蚊虫是传播许多动物虫媒病毒的生物传播媒介，由蚊传播的动物虫媒病又称为动物蚊媒病^[1]。虫媒病毒是世界范围内引起人畜共患病的重要病原，主要通过吸血节肢动物(蚊、蜱、蠓和白蛉等)叮咬敏感的脊椎动物而传播。蚊作为最重要的媒介生物，可携带多种病毒性病原体。目前，已证实有300余种蚊可以传播病毒，而每一种蚊又可携带和传播多种病毒，如西尼罗病毒、登革热病毒、裂谷热病毒、辛德毕斯病毒等，并且近些年不断发现一些不常见的新病毒。

我国国境线边境地区媒介生物种类繁多，分布情况复杂，而相关监测与控制水平与防疫要求存在较大差距。我国面临多种重要媒介传播外来动物疫病入侵的威胁，尤其是我国虫媒密度分布较高的云南、广西、福建，以及国境线较长的新疆、黑龙江等省份。

随着国际贸易、旅游业及交通运输的发展，蚊媒病毒已成为国际社会关注的热点公共卫生问题。我国幅员辽阔、自然环境复杂多样，自然疫源地分布广泛，且存在病原体复合感染，因此可能还有很多潜在的蚊传病原体未被鉴定。本文通过高通量测序技术针对不同边境口岸地区蚊所携带的病毒基因序列进行鉴定、分类，建立口岸蚊媒病的新型监测方法，了解蚊体内携带的未知和已知病毒，不但可以丰富病毒基因组数据库，对防止和控制新发传染病也具有重要意义。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 主要试剂

QIAamp^® Viral RNA Mini Handbook购自德国Qiagen公司；Ion Total RNA-Seq Kit v2购自美国Thermo Fisher Scientific公司；2100芯片购于美国Agilent Technologies公司；Ion OneTouch 200 Template Kit v2 DL，Ion Sphere Quality Control Kit，Ion S5 Sequencing Kit均购于美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.1.2 主要仪器

Qubit 2.0 fluorometer购于美国Thermo Fisher Scientific公司；Agilent 2100 Bioanalyzer购自美国Agilent Technologies公司；Ion OneTouch 2，Ion OneTouch ES，Ion S5 XL测序仪，真空浓缩仪SpeedVac DNA购于美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 蚊虫样品信息

蚊虫样品为2015~2016年分别采自云南、广东、新疆阿拉山口和广西的田间样品，用液氮冷冻保存，或用样品保存液保存，每组100~150只。根据成蚊外部形态特征进行种类的鉴定，同时提取基因组DNA，应用PCR法进行分子生物学鉴定。具体信息见表 1。

1.2.2 蚊虫总RNA的提取

将样品分别用液氮冷冻，取出研磨成粉末后，加入1ml 1×PBS缓冲液混匀、离心，取上清液按照QIAamp^® Viral RNA Mini Handbook试剂盒说明书进行总RNA的提取。具体步骤如下：向140μl上清液中加入560μl Buffer AVL(包括carrier RNA)，涡旋混匀后，于室温孵育10min；加入560μl无水乙醇，涡旋混匀；将上述液体8 000r/min离心1min，弃滤液；加入500μl Buffer AW1，8 000r/min离心1min，弃滤液；加入500μl Buffer AW2，14 000r/min离心3min，弃滤液；加入50μl Buffer AVE，室温孵育1min后离心，将得到的RNA样品于－80℃保存备用。

1.2.3 Ion S5 XL测序

分别取10μl蚊虫样本的RNA使用Ion Total RNA-Seq Kit v2试剂盒(购自美国Thermo Fisher Scientific公司)进行RNA建库。用Aglient 2100 BIoanalyzer2100鉴定库的片段大小和质量。RNA库构建成功后，制备并富集模板，用Ion Torrent S5 XL测序仪进行上机测序。

1.2.4 生物信息学分析

上机测序后经测序仪自动运行得到fastq.gz格式的测序数据，对fastq.gz格式的测序序列进行解压、过滤低质量序列和过短序列以及错误序列等处理。先去除了宿主(蚊)的基因组，把过滤后剩余的序列使用BLAST+ v2.2.31软件包^[2]比对美国国家生物信息中心(NCBI)的核酸序列数据库(nt库)，发现可疑病毒。

2 结果

所有待研究样本提取核酸后，经Ion Torrent S5高通量测序仪进行高通量测序。本研究中共有6个待研究样本，用1~6的数据分别编号。高通量测序数据产出量符合进一步分析要求，具体产出数据详见表 2。

将6个样本的高通量测序数据使用BLAST+ v2.2.31软件包与NCBI中对应宿主蚊的基因组比对，以去除测序结果中的宿主序列。将过滤宿主后的序列与核酸序列数据库比对，进行结果的数据统计，其中重点统计6个样本里比对到相应病毒种属的reads数及总长度，统计结果如表 3所示。在样本1中，发现两种不同亚型的Wuhan Mosquito Virus和一种Culex tritaeniorhynchus rhabdovirus；在样本2中，发现Wuhan Mosquito Virus、Culex tritaeniorhynchus rhabdovirus和Mosquito densovirus BR/07三种病毒；在样本3中，发现多种病毒，如Goose dicistrovirus、Empeyrat virus和Wuhan Mosquito Virus等；在样本4中，未发现可疑的病毒；在样本5中，发现两种不同亚型的Wuhan Mosquito Virus；在样本6中，未发现可疑的病毒。在6个样本中，有4个样本发现2种及2种以上的可疑病毒，其中Culex tritaeniorhynchus rhabdovirus(CTRV)是一种属于Mononegavirales目，Rhabdovirus科的病毒，分离于三带喙库蚊^[3]。

为了分析检测到的各种病毒与其他病毒的进化关系，我们对测序得到的序列进行系统发育树构建。在上文发现的病毒中，CTRV、Wuhan Mosquito Virus 2、Wuhan Mosquito Virus 8、Goose dicistrovirus、Empeyrat virus、Kilifi Virus、Pow Burn virus和Soudat virus等12种病毒在数据库中的有意义的同源性序列结果少于2个，以上物种的系统发育树无意义。

Mosquito densovirus属于Brevidensovirus科，该科有87个已知的病毒，挑选本研究测序得到的最长序列做进化树，结果见图 1。

3 讨论

蚊虫是动物蚊媒疾病传播的媒介，不仅会叮人吸血，影响人们的正常生活，而且蚊媒疾病可以传播疾病，从而导致世界范围内的重大健康问题。全世界已发现的蚊虫约3 000种, 而我国已发现蚊类近400种^[4-6]。处于不同生活环境中的人和动物，会暴露在不同的蚊媒疾病中，而其中一些蚊媒疾病可能会成为新发传染病。在这种情势下，加强国境口岸的蚊虫监测和检测工作，及时发现蚊虫体内所携带的蚊媒病毒病原体，对于建立科学有效的蚊媒疾病预防控制措施具有重要意义。

高通量测序技术也称为大规模平行测序(massively parallel signature sequencing, MPSS)^[7]，可以一次并行对几十至几百万条短序列片段进行测定，不需要依赖细胞培养等技术，灵敏度高且不依赖已知序列，短时间就可以获得大量有效的数据，对于快速检测样本中的病原体具有重要意义。

本研究通过高通量测序技术对来自不同地区的蚊虫样本所携带的病毒基因序列进行鉴定和分类，初步描绘了蚊类所携带病毒的多样性。这6个样本分别来自云南、广东、新疆和广西口岸，在6个混合样本的研究结果中可以看到，有4个混合样本检测到2种及2种以上的可疑病毒，该分析结果提示测序样本中可能存在该病毒，该检测结果对于预防未知新发传染病病毒的感染具有一定的提示作用。其中在云南和广西口岸的三带喙库蚊中发现的CTRV，与前人报道的一致，它是一种特殊的RNA病毒，在宿主中建立非溶细胞性持续感染宿主细胞核。CTRV在宿主细胞核中复制时，宿主细胞没有任何细胞病变的影响^{[3, 8-9]}。该结果提示，相应的样本中可能存在该病毒。该研究结果对于发现蚊虫体内携带的未知和已知病毒，建立科学有效的蚊媒疾病预防控制措施具有重要意义。