人胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是一种生理性肽类肠道激素，胰高血糖素原在肠粘膜L细胞内被酶解为含37个氨基酸残基的GLP-1(1~37)。GLP-1(l~37)不具有生物活性，需进一步水解切除N末端6个氨基酸残基后成为具有生物学活性的GLP-1(7~37)，在摄入葡萄糖或进食数分钟后释放^[1]。GLP-1的主要生理作用是通过与胰岛β细胞表面的特异受体相互作用，促进胰岛素分泌，发挥葡萄糖浓度依赖性降糖作用。在动物实验中，GLP-1表现出促进胰岛β细胞的再生和分化，减少凋亡的作用。此外，它还能抑制胰高血糖素分泌，刺激生长抑素释放，延缓胃的排空，增加饱腹感，抑制食欲^[2-4]。GLP-1在2型糖尿病的发生发展中起着重要的作用。GLP-1及其类似物已经成为一种重要的治疗2型糖尿病药物。

生物半衰期短是GLP-1应用于临床面临的主要问题，这主要是因为GLP-1极易被体内二肽基肽酶(dipeptidyl peptidaseIV，DPP-IV)和中性肽链内切酶(neutral endopeptidase，NEP)代谢，半衰期只有1.5~2 min，必须持续静脉滴注或持续皮下注射才能产生疗效^[5-7]。为延长GLP-1在体内的半衰期，我们利用重组DNA技术将GLP-1(7~37)第34位Arg突变为Lys，以期提高GLP-1分子的选择性，使其在注射部位形成聚集体从而延长作用时间。另外限制GLP-1大规模应用的问题是生产成本，目前GLP-1及其类似物主要是通过化学合成法获得，产率低，生产成本高。本研究将GLP-1类似物基因克隆入pGEX-4T-3质粒中，使它在大肠杆菌中稳定表达，继而进行发酵培养并进行目标蛋白纯化和鉴定，为进一步规模化制备打下基础。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 质粒与菌株

pGEX-4T-3(GE公司)、E.coli DH5α、BL21(DE3)由本实验室保藏。生物活性检测使用细胞(HEK293/GLP1R)由辉源生物科技(上海)有限公司提供。

1.1.2 药品与试剂

Bam HⅠ、XhoⅠ、T4连接酶、DNA marker (大连宝生物工程公司)；质粒小提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒(上海生工公司)；酵母提取物、胰蛋白胨(OXOID公司)；异丙基硫代半乳糖苷(IPTG，Promega公司)；琼脂粉、氨苄青霉素(Sigma公司)；Glutathione-Sepharose 4B、SP-Sepharose FastFlow (GE公司)；乙腈(ACN公司)、三氟乙酸(TFA，Merk公司)；C8、C18色谱柱、RP-C18脱盐柱(纳微公司)；肠激酶和利拉鲁肽对照品(本公司自研)；cAMP检测试剂盒(Cisbio公司)。其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 仪器设备

AKTA avant (GE公司)；Agilent1260 HPLC (安捷伦公司)；凝胶成像仪(BIO-RAD公司)；二氧化碳培养箱(Thermo公司)；恒温振荡培养器(上海智诚公司)；分光光度计(上海欣茂仪器公司)；多功能酶标仪(BMG公司)；冷冻离心机(Thermo公司)；高压均质机(ATS公司)。

1.2 方法

1.2.1 构建pGEX-rhGLP-1类似物重组质粒

根据大肠杆菌密码子偏好性，对GLP-1类似物基因进行密码子优化，并在5′端加入Bam HⅠ限制性内切酶位点及肠激酶识别序列，3′端加入XhoⅠ限制性内切酶位点，委托金斯瑞公司进行全基因合成，合成后的cDNA和pGEX-4T-3质粒分别用Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切并回收目的片段，用T4连接酶连接并转入大肠杆菌DH5α，涂布含100 μg/ml氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，抽提质粒进行PCR鉴定、双酶切鉴定和基因测序分析。

1.2.2 基因工程菌的诱导表达

鉴定正确的重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)，构建重组菌株。筛选阳性克隆并进行摇瓶培养，振荡培养至OD₆₀₀=0.6~0.65时，加入IPTG至终浓度0.4 mmol/L进行诱导表达。4 h后用SDS-PAGE检测重组蛋白表达情况。

1.2.3 融合蛋白GST-rhGLP-1类似物的分离纯化

离心收集重组菌体，PBS清洗后，重悬至20 mm PBS中，调整固含量至10%~15%，用高压均质机在900 Bar压力条件下破碎两次，4℃，10 000 g，25 min离心收集包涵体，重悬至20 mm PBS中，调整固含量至5%~10%，加入尿素至终浓度为8 mol/L并低速搅拌8 h，将包涵体变性溶解，4℃，10 000 g，25 min离心收集上清，并上样至Glutathione-Sepharose4B层析柱中，清洗后用谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱，用SDS-PAGE电泳分析过程样品。

1.2.4 rhGLP-1类似物的分离纯化

纯化的融合蛋白通过超滤将缓冲液置换为50 mmol/L Tris-HCl，并调整浓度至约2 mg/ml，按每1 mg融合蛋白加1 IU肠激酶的比例加酶，室温酶切20 h。酶切完成后调pH至3.5终止反应，离心取上清并上样至SP-Sepharose FF层析柱，0~1 mol/L NaCl线性梯度洗脱，收集洗脱峰，用RP-C18柱脱盐后冻干。

1.2.5 rhGLP-1类似物的分析鉴定

用HPLC检测rhGLP-1类似物纯度，色谱条件：A：0.1%TFA水溶液，B：0.1%TFA乙腈溶液，色谱柱为C18(4.6 mm×150 mm 5 μm)，流速1 ml/ min，检测波长214 nm。

LC-MS质谱分析：肽质量指纹图谱鉴定，将冻干后的rhGLP-1类似物溶于pH8.0 25 mmol/L的(NH₄) HCO₃溶液，按照操作指南加入适量V8酶酶切后，用LC-MS质谱分析酶切后各个肽段的分子量；用未消化的样品测定完整分子量。

1.2.6 生物学活性测定

cAMP测定：本分析方法是基于细胞的生物测定法。GLP-1能够激活转染有人GLP-1受体的HEK293细胞(HEK293/GLP1R)，并呈剂量依赖性地在细胞内产生cAMP。转染有人GLP-1受体的HEK293细胞经过rhGLP-1类似物或利拉鲁肽对照品孵育后，裂解细胞，使用CISBIO cAMP检测试剂盒测定所产生的cAMP，用多功能酶标仪激发平板并读数。

2 结果 2.1 重组质粒构建

从筛选的阳性克隆株中抽提重组质粒pGEX-rGLP-1进行PCR鉴定，用Bam HⅠ、XhoⅠ进行双酶切鉴定，结果见图 1。从图中可以看出PCR扩增获得一个比100 bp略大的片段，与目的基因127 bp大小相近。重组质粒经过双酶切后，得到2个片段，大片段为载体片段，小片段与PCR扩增片段位置基本一致。DNA测序结果表明构建的重组载体目的基因正确。

2.2 基因工程菌的诱导表达

挑选三个阳性克隆分别进行诱导表达，诱导表达后进行SDS-PAGE分析，结果见图 2。分析结果显示，诱导后在分子量约30 kDa处出现明显的诱导蛋白条带，与融合蛋白的分子量理论值相符，灰度扫描结果显示其含量约为菌体总蛋白的20%。

2.3 融合蛋白GST-rhGLP-1类似物的分离纯化

摇瓶发酵的菌体经过高压均质机破碎，离心回收包涵体，加8 mol/L尿素变性后，用Glutathione-Sepharose4B亲和层析纯化，SDS-PAGE分析结果显示，目标蛋白纯度大于93%(图 3)。

2.4 rhGLP-1类似物的分离纯化

GST-rhGLP-1类似物融合蛋白经过超滤、酶切、SP-Sepharose FF层析和RP-C18柱脱盐后冻干得到终产品rhGLP-1类似物冻干粉，经HPLC分析鉴定纯度超过96%(图 4)。

2.5 rhGLP-1类似物的鉴定

对纯化后的rhGLP-1类似物进行了质谱鉴定：测得精确分子量为3 381Da (图 5)，与理论精确分子量一致，LC-MS测得肽质量指纹图谱也与理论一致，序列覆盖率为100%(图 6)，进一步确证了rhGLP-1类似物的结构，说明经过基因重组以及纯化得到了高纯度的rhGLP-1类似物。

2.6 rhGLP-1类似物的活性

cAMP测定结果如图 7所示，rhGLP-1类似物和利拉鲁肽对照品均能够促进表达有GLP-1受体的HEK293产生cAMP，且呈现剂量依赖关系。

通过与利拉鲁肽对照品比较半数效应(EC50值)，EC50值越低，表示其活性越高(表 1)。图 7的结果表明rhGLP-1类似物具有体外活性，且其活性高于利拉鲁肽对照品。

3 讨论

糖尿病是由胰岛素分泌缺陷或胰岛素作用不足所导致的，以高血糖为特征的代谢紊乱疾病。随着经济发展我国糖尿病发病率逐年上升，已经成为全球糖尿病患者人数最多的国家，我国糖尿病患者中80%以上为Ⅱ型糖尿病，主要症状是胰腺β细胞长期高负荷地表达胰岛素造成功能衰退^[8-9]。而人胰高血糖素样肽-1[GLP-1(7~37)]可以在高血糖的情况下刺激胰腺β细胞分泌胰岛素，并减少β细胞凋亡并促进其增殖，同时其刺激胰岛素分泌严格受葡萄糖浓度调控，因而用其治疗糖尿病不会引起低血糖。综合以上因素，GLP-1(7~37)是一种理想的II型糖尿病治疗药物^[10-12]。

目前国内在研的GLP-1类似物中多采用化学合成方法进行多肽制备，生产成本高，极易形成手性异构体且不易检测，从而影响其免疫原性和安全性，本研究尝试采用基因重组表达的方法来降低成本，大规模制备GLP-1。重组融合蛋白以包涵体形式存在，占菌体总蛋白的20%。在此基础上，我们开发了Glutathione-Sepharose4B亲和层析、超滤、酶切、SP-Sepharose FF层析、RP-C18脱盐和冻干的纯化制备方案，纯化后的蛋白纯度达96%以上，符合生物制品制备要求。同时该制备方法简便易行，成本较低，没有使用剧毒原料，适合大规模放大生产。我们计划在此基础上进行化学修饰以进一步延长其在体内的半衰期，为开发新型GLP-1药物打下基础。