中国生物工程杂志  2016, Vol. 36 Issue (12): 8-14

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董建一, 王欣欣, 王康伟, 陈军, 李慧玲, 王福金, 王爱国, 王靖宇.
DONG Jian-yi, WANG Xin-xin, WANG Kang-wei, CHEN Jun, LI Hui-ling, WANG Fu-jin, WANG Ai-guo, WANG Jing-yu.
miR-146a/b在Hep3B细胞中的表达及上下游调控机制探讨
MiR-146a/b Expression and Related up and Down-stream Regulatory Mechanisms in Human Hepatoma Cells
中国生物工程杂志, 2016, 36(12): 8-14
China Biotechnology, 2016, 36(12): 8-14
http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20161202

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收稿日期: 2016-05-30
修回日期: 2016-07-02
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董建一,王欣欣,王康伟,陈军,李慧玲,王福金,王爱国,王靖宇. miR-146a/b在Hep3B细胞中的表达及上下游调控机制探讨[J]. 中国生物工程杂志, 2016, 36(12): 8-14.
DONG Jian-yi,WANG Xin-xin,WANG Kang-wei,CHEN Jun,LI Hui-ling,WANG Fu-jin,WANG Ai-guo,WANG Jing-yu. MiR-146a/b Expression and Related up and Down-stream Regulatory Mechanisms in Human Hepatoma Cells[J]. China Biotechnology, 2016, 36(12): 8-14.
miR-146a/b在Hep3B细胞中的表达及上下游调控机制探讨
董建一 , 王欣欣 , 王康伟 , 陈军 , 李慧玲 , 王福金 , 王爱国 , 王靖宇     
大连医科大学实验动物中心 大连 116044
收稿日期: 2016-05-30; 修回日期: 2016-07-02
基金项目: 国家自然科学基金资助项目（30872950）
通讯作者: 王爱国, wangaiguo@hotmail.com ; 王靖宇, wangjingyus@163.com
摘要: 目的 探究miR-146a/b在Hep3B的表达及其上游调控机制和下游靶标蛋白。 方法 MTT法检测人正常肝细胞株LO2和人肝癌细胞株HepG2、Hep3B的增殖活性。分别提取3个细胞的总RNA和蛋白，应用RT-qPCR和蛋白印记法分别检测细胞株中miR-146a/b的表达和细胞外调节激酶1/2（ERK）、磷酸化ERK 1/2（p-ERK1/2）、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）、NF-κB抑制蛋白α亚基（IκBα）、白介素1受体关联激酶1（IRAK1）、肿瘤坏死因子受体相关蛋白6（TRAF6）的蛋白水平。用抑制剂分别抑制Hep3B细胞PI3K、AKT、ERK、NF-κB信号分子的活性并检测miR-146a/b的表达水平及IRAK1、TRAF6的蛋白水平。 结果 Hep3B细胞增殖活力和miR-146a/b表达水平显著高于LO2和HepG2（P < 0.01）。蛋白印记结果显示，以LO2为对照组，Hep3B细胞的p-ERK1、ERK1、p-AKT、IκB的蛋白水平明显升高，分别为LO2的10.87、24.68、6.67和1.92倍；IRAK1、TRAF6的蛋白水平明显降低，分别为LO2的0.23和0.003倍。与LO2细胞相比，HepG2细胞的IκB和IRAK1蛋白表达明显升高，分别为LO2的4.46和2.69倍。抑制Hep3B细胞的PI3K和AKT活性12 h和24 h，miR-146a和miR-146b的表达水平显著降低（P < 0.05）；抑制ERK和NF-κB的活性12 h和24 h，miR-146a/b的表达水平没有显著变化。抑制PI3K、AKT、ERK、NF-κB信号通路活性均可上调TRAF6和下调IRAK1的蛋白表达水平。 结论 在恶化程度较高的Hep3B细胞中，PI3K/AKT可通过上调miR-146a/b的表达进而下调TRAF6的蛋白水平，这一机制为肝肿瘤发生发展的机理研究提供了重要线索。
关键词: miR-146a/b     PI3K/AKT     IRAK1     TRAF6    
MiR-146a/b Expression and Related up and Down-stream Regulatory Mechanisms in Human Hepatoma Cells
DONG Jian-yi , WANG Xin-xin , WANG Kang-wei , CHEN Jun , LI Hui-ling , WANG Fu-jin , WANG Ai-guo , WANG Jing-yu     
Laboratory Animal Center, Dalian Medical University, Dalian 116044, China
Abstract: Objective To investigate the expression of miR-146a/b and related upstream regulatory mechanisms and downstream target proteins in human heptoma cells. Methods The proliferation activities of the normal human hepatocyte cell line LO2 and human heptoma cell lines HepG2 and Hep3B were assayed by MTT. Total RNA and protein were extracted from the cells and the miR-146a/b levels were detected by RT-qPCR and protein levels of p-ERK, ERK, p-AKT, IκB, IRAK1, and TRAF6 were detected by Western blot. The activities of PI3K, ERK, AKT, and NF-κB signaling molecules were inhibited in Hep3B cells, respectively, and the corresponding expression levels of miR-146a/b and protein levels of IRAK1 and TRAF6 were detected. Results The order of proliferation activities were Hep3B > HepG2 > LO2. Compared to LO2 and HepG2 cells, the expression levels of miR-146a and miR-146b increased significantly in Hep3B cells (P < 0.01). Compared to LO2 cells, the expression levels of miR-146a decreased significantly in HepG2 cells (P < 0.001). In Hep3B cells, the protein levels of p-ERK1, ERK1, p-AKT, IκB increased 10.87, 24.68, 6.67 and 1.92 times of LO2 cells, respectively; and the protein levels of IRAK1 and TRAF6 decreased 0.23 and 0.003 times of LO2 cells, respectively. In HepG2 cells, the protein levels of IκB and IRAK1 increased 4.46 and 2.69 times of LO2 cells, respectively. In Hep3B cells, inhibition of PI3K and AKT activity significantly reduced the expression levels of miR-146a/b at 12 h and 24 h (P < 0.05). Inhibition of ERK and NF-κB activity had no effect on the expression levels of miR-146a/b at 12 h and 24 h. Inhibition of PI3K, AKT, ERK, and NF-κB signaling molecular activities elevated the TRAF6 and decreased the IRAK1 protein levels. Conclusions PI3K/AKT signaling pathway down-regulates the protein levels of TRAF6 by up-regulating the expression levels of miR-146a/b in Hep3B cells. This mechanism provides valuable clue for researches on hepatocellular carcinogensis.
Key words: miR-146a/b     PI3K/AKT     IRAK1     TRAF6    

microRNA (miRNA)是一种内源性非编码小分子RNA，由18~22个核苷酸组成，通过与靶mRNA的碱基互补配对，抑制靶mRNA翻译或促使其降解来调控基因的表达[1]。目前已发现约1 000个miRNA [2]，涉及癌症生物学的各方面，参与肿瘤的发生发展，发挥癌基因或抑癌基因的功能[3]。

miR-146a/b是NF-kB的重要下游靶基因，NF-κB的激活可促进miR-146a/b表达，进而下调其靶蛋白TRAF6和IRAK1的表达，负反馈抑制NF-κB的活性[4]。这一负反馈机制不仅在免疫细胞的分化和生物学功能等方面具有至关重要的调控作用，而且在多种类型的疾病以及肿瘤中也发挥重要功能[4-5]。有研究表明，miR-146a/b在乳腺癌和前列腺癌肿瘤中低表达，上调miR-146a/b的表达可抑制这些肿瘤细胞的侵袭和转移[6-7]。但在甲状腺和口腔癌中，miR-146a/b呈显著的高表达，下调miR-146a/b的表达显著抑制了这些肿瘤细胞的增殖[8-10]。另外，miR-146a/b-NF-κB负反馈机制并不适用于所有的细胞[11]。因而，miR-146a/b在不同类型的肿瘤细胞中的作用机制还有待于深入研究。

目前，miR-146a/b在肝癌中作用机制的研究文献较少，并存争议。Huang等[12]发现miR-146a/b仅在肝癌组织中表达。Gui等[13]研究表明，miR-146a在肝癌患者的血清中显著增多。但另一部分文献显示，与癌旁组织相比，miR-146a/b在肝癌中的表达显著下降[14-15]。并且过表达miR-146a可显著抑制肝肿瘤的侵袭和转移[16]。另外，miR-146a基因的多态性也与肝肿瘤相关[17]。本研究应用人正常肝细胞株LO2和人肝癌细胞株HepG2和Hep3B探讨了miR-146a/b表达及其在Hep3B细胞中的上游调控信号通路及下游靶基因，为深入阐明miR-146a/b在肝肿瘤中的作用机制提供了重要线索。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 细胞株

人类正常肝细胞LO2购于上海雷蒂生物科技发展有限公司，肝癌细胞株HepG2、Hep3B购于中国科学院细胞研究所。

1.1.2 试剂与仪器

miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒、miRcute miRNA YBR Green、TRIzol试剂购自天根公司。CCK-8试剂盒、RIPA裂解液、Bradford蛋白浓度测定试剂盒、超敏ECL化学发光试剂盒购于碧云天生物技术有限公司。ERK、p-ERK、p-AKT、IκB抗体购于Cell Signaling公司；IRAK1、TRAF6抗体购自美国Proteintech公司。HRP标记二抗(Anti-rabbit IgG)购自碧云天生物技术有限公司。DMEM培养基购自GIBCO公司；胰蛋白酶-EDTA购自Solarbio公司。NF-κB抑制剂BAY11-7082、PI3K抑制剂LY294002、AKT抑制剂MK2206、Erk抑制剂U0126购自Selleck公司。miR-146a和miR-146b的引物由宝生物工程(大连)有限公司合成，引物序列为：miR-146a，5′-TGAGAACTGAATTCCATGGGTTA-3′；miR-146b，5′-TGAGAACTGAATTCCATAGGCTA-3′。主要仪器：实时PCR扩增仪(ABI StepOneTM)，Gel DocTM EZ成像仪(Bio-RAD)，紫外分光光度计(Nanodrop2000)，倒置显微镜(Nikon TS100)等。

1.2 方法

1.2.1 细胞增殖活性的检测

分别取对数生长期的Hep3B、HepG2和LO2细胞，用0.25%胰酶消化制成2×104/ml细胞悬液。接种于96孔板，100 μl/孔，37℃，5% CO2培养箱孵育。采用CCK-8检测试剂盒分别于培养1h、12h、24h、36h、48h后，酶标仪测定各孔450 nm吸光度值。每个细胞的每个时间点设4个孔重复。加入相同体积细胞培养液的无细胞孔作为阴性对照。细胞增值活力计算方法：增殖倍数=(OD细胞-OD阴性对照)/(OD 1h细胞-OD阴性对照)。

1.2.2 细胞总RNA和蛋白的提取

Hep3B、HepG2、LO2细胞均于含10%胎牛血清DMEM (GIBCO)培养基、37℃、5% CO2饱和湿度下培养。按1×105个/ml细胞密度接种于35 mm直径培养皿内，待细胞生长达到80%~90%融合度时，采用Trizol法提取细胞的总RNA，采用添加磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液提取细胞样本的总蛋白。

1.2.3 细胞信号分子抑制实验

将Hep3B细胞按1×105个/ml细胞密度接种于35 mm直径培养皿内，铺板24 h后，分别采用细胞外信号调节激酶(ERK)抑制剂U0126(10μmol/L)、磷酯酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂LY294002(50μmol/L)、蛋白激酶B (AKT)抑制剂MK2206(3μmol/L)、核转录因子(NF-κB)抑制剂BAY11-7082(10μmol/L)处理细胞，等体积的DMSO作为对照。在不同时间点分别提取细胞的总RNA和蛋白质进行后续实验。实验重复3次。

1.2.4 cDNA的制备及RT-qPCR检测

应用miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒合成miRNA的cDNA。采用miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒检测miR-146a/b的表达水平。具体操作流程严格按试剂盒和仪器说明书执行。

1.2.5 免疫印迹检测

用Bradford蛋白浓度测定试剂盒对蛋白浓度进行定量。将30 μg的蛋白样品在12%的SDS-PAGE进行分离并转膜，5%脱脂奶粉封闭后，分别加入ERK (1:2 000)、p-ERK (1:1 000)、p-AKT (1:1 000)、IκB (1:800)、IRAK1(1:500)、TRAF6(1:800)一抗，4℃孵育过夜。1×TBST洗膜后，分别加入HRP标记山羊抗兔二抗(1:5 000)，37℃孵育l h，洗膜后用超敏ECL化学发光试剂盒显影。

1.2.6 统计学方法

实验所得数据采用SPSS17.0统计软件包进行统计分析。定量资料均以平均值±标准误(x±s)表示，Shapiro-Wilk法检验数据符合正态分布，计量资料多组间差异采用完全随机设计方差分析，根据Levene方差齐性检验，组间两两比较采用LSD检验分析。两组间计量资料差异比较采用t检验。检验水准α=0.05。

2 结果 2.1 MTT法检测细胞增殖活力

如图 1和表 1所示，MTT检测结果显示，细胞株Hep3B、HepG2和LO2的增殖活力具有明显差异，增殖活力的大小依次顺序为Hep3B > HepG2 > LO2。在24~48 h的增殖倍数相互比较具有显著差异，P < 0.001。这一结果表明Hep3B是恶性化程度较高的细胞。

图 1 MTT法检测细胞增殖活力 Figure 1 The cell proliferation activity detected by MTT assay
图选项
表 1 MTT法检测细胞增殖活力 Table 1 The cell proliferation activity detected by MTT assay
1 h 12 h 24 h 36 h 48 h
L-02 1.00±0.14a 0.91±0.19a 1.56±0.12a 3.91±0.44a 8.76±0.22a
HepG2 1.00±0.26a 1.18±0.47a 2.59±0.44b 4.51±0.38b 16.61±1.59b
Hep3B 1.00±0.12a 0.98±0.22a 3.20±0.39c 7.20±0.73c 19.86±0.69c
F value 0.00 1.02 28.16 53.05 159.90
P value 1.00 0.39 < 0.001 < 0.001 < 0.001
Note: The letters in right up corner indicate the difference among the same column. The same letter indicates no significant difference between two groups (P>0.05).The different letters indicate significant difference between two groups (P < 0.05)
表选项

2.2 RT-qPCR检测细胞miR-146a/b表达水平

RT-qPCR结果显示，与人正常肝细胞株L02(19.54±2.93)和肝癌细胞株HepG2(2.87±1.24)细胞相比，肝癌细胞株Hep3B (336.66±36.26)的miR-146a mRNA表达水平显著增高，差异有统计学意义，F=240.20，P < 0.01；与L02相比，HepG2的miR-146amRNA表达水平显著下降，差异有统计学意义，t=9.05，P < 0.001(图 2A，C)。与L02(6.99±1.47)和HepG2(7.26±2.04)相比, Hep3B (206.57±15.00)的miR-146b mRNA显著升高，差异有统计学意义，F=515.78，P < 0.001，但L02和HepG2之间没有显著变化，差异无统计学意义，t=1.19, P=0.858(图 2B，C)。这一结果表明，miR-146a/b在Hep3B细胞中的高表达可能与其高恶性化程度相关。

图 2 RT-qPCR检测细胞miR-146a/b的表达水平 Figure 2 The expression level of miR-146a/b in cells detected by RT-qPCR
图选项
2.3 Western blot检测信号通路蛋白分子的表达水平

结果如图 3所示，肝癌细胞Hep3B与人正常肝细胞L02相比，p-ERK1、ERK1、p-AKT、IKB的蛋白水平明显升高，分别为L02的10.87、24.68、6.67、1.92倍；p-ERK2、ERK2的蛋白水平没有明显变化，分别为L02的0.95、1.39倍；IRAK1、TRAF6的蛋白水平明显减少，分别为L02的0.23、0.003倍。肝癌细胞HepG2与L02相比，p-ERK1、p-ERK2、ERK1、ERK2、p-AKT、TRAF6的蛋白水平没有明显变化，分别为L02的1.00、0.87、1.00、1.21、1.45、0.81倍；而IKB、IRAK1明显升高，分别为L02的4.46、2.69倍。这一结果表明，Hep3B细胞中ERK、AKT、NF-κB信号通路的高活化状态以及IRAK1和TRAF6表达水平的显著下降可能与其高恶性化程度相关。

图 3 细胞株蛋白表达水平的检测 Figure 3 The expression levels of proteins in hepatoma cells detected by Western blot
图选项
2.4 信号通路对Hep3B细胞miR-146a/b表达水平的影响

结果如图 4所示，与对照组相比，PI3K抑制剂LY294002处理后12 h和24 h，miR-146a和miR-146b的表达水平显著下降，统计量分别为F=49.32，P < 0.001和F=18.97，P=0.003。AKT抑制剂MK2206处理后12 h和24 h，miR-146a和miR-146b的表达水平显著下降，统计量分别为F=13.86，P=0.006和F=6.21，P=0.03。U0126分别抑制ERK活性12 h和24 h，miR-146a/b表达均没有显著变化，统计量分别为F=0.54，P=0.60和F=0.39，P=0.68；BAY11-7082分别抑制NF-κB的活性12 h和24 h，miR-146a/b表达水平没有显著变化，统计量分别为F=2.65，P=0.12和F=0.86，P=0.45。这一结果表明，在Hep3B细胞中，PI3K/AKT信号通路对miR-146a/b的表达具有显著的促进作用，而ERK和NF-κB信号通路对miR-146a/b的表达没有显著影响。

图 4 信号通路对miR-146a/b表达水平影响的检测 Figure 4 The expression levels of miR-146a/b influenced by signaling pathways LY294002: PI3K inhibitor (50μmol/L); MK2206:AKT inhibitor (3μmol/L); U0126: ERK inhibitor (10μmol/L); BAY11-7082: NF-κB inhibitor (10μmol/L); Co: Control cells treated by same volume of DMSO. ** :P < 0.01
图选项
2.5 信号通路对Hep3B细胞IRAK1和TRAF6蛋白表达水平的影响

结果如图 5所示，与对照相比，PI3K抑制剂LY294002处理Hep3B细胞后48 h，IRAK1的蛋白表达水平明显降低，而TRAF6明显升高。AKT抑制剂MK2206处理Hep3B细胞后48 h，IRAK1的蛋白表达水平明显降低，而TRAF6在24 h和48 h明显升高。ERK抑制剂U0126或NF-κB抑制剂BAY11-7082处理Hep3B细胞后24 h和48 h，IRAK1的蛋白表达水平明显降低，而TRAF6明显升高。这一结果表明，在Hep3B细胞中，IRAK1和TRAF6的蛋白水平受多个信号通路的调控。其中仅TRAF6与PI3K/AKT抑制剂处理的miR-146a/b的表达趋势相反，表明TRAF6可能是miR-146a/b的忠实靶基因。

图 5 信号通路对IRAK1和TRAF6蛋白表达水平的影响 Figure 5 The protein levels of IRAK 1 and TRAF6 influenced by signaling pathways LY294002: PI3K inhibitor (50μmol/L); MK2206:AKT inhibitor (3μmol/L); U0126: ERK inhibitor (10μmol/L); BAY11-7082: NF-κB inhibitor (10μmol/L); Co: control cells treated by same volume of DMSO
图选项
3 讨论

miR-146a/b在肝癌中的作用存在诸多争议[5-9]。我们的数据表明，与人正常肝细胞株L02相比，人肝癌细胞Hep3B中的miR-146a/b表达水平显著升高, 而HepG2中的miR-146a表达水平却显著下降，miR-146b的表达没有显著变化(图 2)。以上数据说明了不同肝肿瘤细胞中miR-146a/b功能的复杂性。

本文首次发现PI3K/AKT信号通路对miR-146a/b的表达具有显著的促进作用。与L02相比，HepG2的miR-146a/b表达没有升高，AKT信号分子的活化水平也没有显著变化。但Hep3B的miR-146a/b显著增多并伴随着AKT信号分子的显著激活(图 2，图 3)。进一步实验结果表明，抑制PI3K和AKT信号分子的活性显著抑制了miR-146a/b的表达(图 4)。可见，PI3K/AKT信号通路的激活是促进miR-146a/b表达的重要因素。这一现象还未见报道。但活化的AKT可通过磷酸化其下游信号分子抑制或激活众多的下游信号通路，并通过这些通路调控众多基因的表达。其典型的下游通路包括NF-κB、ERK、C-MYC、叉头样转录因子(Forkhead-Related Transcription Factor，FKHR)、p70S6K1、HDM2等[18]，因此PI3K/AKT调控miR-146a/b表达的详细机制还有待于进一步梳理和深入研究。

在本研究中，我们进一步探究了ERK和NF-κB通路对miR-146a/b表达的影响作用。结果表明，虽然与L-O2和HepG2细胞相比，Hep3B细胞miR-146a/b的高表达伴随着ERK活化水平的显著升高，但抑制ERK的活性没有影响miR-146a/b的表达水平(图 2，图 3，图 4)。可见，ERK不是Hep3B细胞中调控miR-146a/b表达的重要信号分子。对于NF-κB信号通路，与L02相比，HepG2的IκB蛋白表达明显升高伴随着miR-146a表达的显著下降(图 2，图 3)，提示NF-κB信号通路的激活可能对miR-146a的表达有促进作用。而L-O2和Hep3B的IκB蛋白表达没有显著变化，抑制Hep3B的NF-κB信号通路也没有显著影响miR-146a/b的表达水平(图 3，图 4)。可见，不同肝癌细胞中，NF-κB信号通路对miR-146a/b表达的影响作用不同。

虽然IRAK1和TRAF6被认为是miR-146a/b的忠实靶基因[5-7]，但肝细胞中还未见相关报道。我们的数据表明，与L-O2相比，Hep3B细胞miR-146a/b的高表达伴随着IRAK1和TRAF6蛋白水平的显著降低(图 2，图 3)，提示在Hep3B细胞中IRAK1和TRAF6可能是miR-146a/b的靶基因。而HepG2细胞miR-146a的低表达伴随着IRAK1蛋白水平的显著升高，但TRAF6蛋白水平没有显著变化(图 2，图 3)，提示在HepG2细胞中IRAK1可能是miR-146a的忠实靶基因。但进一步的实验数据表明，在Hep3B细胞中，分别抑制PI3K、AKT、ERK、NF-κB信号通路，均下调了IRAK1的蛋白水平和上调了TRAF6的蛋白水平(图 5)，说明IRAK1和TRAF6受多个通路的调控。特别是，TRAF6蛋白的表达水平与miR-146a/b的表达变化趋势相反，而IRAK1蛋白的表达水平与miR-146a/b的表达变化趋势相同(图 5)，提示在Hep3B细胞中TRAF6可能是miR-146a/b的忠实下游靶基因。可见，在肝肿瘤细胞系中，miR-146a/b与IRAK1和TRAF6之间的相互作用关系尚需进一步明确。

虽然miR-146a和miR-146b的基因序列和功能相似，但位于基因组的不同染色体上。我们注意到，在Hep3B细胞中，miR-146a和miR-146b的表达变化是一致的(图 2)，说明这两个基因的表达调节机制相似。但在HepG2细胞中，miR-146a和miR-146b的表达变化却不相同(图 2)，又提示两者的表达有不同的调控机制。这些现象说明了不同细胞中miR-146a和miR-146b表达调节的复杂性。

另外，有研究表明，Hep3B细胞较HepG2细胞的恶性程度更高[19]，这与我们的细胞增殖检测结果一致(图 1)。与HepG2细胞相比，Hep3B细胞的高增殖活性伴随着的ERK、AKT信号通路激活及miR-146a/b的高表达和IRAK1和TRAF6的低表达(图 2，图 3)，提示这些通路可能与Hep3B细胞的恶性程度相关。特别是，miR-146a/b表达水平的显著升高有可能成为肝癌细胞恶性程度的新标志物。

综上所述，miR-146a/b在肝肿瘤细胞中的作用机制尚待进一步研究。但在Hep3B细胞中，PI3K/AKT信号通路对miR-146a/b表达的显著调控作用为部分肝癌细胞的发生机制研究提供了新线索。

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miR-146a/b在Hep3B细胞中的表达及上下游调控机制探讨
董建一 , 王欣欣 , 王康伟 , 陈军 , 李慧玲 , 王福金 , 王爱国 , 王靖宇