表达的显著下调(图 1d)。
我们的实验结果进一步证明，利用携带有靶基因上下游同源臂基因的Donor载体，可有效的通过同源重组的方式提高基因敲除的效率。一方面，Donor载体中含有GFP和PU基因，GFP有助于利用流式细胞仪分选那些发生同源重组的单克隆细胞，有利于降低实验成本和细胞所受的压力；另一方面，由于Donor载体中携带有靶基因的同源臂基因，使得donor载体不易于结合到基因组中存在有脱靶效应(off-target)的位点，从而降低了CRISPR/Cas9的脱靶效应[14-15]，那些未发生同源重组的细胞在PU的压力筛选下得以清除，提高筛选效率。此外，在我们所采用的Donor载体中还含有两个LoxP位点，可在Cre酶的作用下切除miR-362敲除细胞中的标志序列(GFP和PU)，使细胞不再表达GFP，并对PU重新敏感，有助于再次细胞分选和筛选。
本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，成功构建了95-D-miR-362敲除细胞系，并用实时定量PCR方法检测了敲除效率。研究结果表明，本研究获得的敲除细胞系具有敲除效率高、效果稳定的优点，且敲除片段插入位点明确，最大限度的减少了对于肿瘤细胞其他重要生物学功能的影响，是用于研究miR-362功能的理想体外细胞模型。通过侵袭及迁移实验，证明了miR-362在促进肺癌细胞恶性行为中的作用，与其在其他多种肿瘤细胞中的研究结果一致。但miR-362促进肺癌侵袭转移的具体分子机制仍需深入研究。本研究构建的体外模型为研究miR-362在肿瘤发生发展中的作用机制提供了重要的细胞模型。
致谢 感谢第四军医大学细胞工程研究中心的全体科研人员。| [1] |
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