甘油是一种重要的微生物碳源，发酵生产中，甘油作为碳源广泛应用于基因工程菌培养及生物活性大分子表达^[1]。当前发酵领域广泛采用的毕赤酵母(Pichia pastoris)，其生长阶段以甘油为唯一碳源，表达阶段以甲醇为碳源。研究表明，混合碳源的流加控制^[2]、培养温度^[3]等条件均影响毕赤酵母的活性或活力，进而影响重组蛋白的表达量。发酵后期，培养基中残留甘油则会抑制目的蛋白的表达^[4]。因此，发酵液中甘油含量的监控是保证高发酵单位的关键，精确分析甘油含量在毕赤酵母类发酵过程中非常重要。

此外，作为一种重要的生物化工产品及平台化合物，甘油来源及应用均极其广泛^[5]。无论是传统皂化废液蒸馏法，还是作为生物柴油副产物，甘油的质量控制及含量检测均至关重要^[6-7]。另外，甘油浓度测定在食品和酒精饮料质量和鉴别真伪方面具有重要应用^[8]，因此其受到法律的严格监管，亦是各种饮料基质质量监控的常规手段。

目前，国内外有关发酵液中，甘油含量的测定方法有传统高碘酸氧化法、分光光度法、以及原子吸收法、气相色谱法^[9]、近红外光谱法、高效液相色谱法^[10]、甘油激酶法^[11]等。但这些方法或者所需仪器昂贵, 样品前处理麻烦; 或操作繁琐, 实验精确度低。而且，甘油样品成分复杂，多羟基醇等类似产物，以及其他过渡碳源，甘露醇、山梨醇、海藻糖、乳酸等均对甘油的测定结果产生明显影响^[12-13]。而较为快速的甘油检测试剂盒，价格昂贵，成本较高。所以皆不适于实际生产中甘油含量的快速测定及实时监控。依据SBA-40E型生物传感分析仪的测定原理，以及甘油相关生化反应，本论文采用酶固定化技术，研制高活性、高稳定性、高催化效率的甘油酶膜，制成甘油酶电极，并测定甘油含量，探讨其用于甘油检测的实用性及优势。

1 材料与方法 1.1 试剂与仪器

甘油-3-磷酸氧化酶(GPO, EC 1.1.3.21; Aerococcus viridans, 96U/mg)、甘油激酶(GK, 2.7.1.30; Escherichia coli, 60U/mg)：美国Sigma公司，Immobilon膜、Biodyne膜：美国Sigma公司，核微孔膜：美国Nucleopore公司，戊二醛、牛血清蛋白(BSA, 进口分装)：上海化学试剂站，均为分析纯。

生物传感分析仪：SBA-40E型，山东省科学院生物研究所；精密pH计：上海雷磁仪器厂；台式离心机：上海安亭科学仪器厂；FA1004N型电子天平：上海天谱分析仪器有限公司。

1.2 测定原理

试制的固定化甘油酶膜，采用特制的银-氯化银电极制成甘油酶电极，甘油酶电极催化底物进行反应，并由SBA-40E型设备读取响应的电流信息，从而实现甘油浓度的测定。反应原理为：甘油激酶与甘油-3-磷酸氧化酶专一性催化甘油底物生成甘油酮等产物和过氧化氢，其反应方程式如下：

一定时间内，H₂O₂的产量与甘油含量成正比，SBA-40E型生物传感分析仪检测H₂O₂的电流信号，进行显示和记录。在一定浓度范围内，生物传感分析仪记录的电流信号与甘油含量呈线性关系。

1.3 甘油酶膜的研制

1.3.1 GK与GPO的固定化方法

物理吸附法制备GK-GPO双酶酶膜：以GK:GPO质量比为1:1、2.5:1、5:1、1:2.5、1:5，分别配制0.5mg/10μl的GK-GPO混合酶液。按照葡萄糖酶膜制备方法^[14]，以核微孔膜为载体膜，将5μl的1% BSA、5μl的0.25%戊二醛、5μlGK-GPO酶液、1μl苯甲酸-庆大霉素混合液(体积比为1:1)混匀，滴注于载体膜，并涂布均匀，室温反应20min，未反应的戊二醛用0.1mol/L甘氨酸浸湿封闭后室温干燥。最后在制好的酶膜外层涂一层醋酸纤维素膜，以防止大分子物质的干扰，制备出随机固定化甘油酶膜，即(GK+GPO)-载体膜。后将各比例GK-GPO酶液所制酶膜用于甘油催化，记录并比较反应产生的电流信号，筛选GK、GPO随机吸附固定化的最佳比例。

共价结合法制备GK-GPO双酶酶膜：分别配制0.2mg/10μlGK、GPO酶液，以核微孔膜为载体。按方法^[15-16]报道的共价固定化方法，先用2%二甲基硫酸和无水乙醇活化Biodyne膜，后以1%赖氨酸反应2h，再以12.5%戊二醛处理45min，最后以pH7.0、0.1mol/L磷酸缓冲液冲洗整夜，完成Biodyne膜的活化。吸取GPO液涂在活化的Biodyne膜的一侧，2min后吸取GK液涂于该膜的另一侧，同时GK酶液紧密附着在空白核微孔膜上，反应2h。Biodyne膜、核微孔膜共价偶联为双层膜，制备GK、GPO不均匀共价固定化酶膜，即GPO-Biodyne膜+GK-核微孔膜。测试该甘油酶膜对于甘油催化的电流信号。

1.3.2 GK与GPO固定化载体及固定模式

采用Biodyne膜、ImmobilonAV膜、核微孔膜作为GK、GPO固定化载体膜材料。分别采用上述方法^[14-16]及试验筛选的GK、GPO随机固定化最佳比例，以及GK-GPO双酶共价固定化方法。制备三种随机固定化酶膜，包括：(GK+GPO)-核微孔酶膜、(GK+GPO)-Biodyne膜、(GK+GPO)-Immobilon AV酶膜；以及两种共价固定酶膜，分别为GK-核微孔膜+GPO-Biodyne膜、和GK-核微孔膜+ GPO-Immobilon AV膜。比较几种甘油酶膜用于甘油催化时的响应电流信号，从而确定信号最强的甘油酶固定化载体膜，以及固定化方法模式。

1.4 测定方法

制备的甘油酶膜安装于SBA系列专用过氧化氢电极，建立甘油酶电极系统。本实验采用0.1mol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH=7.5)作为反应环境，保持反应温度25℃，设置反应时间为40s。依据SBA-40E型生物传感分析仪测定步骤，吸取25μl甘油标准溶液(质量浓度为9.0 g/L)注入酶电极反应池内，进行“定标”，再准确吸取同体积待测样品注入仪器反应池，反应40s后，仪器自动记录并显示响应电流信号及甘油浓度。

2 结果与分析 2.1 GK与GPO固定化方法筛选

按“1.3.1 ”步骤，将GK、GPO按不同质量比进行物理吸附随机固定化、以及GK、GPO共价固定化所制甘油酶膜，分别装配为甘油酶电极，并进行甘油催化测试，记录各自响应的电流信号。每个测定重复4次，取其平均值，结果见图 1a、图 1b。图 1a表明，当GK、GPO质量比为1:1进行随机固定化时，甘油酶电极对甘油催化响应电信号最高。且在试验浓度范围内，且响应电信号与甘油浓度具有更好的线性关系，线性方程式为Y=313.1X+23.8，R²=0.998 9：线性范围亦更宽。图 1b显示，GK、GPO最佳比例(质量比为1:1)随机吸附固定化酶膜，与其共价固定化甘油酶膜，进行甘油催化活性比较时，在本试验浓度范围内，均选择核微孔膜为载体膜时，两种固定化模式中催化电流信号与甘油浓度的线性关系均良好。共价结合法所制GK-GPO酶膜，在同浓度甘油位点，其催化甘油的响应电流信号更高。鉴于以上结果，可以认为，对于甘油浓度的测定，共价固定化GK、GPO所制的GK-GPO双酶酶膜更高效。

2.2 GK与GPO固定化方法载体膜筛选

采用“1.3.2 ”中三种不同载体膜，按GK、GPO最佳固定比例(GK:GPO=1:1)、以及最佳固定化方法制备五种甘油酶膜：(GK+GPO)-核微孔膜、(GK+GPO)-Biodyne膜、(GK+GPO)-Immobilon AV膜、GK-核微孔膜+GPO-Immobilon AV膜。该5种酶膜分别用于催化甘油时，分别测试其电流信号，每个测试重复4次，其结果如图 2。由图 2可知，GK:GPO=1:1随机固定化于核微孔膜所得(GK+GPO)-核微孔膜，以及GK、GPO分别共价固定于核微孔膜、Biodyne膜而制备的双酶酶膜：GK-核微孔膜+GPO-Biodyne膜，均对试验浓度范围内甘油含量呈现明显的线性曲线，且GK-核微孔膜+GPO-Biodyne酶膜的电流信号更高。故本研究最终选择GK-核微孔膜+GPO-Biodyne酶膜装配甘油酶电极。

2.3 甘油酶电极最适温度

分别在10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50 ℃温度条件下，以0.1mol/L Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液(pH值7.5)为离子反应环境、且保持试验电压稳定、远离热源等试验条件，测试甘油酶电极用于甘油催化时的电流信号，研究反应温度对酶电极活性的影响，探讨其最佳催化温度。每个测定重复4次，甘油酶电极响应电流平均值与反应温度关系如图 3。

由图 3可知，当反应温度低于20℃时，随温度升高电流信号增幅减小，之后电流信号随温度迅速增大，当温度达26℃时，电流信号增至最高水平。反应温度在26℃~32℃范围时，电流信号一直保持较高水平；之后随温度上升而逐级下降，当反应温度为50℃时，电流信号很低，甘油酶膜几乎丧失对甘油的催化能力。故甘油酶电极的工作温度最适宜相对恒定于26~32℃范围内。

2.4 甘油酶电极最适pH

以0.1mol/L Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液作为甘油酶电极反应环境(pH值为5~9)，进行最适pH试验。研究不同pH值对甘油酶电极响应信号的影响，探讨其最适pH值环境，测定重复4次，取平均值，结果见图 4。结果表明，当pH值在5~7.5范围内时，酶电极响应产生的电流信号随pH值增大而升高，至pH值为7.5时，电流信号最大，酶活性最高；之后随pH值增大而略有降低。在本试验pH值范围内，当pH为6~9时，甘油酶电极电流信号均保持较高水平；且pH值为7.5时，电流信号最高，可作为本研究甘油酶电极的最适pH值。

2.5 甘油酶电极专一性试验

在浓度为1 g/L标准甘油溶液中，分别加入乙二醇(35/100)、甲醇、乙醇、正丁醇、甘露醇、山梨醇、乙醇酸(27/100)、乳酸、葡萄糖、NH₄⁺、Cu²⁺、Mg²⁺等9种可能的干扰物质，并使干扰物质浓度为甘油浓度的50倍，测其对甘油酶膜响应信号的干扰。结果表明，甘油类似物乙二醇(35/100)、甲醇、乙醇、正丁醇、乙醇酸(27/100)，以及葡萄糖、甘露醇、山梨醇、乳酸、Cu²⁺、Mg²⁺对甘油测定没有明显影响，只有NH₄⁺对甘油酶膜响应信号有较大影响。而NH₄⁺在发酵液中存在较为普遍，故进一步研究了NH₄⁺对甘油酶膜的影响，结果发现当NH₄⁺浓度≤10 g/L时，其对1 g/L甘油样品测定无明显影响。由此可见，甘油酶电极的抗干扰性较强，但实际测试时，需保证NH₄⁺浓度不能超过其要求水平。此外，鉴于NH₄⁺的较为广泛存在性，结合当前纳米修饰、胶体金修饰技术等，下一步可研究甘油酶电极的专一性修饰，进一步增强甘油酶膜的抗干扰性等性能和优势。

2.6 工作标准曲线

反应温度、pH值等均保持最适试验条件时，准确称取甘油(质量分数为99%)质量，溶解于蒸馏水。依次配制质量浓度为0.05~10.00 g/L标准甘油溶液。按“1.4”方法：甘油酶电极传感器自动定标后，用微量进样器依次吸取待试验甘油标准溶液25μl，进行测定，每个浓度测定4次，以甘油浓度为横标、响应电信号为纵标，绘制甘油酶电极对不同浓度甘油的响应工作曲线，见图 5。

从图 5可知，在0.05~9.00 g/L浓度范围内，甘油酶电极响应信号与甘油浓度具有良好的线性相关性，其回归方程为：Y=384.54x+20.918，其相关系数R²=0.9977；甘油浓度为9.50、10.00 g/L时，响应电流信号远离线性曲线。由此可认为，该甘油酶电极的线性响应范围为0.05~9.00 g/L，对甘油最大响应浓度为9.00 g/L。

2.7 回收率试验

最佳试验条件下，取3个甘油样品进行加标回收率试验。稀释后每个样品平均分成2份，每份100ml，其中一份加入0.25g甘油纯品做回收试验。按“1.4”方法测定各样品的甘油含量，每个样品重复测定3次，求平均值。由回收率计算公式：P=(加标试样测定值-试样测定值)/加标量×100%，即得甘油酶电极对甘油测定的回收率，在98.4%~102.4%，结果见表 1。

试验结果表明，该方法回收率较高，样品中其他成分对测定结果影响较小，可以认为该方法是可行的。

2.8 精密度试验

采用与“2.6”相同的最佳试验条件，取6个甘油样品，按甘油酶电极标准曲线浓度范围，分别进行稀释，并以试验的酶电极法测定样品中甘油含量。每个样品重复测定5次，求标准偏差(SD)及相对标准偏差(RSD)，其RSD均小于5%，符合生物样品分析要求。甘油浓度越高，相对标准偏差越大的现象，结果见表 2。

2.9 对比试验(g/L)

最佳实验条件下，另取2个发酵液(a、b)、2个甘油纯品(c、d)。分别采用甘油酶电极法、高碘酸氧化法、高效液相色谱法测试4个样品中甘油含量，每个测定重复5次。比较几种测定方法，并进行显著性T检验，数据见表 3。

由上述结果可以看出，对于4个甘油样品的测定，酶电极法与高碘酸氧化法、高效液相色谱法(HPLC)比较时，均无显著性差异(P＞0.05)；且酶电极法与HPLC法的测定结果更接近，相对标准偏差(RSD)均小于高碘酸氧化法。该结果说明，酶电极法测定甘油含量时，其准确度接近HPLC水平；较之HPLC的昂贵费用、复杂操作，其更适用于甘油相关行业实际生产的定量及实时监控。另外，发酵液与甘油纯品相比较时，纯品甘油测定的RSD更低，说明对于纯品及成品甘油产品，该方法可用于其准确定量及标定。

3 结论

本文采用酶固定化技术，研制了能够快速催化甘油的甘油酶膜，制备了简易甘油酶电极，并研究了甘油酶电极法快速测定甘油含量专一性、稳定性、精确性等。结果证明，该方法用于甘油检测，其稳定性、专一性均较强，且准确度高，线性范围宽，抗干扰能力较强；同时操作简便，反应快速，仪器要求简单，成本低廉；可满足实际生产中，甘油含量快速、实时、以及低成本测定的要求，有望为相关行业中甘油快速检测提供有效、快捷的手段。为完善甘油酶电极，使其能真正应用于各甘油相关行业，还需要进一步改进甘油酶膜固定化方法，引入诸如纳米修饰等技术，减少固定GK、GPO所用量、提高酶利用效率，提高甘油酶膜及酶电极的专一性、抗干扰性等性能。