转基因植物的首次获得源于1983年在烟草中的研究^[1]，从此植物转基因技术飞速发展，日渐成熟。通过转基因技术操作，研究者可以对植物的合成代谢途径进行研究和调控，最终得到如耐寒、耐旱、优质高产的性状改良作物。在过去的30年里，植物基因转化在很多重要的粮食作物中得到广泛应用并取得不错成果，但由于技术有限，研究对象仅局限于单个基因^[2]。植物的大多农艺性状是由多基因调控，在初级和次级代谢中许多复杂有机化合物的合成也是如此^[2]。因此，协调控制多个基因的共同表达是目前生物工程的一个重要挑战^[3]，也是基因工程的发展方向^[4]。

1 基因协调表达策略

在早些年的植物生物技术研究中，转基因实验一般涉及两种基因：“原发性转基因”或称“目的基因”，它可以受任一启动子的控制，并以特定方式改变植物表型；另一种是组成型启动子控制下的标记基因^[5]。基因的选择策略主要有以下四种：(1) 提高靶途径限速步骤中的关键酶活性，例如超表达反馈抑制途径中释放的酶；(2) 超表达催化上游途径的酶，提高前体物质的含量以增加目标产物量；(3) 通过基因沉默，阻断分支途径，防止产物损失；(4) 增强目标产物的储存，增加积累量^[6]。这四个方面也为多基因转化时不同基因的多样选择提供理论基础。多基因调控作为一种可以培育含有更多优良性状植物的方法已得到人们的重视^[7]。因此，需要找到更合适的方法使得多个基因协调表达^[8]。

2 传统多基因转化方法 2.1 杂交与连续转化

在转基因早期，多个基因可以通过反复转化在植物体中进行堆叠，主要方法有多个转单基因作物间的杂交^[9]，或者用其他标记的目的基因对转基因植株进行多次转化^[10-11]。这两种方法操作简单，曾在多种作物育种中得到广泛应用。但同时它们存在费时繁琐且后代性状容易发生分离的问题。杂交要得到稳定的纯合子需2~3代，若要共表达多个基因，则需时间更久。连续转化每次引入的基因需要带有不同的筛选标记，后代需要进行筛选标记的剔除。因此，这两种方法只适用少数基因的转入。

2.2 共转化方法

共转化是将多个基因同时转入到植物中表达，应用较多的有两种方法：一种是将多个基因构建于同一个质粒中；另一种是将不同基因构建到不同质粒的T-DNA区域。将外源基因分别构建到不同载体或同一载体的不同区段，再将多种载体同时转入同一受体细胞，筛选出共转化植株。这两种方法可以同时用于植物转基因的导入，主要通过农杆菌介导的转化或直接DNA转移。

2.2.1 农杆菌介导的转化

农杆菌介导的转化需要借助标准双元载体，通过在大肠杆菌中有效复制得到优化，并促进亚克隆^[2]。农杆菌转化可以使多个基因包含于一个T-DNA中，或者多个T-DNA分别包含单个不同基因。恶性疟原虫分泌的青蒿素可用来治疗疟疾，Farhi等^[12]通过转基因工程，使得含有5个基因的载体通过农杆菌介导转入烟草用于生产青蒿素。所得的转基因植物每克干重可产生26~72ng青蒿素前体物质紫穗槐-4, 11-二烯。

由于标准载体的承载上限约为50kb，随着转入基因数目的增加，标准载体会变得不稳定且会自发选择性不表达一些基因^[13-14]，而且能在特定位点切割的限制性内切酶也越来越难以发现。因此，这种方法仅对于少数基因的转入是有效的。为打破标准载体的承载限制，研究者在此基础上改进，得到了高容量双元载体。

细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome, BAC)是一种能够整合大片段DNA的高容量载体系统。将它们与根癌农杆菌的Ri复制子与T-DNA的边界结合，产生嵌合双元载体-双元细菌人工染色体(binary bacterial artificial chromosome, BIBAC)。通过对P1人工染色体PAC的改造，得到构建可转化人工染色体(transformation-competent artificial chromosome, TAC)。这些高容量的双元载体承载量可达到200kb。

Lin等^[15]在2003年将一种特异性重组酶Cre加入重组系统，用不断特异性重组代替了传统的酶切连接，解决了酶切位点不足的问题。随后，Ma^[16]又整合了Gateway技术，使得目的基因可直接与重组系统中的供体载体按顺序结合，通过不断重组来整合外源基因。Buntru等^[17]运用该方法将7个基因成功导入植物基因组，是一种较为实用的转化方法。

2.2.2 直接DNA转化

直接DNA转化法借助普通载体，使多个基因通过一个DNA片段或者多个不同质粒同时转入。对于多数量的转基因，不受载体承载限制的直接DNA转移法更有优势。含独立载体的直接DNA转移，转入的基因会在单一位点进行整合^[18]，且一旦连接并整合到植物的基因组中，后代不会发生分离^[19]。目前，直接DNA转化可生成携带多达15种不同基因的转基因植物^[7]。而当我们需要转入更多基因时，基因枪法为实现这一目标提供了可能。

1998年，Chen等^[20]，将含有不同标记基因的13个独立质粒通过基因枪法成功改造水稻(Oryza sativa)植物。基因枪法(particle bombardment)是将携带外源DNA的金粉或钨粉高速射入细胞，使得目的细胞的染色体可以与外源DNA融合。后来也通过基因枪法将9个基因转入水稻，并发现56%的植物携带7个或更多个基因^[19]。与单个基因的整合频率相比，这一比例远远高于预期。且一个转基因的导入可促使更多的DNA在同一位点整合^[21]。

基因枪法不受受体类型限制，只要具有再生能力，任何组织细胞均可作为受体选择^[22-23]。另外，基因枪法可同时转入大量质粒，在进行多基因转化时省时方便。但基因枪的成本较高，基因在不同质粒中的表达及每个基因的整合效果还无法确定，其应用因此受到一定限制。

2002年，Sone等^[24]发明了一种微珠介导转化法，该方法以海藻酸钙为主要材料，被称为生物活珠法。在转基因初期，直接DNA转化植物因各种外界条件限制，转化效率一直较低。海藻酸钠和有机溶剂按比例加入到含钙离子的溶剂时，会形成可以将外源DNA包被起来的微珠，在聚乙二醇的作用下，将外源DNA直接转入植物原生质体中。在后续改造过程中，研究者建立了一种可制造统一大小的生物活性珠方法，使高达200kb的DNA片段转入植物体中，操作简便可大批量应用^[1]。不过，此方法中原生质体的再生效率较低，使得转基因效率并不高。且此方法与粒子轰击，即基因枪技术不兼容，使其并未得到进一步研究。

2.3 新兴共转化方法

2.3.1 植物人工染色体法

植物人工染色体是通过对微小染色体的修饰而创造出的一种新兴植物转化方法。主要有两种思路，一种是以染色体功能单元为基础进行的自下而上的组装；一种是对自身染色体进行的自上而下的修饰^[25]。前者通过粒子轰击的方式将质粒转入玉米的胚胎组织中，形成了微小染色体，并稳定遗传到第四代^[26]。后者通过将含有拟南芥中端粒重复序列的载体转入玉米，得到了玉米微小染色体并成功整合到染色体中。

植物人工染色体可转入大量基因，甚至高达200Mb，拥有转入数十甚至数百基因的潜力^[7]。但该方法目前还处于起步阶段，除玉米外的其他植物中的应用还有待进一步研究。

2.3.2 操纵子多顺反子调控

将多个基因串联在同一开放阅读框(open reading frame, ORF)中协同表达多顺反子mRNA是一种有效的共转化方法，通过启动子串联表达聚合蛋白，可以协调控制多个基因。此方法参与的质体改造已用于在烟草中生产虾青素。虾青素是由β-胡萝卜素酮化酶和β-胡萝卜素羟化酶表达形成的^[27]。Lössl^[28]使用T7g10启动子，通过表达真氧产碱杆菌的phbC-phbB-phbA基因来生成杆菌质聚羟基丁酸(PHB)。

但是通过多顺反子调控的方法目前仅适用线粒体中基因的表达，且仅在模式植物如烟草中得到应用，还不适用于谷类作物等其他作物。

3 基因融合方法

传统转化方法中双元载体及相同的启动子的使用可能促使转基因沉默^[29]。这可能由于潜在二级结构的出现会发生反式相互作用从而促进甲基化，或启动子的内在活性会产生足够的mRNA以促进细胞的多聚腺苷酸化机制，产生发夹RNA。目前，基于多顺反子载体的基因融合技术快速发展，为解决这一问题提供了帮助。

3.1 内部核糖体进入位点(internal ribosomal entry sites, IRESs)策略

IRESs是从mRNA内部聚集核糖体进行翻译，一个转录单位翻译表达多个非偶联蛋白，是一种存在于核酸病毒中的翻译模式^[30-31]。真核生物mRNA的5′端含有m7GpppN帽子结构来启动转录，通常为单顺反子结构^[1]，而IRESs不依赖于帽子结构，是一种新型多顺反子构建方法。该方法克服了融合蛋白表达活性低的问题，在蛋白酶策略中也不需准确的蛋白定位^[32]。然而，源于病毒的IRESs本身约含有500个核苷酸，对于有限容量的载体并不实用。同时，由IRESs介导的表达其实效率很低，上下游蛋白表达不稳定。因此，IRESs策略在植物多基因转化中并未得到广泛应用。

3.2 核内涵体蛋白a (nuclear inclusion body a, NIa)

NIa蛋白酶系统源自马铃薯Y属(potyvirus)病毒，包含一段NIa蛋白酶序列和位于两端的由蛋白酶特异识别的7肽序列，外源基因可由这段DNA序列连接。NIa蛋白酶能够以顺反两种方式识别特异性的7个蛋白切割位点，把融合蛋白切成独立的两部分行使功能^[33]。von Bodman等在烟草中转化NIa蛋白酶系统构建的mas2ONOmas1融合蛋白基因表达载体, 发现在转基因烟草细胞中检测到了这些基因编码的酶所作用的产物，表明NIa蛋白酶确实正确地切割融合基因表达的多肽并显示各自的活性^[17]。最近研究表明，芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus, TuMV)的NIa蛋白酶还能促进蚜虫对病毒的传播^[34]。NIa蛋白酶宿主具有专一性，可以参与病毒复制等过程，在植物防御过程中有着重要作用。但NIa蛋白系统的表达量偏低且有滞后作用，蛋白剪切不完全，积累在细胞内部。另外，NIa蛋白酶会进行信号定位于细胞核，也使其功能受到限制。

3.3 LP4/2A连接肽

肽链连接器可使多个基因在单个ORF内由一个启动子控制，从而促进多基因的转化。来自于手足口病病毒的2A序列编码20个氨基酸，在真核生物的翻译阶段，会在第19个氨基酸和第20个氨基酸之间发生剪切作用^[35]，从而在蛋白合成后释放下游多肽^[4]。最近，Kim等^[36]借助干预性2A多肽，使用β-伴大豆球蛋白，使八氢番茄红素合成酶和胡萝卜素脱氢酶基因在大豆(Glycine max)种子中表达。观察到β-胡萝卜素的积累与转基因种子中的高mRNA水平相吻合。表明2A多肽确实可以在植物体内发生有效剪切并表达蛋白。

LP4(the fourth linker eptide)是来自于凤仙花种子的一段编码29个氨基酸的多肽，表达时可在第一个和第二个氨基酸间发生剪切^[37]。2004年，Bruno等将LP4的前9个氨基酸和2A融合起来，在拟南芥植株中转入两个抗菌基因DmAMP1和RsAFP2，结果发现，与单独使用2A和LP4作为连接肽相比，融合型多肽的剪切效率有很大提高^[38]。Chang等^[39]运用LP4/2A连接肽将4个来自假单胞菌的抗汞基因转入烟草中，结果发现转基因烟草根系中的汞含量可达到251μg/g，4种基因均得到大量表达。

运用LP4/2A连接肽的分离ORF法，减少了启动子数量，避免了由多个相同启动子引起的基因沉默现象，还可以降低转入片段的长度提高转化率，并在基因定位方面更有优势，是一种较为理想的有待更多研究的多基因转化方法。

3.4 植物双向启动子

植物双向启动子是将两个转录起始方向相反的基因同时启动共同表达的一段核苷酸。Li等^[40]将两个单向的35S启动子插入增强子的上下游构建双向的35S启动子，启动的GUS基因表达量是单向启动子的206倍。该方法在植物中研究较少。和静等^[41]将中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪合成酶基因双向启动子VvSTS31和VvSTS32与GUS基因融合，在葡萄叶片中瞬时表达，研究了中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪合成酶基因双向启动子的活性与差异。

将植物双向启动子方法与基因融合技术结合，可以减少引入的启动子数目，有效避免启动子之间序列同源导致的基因沉默现象^[42]，解决了转基因研究领域的难题，正成为一个新的研究方向。

4 问题与展望

多基因转化对于调节生物代谢工程、改良植物性状具有显而易见的优势，许多传统转化方法已广泛应用于商业化的转基因作物中。改进后的共转化方法提高了标准载体的承载力，让转化变得更加方便。新兴的基因融合技术与植物双向启动子技术，更是有效避免了多个重复启动子引发的基因沉默现象，缩短引入片段长度，提高基因表达效率。

目前发现研究热点CRISPR-Case9技术除了在基因敲出方面有重要作用，还可以作为多个基因的激活器使其表达^[43]。但多基因的转入仍须克服基因整合后出现的一些问题。例如多个转入基因之间的相互作用，每个基因的整合与表达情况存在众多不确定因素。已有利用锌指和转录激活效应器的相互作用来评估转基因与周围位点相互作用的风险^[44]，但其他包括位点特异性重组、靶向整合等问题还有待进一步研究。