埃博拉病毒感染可引起多发性器官衰竭等症状最终导致死亡^[1]，致死率高达70%~80%^[2]。埃博拉病毒自1967年首次发现以来已引起多次爆发^[3]，最近一次发生于2014年，死亡人数高达7 373人。目前来看，埃博拉病毒感染存在一定地域限制性^[4]，但是由于其潜伏期通常为5~12天甚至可达21天，而近年来跨国交流日益频繁，因此，埃博拉病毒存在世界更大范围传播蔓延的重大风险。由于埃博拉病毒高致病性和高传染性，世界卫生组织已将其列为生物安全4级的病原体^[5]。

目前确定的埃博拉病毒分为四个亚型，包括扎伊尔型、苏丹型、本迪布焦型、以及科特迪瓦型。埃博拉病毒为单股负链、不分节段的RNA病毒，外有包膜，其基因组编码7个蛋白，即NP、VP35、VP40、GP、VP30、VP24、以及RNA依赖的RNA聚合酶。其中，VP40和VP24是病毒的基质蛋白，VP40与病毒的出芽和病毒结构的稳定有关^[6]，NP、VP30、VP35和RNA依赖的RNA聚合酶L与病毒基因的复制和转录相关^[7-8]；GP是跨膜蛋白，作为病毒唯一的糖蛋白在病毒包膜表面形成类似刺突的结构，与细胞受体结合以及病毒的入侵密切相关，是埃博拉病毒致病的决定性因素^[9]，同时能诱导特异抗体的产生^[10]。

由于埃博拉病毒的极度危害性，加强其疫苗及检测诊断的研究以提高对该病毒感染的防控能力，具有重要的意义。有文献报道在哺乳动物细胞中共表达GP和VP40可以自组装成埃博拉病毒样颗粒^{[2, 4]}，且病毒样颗粒能诱导机体产生特异体液免疫和细胞免疫^[11]，在啮齿类动物和非人灵长类动物模型中提供有效保护^{[2, 12]}。本研究通过密码子优化获得有利于哺乳动物细胞表达的GP和VP40基因序列，旨在实现两个蛋白的有效表达及病毒样颗粒装配，为进一步的疫苗研究与病毒抗原、抗体检测奠定基础。

1 材料与方法 1.1 菌株、质粒与细胞系

大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α购自宝生物(大连)有限公司，表达质粒pcDNA3.1及具有双表达单元的质粒pBudCE4.1购自Invitrogern公司，人胚肾细胞系293FT细胞为科室保存细胞(中国医学科学院医学生物学研究所分子免疫研究室)。

1.2 试剂

质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，限制性内切酶XhoⅠ, KpnⅠ, HindⅢ, BamHⅠ以及T4 DNA连接酶购自宝生物(大连)有限公司，lipofectamine2000购自life technology，VP40抗体购自美国Santa Curz公司，HRP标记的羊抗鼠IgG购自R & D公司，培养基购自HyClone公司，新生牛血清购自民海生物公司。

1.3 GP和VP40基因序列设计与合成

依据埃博拉病毒扎伊尔型的GP和VP40蛋白的氨基酸序列，按哺乳动物细胞表达偏爱密码子进行优化，获得编码GP和VP40的基因序列。GP基因序列包括分处两端的XhoⅠ和KpnⅠ两个酶切位点全长2 046bp, VP40基因序列包括HindⅢ和BamHⅠ两个酶切位点，全长996bp。所设计的基因委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 表达GP和VP40的重组质粒构建

将pcDNA3.1质粒分别以Xho Ⅰ+ KpnⅠ和HindⅢ+BamHⅠ双酶切，经胶回收获得载体片段；同样，将公司提供的携带合成基因的质粒分别经同样的双酶切，以胶回收获得GP片段和VP40片段。T4 DNA连接酶16℃过夜连接片段和载体，连接产物转化DH 5α，并涂布于含100 μg/ml氨苄西林的LB平板上，37℃过夜培养后挑取单菌落，摇菌并提取质粒。将提取的质粒分别用Xho Ⅰ + KpnⅠ和HindⅢ + BamHⅠ进行双酶切并以1%琼脂糖电泳鉴定(图 1a)，重组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司进行DNA测序分析。

此外，将GP和VP40基因片段分别连接于共表达质粒pBudCE4.1的两个表达单元，转化DH5α并涂布于含博莱霉素的平板，经鉴定获得重组克隆(图 1b)。

1.5 重组质粒转染293FT细胞

293FT细胞培养于含10%新生牛血清及1%青霉素-链霉素的DMEM培养基，转染前一天按2.5×10⁵个/ml铺于6孔板，37℃，5%CO₂培养，转染前4h将培养基换成无双抗培养基。质粒转染根据lipofectamine2000说明书进行，单独或共转染表达GP和VP40的重组质粒，以质粒空载体为对照，并设空白对照(除不加质粒外与其他孔操作相同)，转染后4h再将培养基换成含双抗培养基。

1.6 转染的293FT细胞样品处理与电镜观察

转染的细胞于37℃，5% CO₂下培养68h。收集培养上清并经9 500g离心4h，弃上部分培养基而仅留管底一小部分(1.5ml留管底200μl)，轻轻吹打后保存待用。取上述上清样品10μl委托本所中心实验室经pH6.5，2%磷钨酸进行染色，以透射电镜观察病毒样颗粒。吸附的细胞经胰酶消化，以含10%小牛血清的完全DMEM终止，吹散悬浮后收集细胞，12 000r/min离心2min，弃培养基，用PBS重悬细胞保存待用。

1.7 重组蛋白表达的分析鉴定

收获的细胞及培养上清样品以12%的SDS-PAGE分离后，半干转移法20V，45min转移至硝酸纤维素膜，以含5%脱脂奶粉的TBS (50 mmol / L Tris缓冲液，pH 7. 2)室温封闭2 h；TBST溶液(含0. 5% Tween 20的TBS)洗膜3次，每次5 min，加入本科室先前制备的小鼠GP抗血清(用含0.5%脱脂奶粉的TBST按1:1 000稀释)或商品化VP40小鼠单克隆抗体(用含0.5%脱脂奶粉的TBST按1:500稀释)，4℃孵育过夜；TBST洗涤3次，再加入HRP标记的羊抗鼠IgG (1:5 000稀释)，室温孵育1 h；TBST洗涤3次，TBS洗涤2次，将ECL显色底物A、B液1:1混合后，加到膜上，进行显色反应，以X光片曝光显示结果。

2 结果 2.1 编码GP和VP40蛋白的基因优化

依据埃博拉病毒扎伊尔型的GP和VP40蛋白的氨基酸序列，按哺乳动物细胞表达偏爱密码子进行优化，获得GP基因序列及VP40基因序列。5’端有限制性内切酶位点及其后的ACC，以满足基因重组操作需要及指导正确翻译起始的KOZAK基本序列要求。

2.2 重组表达质粒的构建和鉴定

2.2.1 重组表达质粒构建

将GP和VP40的基因片段克隆到具有双表达单元的质粒pBudCE4.1，获得共表达GP和VP40的质粒pBudCE4.1/GP/VP40(图 2)。将GP和VP40的基因片段分别克隆到质粒pcDNA3.1中，获得分别表达GP的质粒pcDNA3.1/GP和表达VP40的质粒pcDNA3.1/VP40(图 3)。

2.2.2 重组表达质粒鉴定

1%琼脂糖凝胶电泳分析显示，重组表达质粒pcDNA3.1/VP40、pcDNA3.1/GP及pBudCE4.1的双酶切(XhoⅠ+ KpnⅠ以及HindⅢ+BamHⅠ)产物分别可见2 000bp左右的条带和1 000bp左右的条带，大小与预期的GP 2046bp与VP40 996bp分子量相符，见图 1。测序结果证实编码GP和VP40蛋白的基因片段正确插入，序列正确。

2.3 表达产物的鉴定

Western blot分析293FT细胞转染后培养上清及细胞，以小鼠GP抗血清为一抗。结果显示，单独pcDNA3.1/GP质粒、共表达的pBudCE4.1/GP/VP40质粒以及pcDNA3.1/GP和pcDNA3.1/VP40双质粒转染的细胞及培养上清在预期的目的蛋白位置都可见明显的GP特异反应条带，而单独转化pcDNA3.1/VP40质粒以及空白对照中没有相应的条带(图 4)。两个质粒共转染细胞的GP表达较单独pcDNA3.1/GP质粒转染及共表达质粒pBudCE4.1/GP/VP40转染明显减弱。

此外，同样经Western blot分析pBudCE4.1/GP/VP40转染细胞及培养上清样品，以商品化的抗VP40单克隆抗体为一抗，结果显示培养上清中在预期的40kDa可见VP40特异反应条带，但反应较弱。空白对照中没有相应条带出现(图 5)。

2.4 电镜观察结果

质粒pBudCE4.1/GP/VP40转染细胞表达的重组蛋白样品经电镜观察，可见典型的丝状病毒样颗粒，与文献报道的埃博拉病毒样颗粒形态相似，见图 6，长度约800nm~1 300nm。

3 讨论

由于埃博拉病毒高致病性和高传染性，其操作所要求的实验条件十分严苛，很大程度上限制了对其生物学、免疫学的相关研究、同时也限制了其经典的灭活与减毒疫苗的研究生产以及疫苗效果评价等工作的开展。已有的研究显示，灭活疫苗诱导的免疫水平较低，需多次接种，经福尔马林或热灭活的埃博拉病毒接种豚鼠后，对野生型埃博拉病毒不能起到完全的保护，此外，经辐照灭活的埃博拉病毒虽对小鼠起到保护作用，但不能保护非人灵长类^[1]。目前，进入III期临床试验的疫苗主要为载体疫苗，载体疫苗能诱导强的免疫应答，但由于机体内可能存在或者疫苗应用可能诱导对载体的特异性抗体，以及载体病毒本身可能的免疫病理效应，载体疫苗的应用受到潜在限制。病毒样颗粒在形态学和免疫学性质上与病毒粒子相似，且不含病毒基因组，不能进行复制，可常规条件下操作，能激发强的机体免疫应答，因而是一种潜在的有效疫苗形式。由于埃博拉-扎伊尔株在埃博拉病毒亚型中致死率最高，且最近于2014年爆发的埃博拉出血热也是由该亚型引起，因此本研究选择利用该型病毒蛋白摸索重组病毒样颗粒的制备。

由于在哺乳动物细胞重组GP与VP40蛋白表达效率有限，样品经SDS-PAGE后考马斯亮蓝染色不能显示重组蛋白，需要利用特异免疫反应。因此，我们通过Western blot检测转染重组质粒的293FT细胞中重组GP和VP40蛋白的表达，并通过电镜观察证实病毒样颗粒的存在。尽管本研究中基因已经按照密码子偏好性进行了优化，但VP40的表达水平仍然较低，可能限制了本研究中病毒样颗粒的制备效率。考虑到哺乳动物细胞基因表达的影响因素较多，密码子偏好优化仅是常规的相对明确的表达调控策略，下一步的工作将从基因拷贝数、mRNA二级结构与稳定性、宿主细胞、启动子等方面进一步改善VP40的表达，以获得更高效病毒样颗粒的制备。有文献报道，单独表达VP40也能观察到病毒样颗粒^[12]，但在本实验中单独转染pcDNA3.1/VP40质粒没有观察到病毒样颗粒，可能的原因是由于缺少GP等蛋白的帮助，病毒样颗粒的装配效率受到影响。这一推测的依据是有研究报道显示共转染埃博拉病毒VP40与其他蛋白能提高病毒样颗粒的组装和释放^[13-16]。

本研究为下一步工作奠定了重要基础，可开展工作包括：免疫小鼠探讨病毒样颗粒免疫特性；以病毒样颗粒作为包被抗原，建立埃博拉抗体的ELISA检测方法；以免疫获得的抗血清进行埃博拉病毒抗原的检测；尝试共转染携带报告基因的质粒，在细胞内病毒样颗粒装配的时候，如果能够同时包裹报告质粒或者表达报告基因的mRNA，将可能形成假病毒颗粒，可尝试以此模拟病毒侵染细胞，从而提供抗体中和效力评价的平台等。研究工作将有助于埃博拉病毒生物学的相关研究以及疫苗的研发。

致谢 感谢中国医学科学院医学生物学研究所所级科技计划(2014IMB02ZD)对本研究的资助。