腈水合酶(Nitrile Hydratase, EC 4.2.1.84, 简称NHase)是一类重要的工业用酶，它可以催化腈类化合物水合生成相应的酰胺^[1]，目前已成功应用于丙烯酰胺、烟酰胺和5-氰基戊酰胺的工业化生产^[2]。2-(4-氯苯基)-3-甲基丁腈(CPIN)在腈水合酶和酰胺酶的耦合作用下可转化为2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸^[3]，用于合成高效拟除虫菊酯类杀虫剂戊菊酯和氰戊菊酯等^[4]。但目前报道的可转化CPIN的腈水合酶数量较少且活力很低，极大地限制了催化效率。Fallon等^[5]报道，在CPIN初始浓度为10 mmol/L时，Pseudonocardia putida 5B野生菌转化CPIN的速率为0.18 μmol/min· g wet cells。通过异源表达可实现腈水合酶的过量表达，以此提高催化活性。如P.putida 5B腈水合酶的E.coli重组菌对CPIN的转化速率为8.42 μmol/ min· g dry cells^[6]，约为野生菌的10倍。

腈水合酶是由α亚基和β亚基构成的多亚基酶，通常以(αβ)、(αβ)₂形式存在^[2]。在野生菌中，腈水合酶基因以基因簇形式存在，其上/下游基因编码的蛋白对其有不同的调控作用^[7]。因而在异源表达时，必须共表达位于其结构基因上/下游的特定活化元件才能形成活性蛋白^{[6, 8-11]}。如Petrillo等^[8]研究了来源于Comamonas testosteroni 5-MGAM-4D的腈水合酶在E.coli中的重组表达，发现共表达位于结构基因下游的活化元件后活力提高20倍以上。由此可见，调控双亚基以及活化元件的表达比例，是腈水合酶功能表达的关键所在。

本文以实验室前期获得的对CPIN有较高活性的腈水合酶NHaseK为研究对象^[11]，其α亚基、β亚基和活化元件17k的GenBank ID分别为KOX_20505, KOX_20500, KOX_20495^[12]。首先选择单一载体/双启动子控制的pETDuet-1为载体，通过启动子调控三段基因的表达强度，确定合适的蛋白质表达比例。然后采用复制子不同的双启动子质粒为载体，考察质粒拷贝数对NHaseK重组表达的影响，从而实现NHaseK在大肠杆菌中功能表达的优化。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒

表达宿主E.coli BL21(DE3)，表达载体pETDuet-1、pACYCDuet-1、pCDFDuet-1、pRSFDuet-1由本实验室保存；重组质粒pET-N-SD17k由本实验室构建^[11]。

1.1.2 工具酶与试剂

限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ、BglⅡ、XhoⅠ, PrimerSTAR^® MAX DNA Ploymerase, T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司；质粒DNA小量制备试剂盒购自Axygen公司；DNA ladder购自Fermentas公司；蛋白Marker ProteinRulerI、Ni-NTA琼脂糖树脂购自北京全式金生物科技公司；卡那霉素、氨苄青霉素、氯霉素、链霉素、IPTG购自北京鼎国生物技术有限责任公司；CoCl₂·6H₂O购自国药集团；底物CPIN、产物CPIAm由本实验室合成。

1.1.3 引物

引物见表 1。

1.2 方法

1.2.1 表达策略的设计

选择pETDuet-1为载体，将NHaseK的α亚基、β亚基和活化元件17k基因分别插入于不同启动子之后，以期实现它们的差异表达，具体策略如表 2所示。此外，为考察质粒拷贝数对表达的影响，构建重组质粒pACYCDuet-NHaseK、pCDFDuet-NHaseK、pRSFDuet-NHaseK，它们的构建方式与pETDuet-NHaseK相同。

1.2.2 重组质粒的构建

以重组质粒pET-N-SD17为模板，按照表 1选择相应引物扩增各目的基因片段并纯化回收。PCR程序：95℃2 min；98℃10 s，58℃15 s，72℃20 s，循环30次；72℃2 min。按照表 3，分别采用EcoRⅠ/HindⅢ或BglⅡ/XhoⅠ双酶切PCR产物和质粒，经切胶回收后采用T4 DNA连接酶对相应基因和质粒进行连接，转化入E.coli BL21(DE3)。

1.2.3 重组酶的诱导表达

除氨苄青霉素浓度为100 μg/ml外，卡那霉素、氯霉素、链霉素为50 μg/ml。其余方法见参考文献[11]。

1.2.4 蛋白的纯化与浓度测定

采用Ni-NTA亲和层析法对粗酶液进行纯化，采用SDS-PAGE分析蛋白表达及纯化情况，采用Bradford protein assay kit测定蛋白浓度，具体方法见参考文献[13]。

1.2.5 酶活的定义与测定

酶活定义：在测定条件下每分钟生成1 μmol CPIAm所需要的酶量为一个酶活单位(U)。测定方法：反应总体系为1.0 ml，含50 mmol/L柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液(pH 6.5)、2 mmol/L CPIN、5% (v/v)助溶剂甲醇，添加适量酶液起始反应。35℃振荡反应(纯酶2 min，粗酶10 min)，添加0.5 ml乙腈终止反应。反应液离心，采用高效液相色谱法(福立FL2200)测定上清液中产物浓度。色谱柱采用PntulipsTM QS-C18 (5 μm × 4.6 mm × 250 mm)，流动相为乙腈:水=55:50 (v/v)，流速为1.0 ml/min，UV检测波长为220 nm，产物和底物的出峰时间分别为7.9 min和29.3 min。

2 结果与讨论 2.1 重组质粒的PCR验证

各基因片段的大小分别为α (609 bp)、β(654 bp)、17k(468 bp)、αβ(1.3 kb)、β17k(1.1 kb)、NHaseK(1.8 kb)。对于重组质粒pETDuet-α、pETDuet-αβ、pETDuet-NHaseK、pACYCDuet-NHaseK、pCDFDuet-NHaseK、pRSFDuet-NHaseK，采用各目的基因扩增引物进行PCR验证和测序验证，结果表明各重组质粒构建成功。在上述重组质粒的T7 promoter-2之下插入相应基因，构建其余质粒。采用质粒测序引物DuetUP2 Primer和T7 Terminator Primer进行PCR验证和测序验证，结果表明各重组质粒构建成功。

2.2 单启动子表达结果

本文的出发质粒pET-N-SD17k以pET-30a (+)为载体，虽可实现NHaseK的过量表达，但存在着亚基表达量不均衡、活化元件17k表达量少的问题(图 1)。为解决该问题，本文选择pETDuet-1为载体来探索NHaseK的功能表达策略。一方面，该质粒与pET-30a (+)的复制子相同，可排除质粒拷贝数对表达的影响。另一方面，该质粒具有双T7启动子，为NHaseK三段必需基因的表达提供了更多构建可能。各表达策略的SDS-PAGE分析结果如图 1所示，部分策略的纯化结果如图 2所示，采用BandScan分析可溶蛋白表达水平，结果如表 4所示，重组酶活力如表 4所示。

首先考察单启动子表达结果。pET-N-SD17k、pETDuet-NHaseK、pETDuet-none-NHaseK都只采用一个启动子进行表达，pETDuet-NHaseK的亚基表达最为均衡，其α、β亚基表达量比例接近1:1；而pET-N-SD17k和pETDuet-none-NHaseK在表达时，α、β表达量比例分别为1:0.6和1:1.8，分别造成了部分α亚基和β亚基的无效表达。结合活力来看，亚基均衡表达的pETDuet-NHaseK重组菌表现出一定优势的单位蛋白粗酶活力，且纯酶比活力是pET-N-SD17k的124%。由此可见，亚基的平衡表达对提高NHaseK活力有重要作用。

2.3 双启动子增强β亚基的表达

在pETDuet-NHaseK的T7 promoter-2下插入β基因，构建pETDuet-NHaseK-β，以期增强β亚基的表达。由表 4可知，与初始策略pET-N-SD17k相比，其α、β亚基表达水平更为均衡；但与pETDuet-NHaseK相比，其β亚基表达水平并没有进一步提升，结合电泳图 1b，可以发现“β+tag3”多以包涵体形式出现，说明插入于T7 promoter-2之下的β基因没有实现功能表达。此外，pETDuet-NHaseK-β表达的17k极少，这可能是导致其单位蛋白活力低于pETDuet-NHaseK的重要原因。

2.4 双启动子增强17k的表达

为增强17k的表达，构建pETDuet-αβ-17k和pETDuet-NHaseK-17k。由表 4可知，它们表达17k的能力得到明显强化，其表达水平是其它策略的2~3倍；但由于受到总蛋白表达能力的限制，它们的αβ亚基表达量降低、β亚基表达量低于α亚基，最终导致粗酶活力降低。进一步对比这两种策略，发现它们的α、β亚基表达水平基本相同，但pETDuet-NHaseK-17k表达17k的能力更强，其单位蛋白的粗酶活力也更高，说明17k的增加确实可以提高NHaseK的活力。此外，pETDuet-NHaseK-17k的纯酶比活力是pETDuet-NHaseK的105%，这也意味着17k对提高比活力有积极作用，但由于降低了纯酶的亚基含量、存在着亚基表达不均衡的状况而只能表现出5%的提升效果。

2.5 双启动子同时增强β亚基和17k的表达

pETDuet-α-β17k、pETDuet-αβ-β17k和pETDuet-NHaseK-β17k都在T7 promoter-2下插入β基因和17k基因，以期同时提高β亚基和17k的表达水平，但效果并不理想。从图 1b看，部分“β+tag3”以包涵体形式出现，未能实现活性表达。结合pETDuet-none-NHaseK和pETDuet-α-β17k的表达情况来看，T7 promoter-2之后插入的第一段基因表达水平较低，这可能是因为融合表达的tag3 (由质粒上的核苷酸序列编码的四个氨基酸)对表达存在着一定负面影响。另一方面，pETDuet-α-β17k的活力很低，这可能是因为当α、β由不同启动子控制独立转录时，会对它们的配对带来阻碍，不利于形成成熟蛋白。

2.6 质粒拷贝数对表达的影响

考虑到Duet Vectors的各质粒除复制子、抗性不同外，其余结构无明显差异，故选取pACYCDuet-1、pETDuet-1、pCDFDuet-1、pRSFDuet-1为载体，按照pETDuet-NHaseK的构建策略，构建NHaseK在以上质粒的工程菌，以此考察质粒拷贝数对表达的影响。蛋白表达结果与活力测定结果如图 3和表 5所示。

从图 3可知，各工程菌都能较好地实现NHaseK的可溶表达。对SDS-PAGE电泳图进行BandScan灰度扫描后发现各工程菌的亚基表达水平基本一致，并且各菌株的单位蛋白粗酶活力都在260~290 U/g范围之内(表 5)，可见质粒拷贝数对单位蛋白的活力几乎无影响。另一方面，在对蛋白表达量的影响上，对比pACYCDuet-NHaseK和pETDuet-NHaseK (表 5)可知，当质粒拷贝数较低为10~12时，提高质粒拷贝数对蛋白表达量有一定的积极作用。对比pETDuet-NHaseK、pCDFDuet-NHaseK和pRSFDuet-NHaseK可知，当质粒拷贝数为15~20后，继续提高质粒拷贝数的作用很微弱，此时发酵液菌体浓度OD₆₀₀对表达量的影响更为明显。

3 总结

本文利用单一载体/多个启动子控制的pETDuet-1载体，成功实现了NHaseK在大肠杆菌中的功能表达。当将NHaseK的α亚基、β亚基、活化元件17k以基因簇的形式插入于pETDuet-1的T7 promoter-1之下(pETDuet-NHaseK)时，α亚基:β亚基表达水平由初始策略的1:0.6提升至1:1，均衡表达后纯酶比活力由630.23 U/g提升至780.05 U/g，证实亚基的平衡表达对腈水合酶有重要意义。进一步在T7 promoter-2之下重复插入17k基因(pETDuet-NHaseK-17k)，使得17k表达水平提高2倍，但双启动子的竞争使得亚基表达水平降低。从比活力来看，pETDuet-NHaseK-17k为817.39，虽与pETDuet-NHaseK策略相比仅提高5%，但考虑到亚基含量的降低对比活力有负面影响，因而可推测17k的补充表达对NHaseK的活力有积极作用。此外，本文研究了质粒拷贝数对NHaseK重组表达的影响，结果表明15~20的质粒拷贝数足以实现其功能表达。