2017, Vol. 37文章信息
- 曾杰.
- ZENG Jie.
- 优质L-天冬酰胺酶的开发与应用及重组表达研究进展
- Development and Application of L-Asparaginase with Better Performance and Advances in Recombinant Expression
- 中国生物工程杂志, 2017, 37(11): 123-131
- China Biotechnology, 2017, 37(11): 123-131
- http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20171117
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文章历史
- 收稿日期: 2017-05-02
- 修回日期: 2017-07-21
白血病及淋巴瘤是最常见的造血系统恶性疾病，其中淋巴瘤的发生率约4%，是增长最迅速的恶性肿瘤之一。白血病的发病率约为十万分之四，每年新增约4万例白血病患者，其中40%是儿童，并以2~7岁儿童居多，且70%~80%为急性淋巴细胞白血病。其病因可能与病毒感染、家族遗传有关，室内及室外环境污染理化刺激也是重要的诱因。对白血病及淋巴瘤患者的有效治疗，成为中国乃至全球最重要的课题之一。L-天冬酰胺酶作为治疗急性淋巴细胞白血病及淋巴瘤的药物，其昂贵的价格限制了临床上的广泛运用。利用基因工程技术重组表达L-天冬酰胺酶，产量高，能够有效降低生产成本，促使价格更低廉的L-天冬酰胺酶出现。但市场上现存的L-天冬酰胺酶药物均存在多种副作用与不足，如过敏反应、免疫抑制、胰腺炎、神经毒性、肝炎、凝血障碍、产生抗体治疗失败等。开发副作用更低的优质L-天冬酰胺酶及对其进行适当修饰成为解决这些弊端行之有效的途径。同时，除了应用在临床治疗领域，L-天冬酰胺酶能够减少加热食物过程中L-天冬酰胺与还原性糖的美拉德反应产生的致癌物质丙烯酰胺，在食品工业领域同样具有广阔的应用前景。
1 L-天冬酰胺酶概述 1.1 L-天冬酰胺酶的历史1953年，Kidd[1]首次发现豚鼠血清能够抑制小鼠体内的淋巴瘤，1961年，Broome[2]第一个证实了豚鼠血清中的抗肿瘤活性成分为L-天冬酰胺酶，1964年，Mashburn和Wriston[3]发现大肠杆菌中的L-天冬酰胺酶(L-asparaginase, EC 3.5.1.1)具有抗肿瘤活性，从此开始了大肠杆菌L-天冬酰胺酶药物开发的研究。1978年，第一个被美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于治疗急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)的L-天冬酰胺酶药物造福癌症患者，现在已成为治疗儿童ALL联合化疗的重要化药组合。
1.2 L-天冬酰胺酶的性质大肠杆菌的L-天冬酰胺酶分为Ⅰ型与Ⅱ型，L-天冬酰胺酶Ⅰ(EC1，Km=5mmol/L)组成型表达于细胞质中，能够水解L-天冬酰胺(L-Asn)与L-谷氨酰胺(L-Gln)，但对L-Asn的亲和力低；L-天冬酰胺酶Ⅱ(EC2，Km=12.5μmol/L)在缺氧条件下诱导表达，分泌到周质空腔中，对L-Asn具有高特异的水解活性[4]。L-天冬酰胺酶Ⅱ由4个相同的亚基组成，每个亚基含有326个氨基酸，且只有四聚体才具有酶活性，分子质量为141kDa[5]。
1.3 L-天冬酰胺酶的抗肿瘤机制L-天冬酰胺酶Ⅱ可以用于治疗霍奇金病(Godgkin disease)、急性髓细胞白血病(acute myelocytic leukemia)、急性髓单核细胞性白血病(acute myelomonocytic leukemia)、慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia)、淋巴肉瘤(lymphosarcoma)、黑色素肉瘤(melanosarcoma)等[6]。其抗肿瘤的机制[7]是，肿瘤细胞如淋巴瘤自身不能合成L-天冬酰胺，它们的快速增殖依赖于外源的L-天冬酰胺，而人体自身细胞具有L-天冬酰胺合成酶，能够合成L-天冬酰胺满足正常代谢所需，L-天冬酰胺酶通过降解L-天冬酰胺而杀死肿瘤细胞。
1.4 L-天冬酰胺酶药物目前市场上的L-天冬酰胺酶有多个品牌(表 1)，但主要来源于Escherichia coli与Erwinia两种革兰氏阴性菌。大肠杆菌来源的L-天冬酰胺酶(E.coli ASNase)并不完美，因超敏反应与体内产生L-天冬酰胺酶抗体而治疗无效的比例高达60%[8]。欧文氏菌来源的L-天冬酰胺酶(erwinase)作为二线药物被FDA批准用于治疗对E.coli ASNase有超敏反应的ALL患者。
| Brand of Asparaginase | Origin | Corporation[8] |
| ELSPAR® | E.coli ASNase | Merck & Co, Inc.; Ovation Pharmaceuticals, USA |
| OncasparTM | polyethylene glycol [PEG]-E.coli ASNase | Enzon Pharmaceuticals Inc.; Sigma-Tau Pharmaceuticals, Inc., USA |
| CrasnitinTM | E.coli ASNase | Bayer, Germany |
| MedacTM | E.coli ASNase | Kyowa Hakko, Japan |
| Erwinase® | Erwinia chrysanthemi | Speywood Pharmaceuticals, Inc.; EUSA Pharma, UK |
| Kidrolase® | E.coli-asparaginase | EUSA Pharma, UK |
| Leunase® | E.coli ASNase | Sanofi-Aventis, France |
| Leucoginase | — | VHB Life Science Inc., India |
| Spectrila® | E.coli ASNase | Medac GmbH |
| Pegaspargase® | polyethylene glycol [PEG]-E.coli ASNase | Jiang Su Heng Rui Medicine Co. Ltd, China |
培门冬酶是聚乙二醇修饰的L-天冬酰胺酶([PEG]-E.coli ASNase)，具有免疫原性低、半衰期长的优点，现作为一线药物用于治疗产生E.coli ASNase抗体而治疗失败的ALL患者，其销售价格是E.coli ASNase的10倍以上，目前国内仅有江苏恒瑞医药股份有限公司生产。
1.5 L-天冬酰胺酶的来源L-天冬酰胺酶在大自然中来源十分广泛[6-7, 9]，例如细菌、放线菌、真菌、酵母、海藻、植物等，但是人没有。除了大肠埃希杆菌(Escherichia coli)产L-天冬酰胺酶以外，还有欧文氏菌如菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)、白菜软腐欧文氏菌(Erwinia aroideae)；芽孢杆菌如马铃薯芽孢杆菌(糖化菌)(Bacillus mesentericus)、多黏芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)；放线菌如海洋放线菌(Marine actinomycetes)、链霉菌(S treptomyces)；嗜热菌如嗜热水生菌(Thermus aquaticus)、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)等。产L-天冬酰胺酶的真菌有霉菌如黑曲霉(Aspergillus niger)、土曲霉(Aspergillus terreus)；酵母菌如酿酒酵母(Saccharomyces cervisiae )、多形毕赤氏酵母(Pichia polymorpha)。目前的研究热点致力于寻找具有更优性质的L-天冬酰胺酶，海洋微生物[9]及真菌有着巨大的开发潜力。
2 L-天冬酰胺酶的微生物发酵 2.1 大肠杆菌发酵最初的L-天冬酰胺酶药物在大肠杆菌中提取获得，在缺氧的条件下，且富含多种氨基酸的培养基中培养大肠杆菌，其L-天冬酰胺酶产量能够提高100~1 000倍[10]。经过深入研究发现大肠杆菌的L-天冬酰胺酶发酵受到两个因素的调控，其L-天冬酰胺酶Ⅱ基因(ansB基因)的启动子受到cAMP受体蛋白(cyclic AMP receptor protein，CRP蛋白)的正性调控与厌氧条件(FNR蛋白)的负性调控[11]。CRP蛋白又叫代谢激活蛋白(catabolite activator protein，CAP)，胞内低水平的葡萄糖导致cAMP升高，从而产生高水平的cAMP-CAP复合物，ansB基因的启动子-10区和-35区与大肠杆菌σ70 RNA聚合酶不能完美的结合，cAMP-CAP复合物结合ansB启动子区域的CAP结合位点，帮助σ70 RNA聚合酶与ansB启动子的结合，从而增强ansB基因的表达[12]。相反，葡萄糖能够显著抑制ansB基因的表达[10]。
2.2 真菌发酵细菌来源的酶通常能导致过敏反应而危及生命，而真菌来源的酶没有过敏反应的副作用[7]。利用低成本的农业原料进行固相发酵生产L-天冬酰胺酶的创新模式，不仅具有环境友好型的特点，还能解决现存药物过敏反应的副作用，是最近的研究热点。2013年，Varalakshmi和Raju[13]使用土曲霉(Aspergillus terreus)MTCC 1782以珍珠栗子粉(bajra seed flour)为单一农业原料成功进行了固相发酵生产L-天冬酰胺酶。在最佳发酵参数条件下[湿度70%，温度30℃，pH8.0，1.5% (m/V)葡萄糖为碳源，2%(m/V)硫酸铵为氮源，0.1% (m/V)硫酸镁]，获得最高产量273.3IU/gds(gram dry substrate)。2015年，Vijay和Raju[14]成功优化了农业原料如御谷(pearl millet)、龙爪稷(finger millet)、大豆、大麦、米糠等的混合比例，使用土曲霉MTCC 1782进行固相发酵96h，产量比单一农业原料提高2倍以上(306.13IU/gds)。
3 L-天冬酰胺酶的重组表达目前L-天冬酰胺酶的生产趋势已从微生物天然表达转为工程菌重组表达(表 2)，主要为以下三个表达系统。
| 文献报道 | 来源 | 信号肽 | 表达载体 | 宿主菌 | 发酵方式 | 产量 |
| Aghaeepoor等[17] | Escherichia coli | PelB | pET3a | BL21(DE3) | fed-batch | 130IU/ml |
| Khushoo等[15] | Escherichia coli | PelB | pET22b | BLR (DE3) | fed-batch | 870IU/ml(5.24g/L) |
| Wang Y等[41] | Escherichia coli AS1.357 | Native signal peptide | pBV220 | E.coli AS1.357 | NR | 228IU/ml |
| Upadhyay等[18] | Escherichia coli K-12 (JM109) | Without signal peptide | pET14b | BL21(DE3) | shake-flask | 118mg/L |
| Ghoshoon等[19] | Escherichia coli YG 002 | Native signal peptide | pET-15b | BL21(DE3) | shake-flask | 17.4IU/ml |
| Roth等[42] | Erwiniacarotovora | Native signal peptide | pET-30a | C43 (DE3) | fed-batch | 0.9g/L |
| Chityala等[27] | Pectobacterium carotovorum MTCC 1428 | Without signal peptide | pHT43 | Bacillus subtilis WB800N | shake-flask | 105IU/ml |
| Feng Y等[21] | Bacillus subtilis 168 | WapA signal peptide | pP43NMK | Bacillus subtilis WB600 | fed-batch (3L) | 407.6IU/ml(2.5g/L) |
| Meena等[28] | Nocardiopsis alba NIOT-VKMA08 | NR | pQE30 | E.coli M15 | shake-flask | 158IU/ml |
| Hong等[34] | Thermococcus kodakarensis KOD1 | Without signal peptide | pET-21a | BLR (DE3) | shake-flask | NR |
| Ferrara等[23]; Facchinetti等[24] | Saccharomycescer-evisiae (ASP3) | α-factor signal peptide | pPIC9 | Pichia pastoris | fed-batch (2L) | 85.6IU/ml |
| Costa等[25] | Saccharomyces cerevisiae BY4741(ASP1) | NR | pET15b | BL21 (DE3) | shake-flask | NR |
| One unit of enzyme activity(IU) was defined as the amount of an enzyme required to release 1 μmol of ammonia per min. NR: Not report | ||||||
3.1 大肠杆菌表达系统
大肠杆菌表达系统能够适应高密度发酵，培养成本低，表达产量高，生产周期短，因而得到广泛应用。影响重组蛋白表达产量的因素有宿主菌、信号肽、培养基组分等。
3.1.1 宿主菌的选择E.coli基因组上的ansB基因可能与重组表达载体上的ansB基因发生同源重组，影响E.coli基因组的稳定性及质粒的保有率。BLR(DE3)宿主菌的recA基因变异，降低了同源重组发生的频率，因而能够稳定串联重复序列，是表达L-天冬酰胺酶的理想宿主菌。Khushoo等[15]将E.coli的ansB基因克隆到pET22b，使用pelB信号肽，在BL21 (DE3)、BL21star (DE3)及BLR(DE3)宿主菌中重组表达，其中在BLR(DE3)宿主菌获得最高的分泌表达产量(30.67IU/ml)。通过Fed-batch发酵流加补料维持比生长速率0.3/h，在不同生长阶段(OD600=33、60、90、135)进行IPTG诱导，其中当OD600=90开始诱导，获得最高产量8.7×105IU/L(折合为5.24g/L)。
3.1.2 信号肽的选择大肠杆菌能以可溶性蛋白形式表达，定位于胞质或周质空腔中，并以泄露的机制分泌到细胞外[16]。这种分泌机制与蛋白质的分选信号肽有关，不同的信号肽，分泌效率不一样，蛋白质表达产量也不一样。在大肠杆菌中能够有效将重组蛋白分泌到胞外的信号肽有PelB、OmpA、StII等。E.coli的ansB基因含有天然的L-天冬酰胺酶信号序列，2011年，Aghaeepoor等[17]成功将ansB基因的天然信号序列换成了pelB信号序列进行重组表达，产量最高达130IU/ml。
大肠杆菌同样能以包涵体(inclusion bodies，IBs)形式表达，在胞质中积累。去掉ansB基因的天然信号肽序列，则以包涵体形式表达。包涵体具有抗蛋白酶、对宿主毒性小、容易富集纯化等优点，但是包涵体的正确折叠复性是一个具有挑战性的课题。2014年，Upadhyay等[18]成功以包涵体形式重组表达L-天冬酰胺酶。采用脉冲稀释方法(pulsatile dilution method)将含有4mol/L尿素的裂解液在0.5mol/L尿素(含0.1mol/L盐酸胍)的复性液中重新折叠成有活性的四聚体，复性回收率达50%。
3.1.3 培养基组分的优化2015年，Ghoshoon等[19]成功利用响应面分析(response surface methodology，RSM)建立了培养基组分与产量的模型，采用最优的培养基组分(7.75g/L胰蛋白胨，5.25g蛋白胨，9g/L酵母粉，0.6g/L氯化钙)，在BL21(DE3)宿主菌中重组表达，摇瓶表达水平的产量最高达17 386IU/L，与该模型的预测值只有1.7%的差异，为今后利用DoE理念优化发酵工艺参数提供参考意义。
3.2 枯草芽孢杆菌表达系统枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是革兰氏阳性菌，主要用于食品工业，是当今工业酶生产应用最广泛的菌种之一。枯草芽孢杆菌表达系统具有诸多的优点。例如，它是非病原菌，相对大肠杆菌表达系统而言，具有强大的蛋白质分泌能力，分泌到胞外的蛋白质易于纯化[20]。2017年，Feng等[21]将Bacillus subtilis 168的L-天冬酰胺酶Ⅱ基因克隆到带有p43强启动子的表达载体pP43NMK中，成功在Bacillus subtilis WB600宿主菌中重组表达，通过多个组合策略提高L-天冬酰胺酶产量。例如，从8个信号肽中筛选出能获得最高产量的wapA信号肽，通过点突变PCR改造P43进一步增强启动子，去掉L-天冬酰胺酶N端25个氨基酸残基使产量在原有基础上翻倍。综合上述策略，在3L生物反应器中采用批次流加补料策略发酵，获得产量407.6IU/ml(折合2.5g/L)，这是在食品级宿主菌中获得的前所未有的最高L-天冬酰胺酶产量，对L-天冬酰胺酶在食品工业方面的应用带来新的突破。通过进一步研究，Bacillus subtilis 168的L-天冬酰胺酶在65℃具有最高酶活性，Km为5.29mmol/L，Kcat为54.4/s。
3.3 毕赤酵母表达系统巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统能对蛋白质进行加工、折叠、翻译后修饰，适应高密度发酵，产量高，产品易于纯化，选择在毕赤酵母中重组表达真菌来源的L-天冬酰胺酶是一个不错的选择。细菌来源的L-天冬酰胺酶所具有的谷氨酰胺酶活性与脲酶活性是导致副作用的根源，而且还可能导致过敏反应而危及生命，而真菌来源的酶一般很少有过敏反应的副作用[7, 22]。市场上的L-天冬酰胺酶主要来源于细菌，均具有严重的免疫原性反应、免疫抑制、超敏反应、血栓及出血等副作用。
酿酒酵母中的ASP3基因编码的L-天冬酰胺酶Ⅱ是一个潜在的替代药物，为了克服酿酒酵母中L-天冬酰胺酶Ⅱ的产量限制，Ferrara等[23]利用Pichia pastoris成功重组表达ASP3基因编码的L-天冬酰胺酶Ⅱ，产量达到800IU/g，是酿酒酵母产量的7倍。通过高密度发酵，产量提高到85 600IU/L，提高了100倍。2016年，Facchinetti等[24]同样在毕赤酵母中成功重组表达了ASP3基因，并对酿酒酵母的L-天冬酰胺酶Ⅱ的结构及功能进行了深入研究。该蛋白质含有大量的α螺旋，在β折叠的贡献下，使其能在45℃高温及宽泛的pH(6~10)条件下保持稳定。酶活性最佳条件为46℃，pH7.2，在人体生理温度37℃放置30min，仍保留有92%的酶活性，并在体外实验中表现出了对白血病细胞系K562的抗肿瘤活性。同时，2016年，Costa等[25]也研究了酿酒酵母的ASP1基因，并成功在BL21(DE3)中重组表达，揭示了负责催化功能的4个氨基酸为T64-Y78-T141-K215。其酶比活为196.2IU/mg，并对谷氨酰胺具有低酶活性，酶比活为(0.4±0.02)IU/mg。在体外实验中，对淋巴细胞系MOLT-4具有抗肿瘤活性。
4 无谷氨酰胺酶活性的L-天冬酰胺酶重组表达L-天冬酰胺酶具备的低谷氨酰胺酶活性是其产生毒副作用的根源，如神经毒性、肝炎、凝血障碍等[26]，因此，迫切需要寻找无谷氨酰胺酶活性的L-天冬酰胺酶来源(表 3)。
| 文献报道 | 来源 | 特点 | 酶比活(IU/mg) |
| Pourhossein和Korbekandi[26] | Erwinia carotovora NCYC 1526 | decreased glutaminase activity | 430 |
| Nagarajan等[30] | Alternaria sp. | free of glutaminase | 1.65 |
| Chityala等[27] | Pectobacterium carotovorum MTCC 1428 | free of glutaminase | 101 |
| Meena等[28] | Nocardiopsis alba NIOT-VKMA08 | free of glutaminase | 60.26 |
| Lee等[29] | Mesoflavibacter | free of glutaminase | 687.1 |
| Doriya等[22] | Aspergillus sp. | free of glutaminase and urease | 64.85 |
4.1 细菌来源
胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora NCYC 1526)的L-天冬酰胺酶(ErA)具有更低的谷氨酰胺酶活性，其在临床上可能具有更小的副作用。2014年，Pourhossein等[26]在BL21(DE3)中重组表达ErA，测得酶比活为430IU/mg。胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)MTCC 1428的L-天冬酰胺酶无谷氨酰胺酶活性。2015年，Chityala等[27]将该酶在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis WB800N)中进行了重组表达，表达载体为pHT43。通过单因子(one factor at a time strategy, OFAT)方法获得最佳表达条件，摇瓶表达产量最高达105IU/ml，酶比活为101IU/mg。通过分子模型分析，60位甘氨酸、=119位甘氨酸、252位丙氨酸是该酶的活性位点。来自拟诺卡氏菌(Nocardiopsis alba NIOT-VKMA08)的L-天冬酰胺酶也无谷氨酰胺酶活性。2016年，Meena等[28]在大肠杆菌E.coli M15(pREP4)中重组表达该酶。重组表达产量为158.1IU/ml，酶比活为60.26IU/mg，在37℃，pH8.0显示最佳酶活性。2016年，Lee等[29]发现了酶比活更高的无谷氨酰胺酶活性的L-天冬酰胺酶。来自中温黄杆菌(Mesoflavibacter)的L-天冬酰胺酶(L-ASPG86)有344个氨基酸，与大肠埃希氏杆菌和假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)的Ⅰ型L-天冬酰胺酶同源，但是L-ASPG86无谷氨酰胺酶活性。在BL21(DE3)中重组表达L-ASPG86，5mmol/L锰离子与镁离子能够使酶活分别提高3.97倍和3.35倍。在最佳条件下(37℃、pH9、5mmol/L MnSO4)，酶比活为687.1 IU/mg，是E.coli-ASNase的2倍多。
4.2 真菌来源2014年，Nagarajan等[30]首次报道了从植物中筛选得到的内生真菌(Alternaria sp.)产的L-天冬酰胺酶无谷氨酰胺酶活性，酶比活为1.65IU/mg。2016年，Doriya和Kumar[22]成功筛选出无谷氨酰胺酶活性且无脲酶活性的产L-天冬酰胺酶菌株。通过平板培养法对真菌的表型进行筛选，在以L-Gln或尿素作为唯一氮源的改良察氏培养基(modified czapek-dox, MCD)中添加酚红或溴麝香草酚蓝(BTB)，通过培养平板颜色变化判断有无谷氨酰胺酶活性与脲酶活性。从45个真菌中筛选出4株不含有上述两种酶活性的L-天冬酰胺酶，其中C7菌株的产量最高(33.59IU/ml)，酶比活为64.85IU/mg，并从形态学上鉴定该C7菌株为曲霉(Aspergillus sp.)。
5 耐高温L-天冬酰胺酶的重组表达L-天冬酰胺与还原性糖在加热的条件下发生美拉德(Maillard)反应产生致癌物质丙烯酰胺(acrylamide)，L-天冬酰胺酶能够减少美拉德反应产生的致癌物质丙烯酰胺，又不影响到美拉德反应赋予美食的色香味[31-32]。L-天冬酰胺酶在食品工业具有广阔的应用前景。例如，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis B11-06)的L-天冬酰胺酶耐高温度，在油炸土豆工艺中减少丙烯酰胺的形成具有潜在的工业应用价值。2013年，Jia等[33]将其L-天冬酰胺酶基因克隆到pMA5载体中，在Bacillus subtilis 168宿主菌中重组表达，产量远高于Bacillus subtilis B11-06，达到9.98IU/ml。进一步研究该酶的性质，酶活最佳条件为40℃，pH7.5，Km为0.43mmol/L，Vmax为77.51μmol/(L·min)。2014年，Hong等[34]对另一种耐高温的L-天冬酰胺酶进行了深入研究，在BLR(DE3)中重组表达噬热古细菌(Thermococcus kodakarensis KOD1)的L-天冬酰胺酶，其最佳酶活性条件为90℃、pH8.0，酶促反应动力学参数Km为2.6mmol/L，Kcat为694/s。其中，二价铜离子与二价镍离子能有效抑制该酶活性。酶比活高达978.7IU/mg，在90℃条件下32h，仍有90%的酶活性，这种特征，使其在食品工业领域具有广阔的应用前景。2014年，Huang等[35]发现酶比活更高的耐高温L-天冬酰胺酶，在E.coli中重组表达黑根毛霉(Rhizomucor miehei)的L-天冬酰胺酶(RmAsnase)，其酶比活高达1 985IU/mg，最佳酶活性条件为45℃、pH7.0。此外，RmAsnase具有很低的谷氨酰胺酶活性，且能促进凝集素(lectin)诱导的白血病细胞K562细胞凋亡，在食品工业方面的应用及白血病的治疗中具有广阔的前景。
6 L-天冬酰胺酶治疗的其他改进 6.1 L-天冬酰胺酶免疫抑制及胰腺炎副作用的克服2011年，欧文氏菌来源的L-天冬酰胺酶Erwinase作为二线药物被FDA批准用于治疗对大肠杆菌来源的L-天冬酰胺酶有超敏反应的ALL患者。而Erwinase会带来严重的免疫抑制副作用，限制了它在临床上的应用。激活巨噬细胞的自噬能够克服Erwinase带来了免疫抑制副作用[36]，这一发现给临床治疗上带来的新的方向。2017年，Sakaguchi等[37]通过统计发生L-天冬酰胺酶引起的急性胰腺炎患者接受奥曲肽(octreotide)治疗的情况，发现奥曲肽具有预防L-天冬酰胺酶引起的严重胰腺炎的作用，为L-天冬酰胺酶的临床治疗提供了多药组合联合治疗的新方案。
6.2 L-天冬酰胺酶纳米粒子静脉注射L-天冬酰胺酶存在一些副作用，以纳米粒子作为L-天冬酰胺酶载体的纳米级颗粒药物是一种新型的药物载体输送系统，能够增加生物膜的透过性，增强药效，降低药物毒性，改变药物在体内的分布，提高生物利用度。2014年，Bahreini等[38]将ansB基因克隆到pAED4表达载体中，在BL21pLysS (DE3)中重组表达，将表达产物L-天冬酰胺酶与壳聚糖(chitosan)连接制成纳米颗粒药物，大小为(340±12)nm，其在体内具有更长的半衰期。2015年，Baskar等[39]将土曲霉(Aspergillus terreus)产的L-天冬酰胺酶与氧化锌交联制备成纳米颗粒复合物，扫描电镜观察为28~63nm，将该纳米颗粒复合物对人乳腺癌细胞系MCF-7进行处理，MTT法测试发现细胞存活率下降至35.02%，显示了氧化锌交联的L-天冬酰胺酶纳米颗粒复合物具有良好的抗肿瘤活性。
6.3 L-天冬酰胺酶的微生物治疗2015年，Kim等[40]将鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)进行基因改造，在诱导型启动子araBAD控制下选择性的在实体肿瘤中重组表达L-天冬酰胺酶。动物试验表明，用该菌作为抗肿瘤药物的载体，在肿瘤组织的微环境中具有高效的选择性与抗肿瘤作用。
7 结语和展望天然L-天冬酰胺酶的生物发酵已不能满足市场的需求，重组L-天冬酰胺酶已是大势所趋。大肠杆菌表达系统及毕赤酵母表达系统是L-天冬酰胺酶重组表达最常见的两个表达系统，分别重组表达细菌及真菌来源的L-天冬酰胺酶。经过近些年的研究优化，在产量方面已经不是限制因素。大肠杆菌表达系统常与pET表达载体系统配合，本实验室利用该系统重组表达L-天冬酰胺酶的产量能够达到5g/L以上；毕赤酵母表达系统常与甲醇诱导型表达载体配合，可实现高产量的分泌表达。虽然攻克了产量的限制，但现存的L-天冬酰胺酶药物仍存在诸多副作用与不足而影响其治疗效果，如过敏反应、免疫抑制、胰腺炎、神经毒性、肝炎、凝血障碍、产生抗体治疗失败等。
本文首次综述了近些年最新报道的副作用更低的天冬酰胺酶候选药物，为Me-Better类创新药物的开发提供参考价值，有望打破长期以来昂贵的进口天冬酰胺酶药物的垄断地位。通过本文对近几年研究成果的综述，从以下4个方面可有效改善上述弊端：(1)细菌来源的L-天冬酰胺酶往往能够发生危机生命的过敏反应，而真菌来源的L-天冬酰胺酶是减少过敏反应发生的潜在替代药物。(2)L-天冬酰胺酶所具有的低谷氨酰胺酶活性及脲酶活性是其产生副作用的根源，寻找及开发无谷氨酰胺酶活性及脲酶活性的新来源L-天冬酰胺酶成为行之有效的解决途径。(3)对L-天冬酰胺酶进行修饰，并制备成纳米级颗粒药物，作为一种新型的药物载体输送系统，具有增加生物膜的透过性、增强药效、降低药物毒性、提高生物利用度等优点。(4)对微生物进行基因工程改造，以受控的诱导表达方式在局部实体瘤中重组表达L-天冬酰胺酶发挥抗肿瘤作用，具有选择性抗肿瘤的优点。
结构决定功能。通过对天冬酰胺酶结构的研究(如氨基酸的截短、突变等)而获得更优质的天冬酰胺酶变体，仍是一个空白领域。副作用更低的天然天冬酰胺酶并不一定完美，需要通过结构改造进行优化，这是今后的研究难点与方向。
L-天冬酰胺酶的应用并不局限在临床治疗领域，因其能够减少加热食物过程中L-天冬酰胺与还原性糖的美拉德反应产生的致癌物质丙烯酰胺，在食品工业方面具有广阔的应用前景。已成功在非病原的枯草芽孢杆菌表达系统中进行重组表达，对耐高温、高酶活性的优质L-天冬酰胺酶已有部分研究，但是重组表达的工业化生产及其使用效果仍有待食品工业化应用的检验。
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