2016, Vol. 36文章信息
- 李达, 代鹏, 王伟, 张文涛, 汪钦, 束毅, 祝春来, 纪奇峰, 梁平, 颜真.
- LI Da, DAI Peng, WANG Wei, ZHANG Wen-tao, WANG Qin, SHU Yi, ZHU Chun-lai, JI Qi-feng, LIANG Ping, YAN Zhen.
- PLCE1基因及rs2274223和rs3765524单体型的克隆与表达
- Cloning and Expression of PLCE1 Gene and Its Haplotypes of rs2274223 and rs3765524
- 中国生物工程杂志, 2016, 36(12): 1-7
- China Biotechnology, 2016, 36(12): 1-7
- http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20161201
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文章历史
- 收稿日期: 2016-09-18
- 修回日期: 2016-10-11
磷脂酶C-ε1(phospholipase C epsilon-1，PLCE1)是磷脂酶C家族新成员，其编码基因位于染色体10q23，主要通过不同的剪接方式编码两种异构体蛋白，分别为PLCE1a和PLCE1b，它们分别含2302和1994个氨基酸[1]。近年来研究表明，PLCE1基因与皮肤肿瘤[2]、胃癌和食道癌[3-5]的发生和发展密切相关。本课题组前期采用病例-对照研究的方式，应用MassARRAY质谱芯片技术发现，PLCE1基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，尤其rs2274223和rs3765524两个SNP位点，与中国西北地区汉族人群的胃癌发病密切相关。虽然2010年2个国际团队通过全基因组关联分析(genome-wide association study，GWAS)报道了PLCE1基因多态性与胃、食道癌的关系[6-7]，然而SNP与胃癌发生发展的分子机制尚待阐明。研究SNP与肿瘤遗传易感性的关系，对于揭示肿瘤的发生发展机制具有十分重要的作用。本课题拟构建PLCE1 rs2274223和rs3765524单体型真核表达重组载体，为研究PLCE1及其rs2274223和rs3765524多态性参与胃癌发生发展过程的相关机制奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料E.coli DH5α菌种、HEK-293T细胞由本实验室保存；真核表达载体为重组pcDNA3.0-Flag，由山东大学癌症中心馈赠；点突变试剂盒(Mut express fast mutagenesis kit V2)、反转录试剂盒[Hiscript qRT supermix for qPCR (+gDNA wiper)]、qPCR试剂盒(Chamq SYBR qPCR master mix)购自Vazyme公司；转染试剂DNAfectin购自Applied Biological Materials公司；In-Fusion HD Cloning试剂盒购自Clontech公司；PrimeSTAR GXL DNA聚合酶、DNA Marker购自TaKaRa公司；去内毒素质粒小提试剂盒、DNA纯化回收试剂盒、蛋白marker购自生工生物工程上海(股份)有限公司；SDS-page试剂盒、BSA封闭液、5×蛋白上样缓冲液购自上海康城生物技术有限公司；RNA提取试剂盒购自陕西先锋生物科技有限公司；硝酸纤维素(NC)膜、PLCE1抗体购自Millipore公司；Flag抗体、β-Actin抗体、山羊抗兔和山羊抗鼠二抗购自Abbkine公司；化学发光显色试剂盒购自ZETA公司；RPMI1640培养基购自Gibco公司；胎牛血清购自Biological Industries公司；青链霉素混合液(100×)购自Solarbio公司；6孔细胞培养板购自Corning公司。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养用含10%胎牛血清且含1×青链霉素混合液的RPMI1640培养基将HEK-293T细胞培养于37℃和5%CO2的细胞培养箱。
1.2.2 PCR引物用Primer Premier 5.0软件设计PLCE1的分段扩增引物、实时定量检测引物，以及β-actin引物；CE Design V1.03软件设计点突变引物。委托生工生物工程上海(股份)有限公司合成引物。引物序列如表 1所示。
| 引物名称 | 引物序列(5′-3′) | 备注 |
| In-fusion-F | ATCACACTGGCGGCCGCGATGACTTCTGAAGAAATGAC | 融合克隆，构建表达载体 |
| In-fusion-R | AATAGGGCCCTCTAGATCACTGTCGGTAATCCATTGTGTC | |
| F-F | CACTGGCGGCCGCATGACTTCTGAAGAAATGAC | 克隆PLCE1基因第一段 |
| F-R | GCAGGAACTGGTGCACATCGGCTTGGATGGACAG | |
| S-F | CCGATGTGCACCAGTTCCTGC | 克隆PLCE1基因第二段 |
| S-R | CCTTCAAATGACATTAGTCCCTGATGAC | |
| T-F | GTCATCAGGGACTAATGTCATTTGAAGG | 克隆PLCE1基因第三段 |
| T-R | CAGAGGCATGCCCAGGACGTC | |
| F′-F | CCTGGGCATGCCTCTGGACAGC | 克隆PLCE1基因第四段 |
| F′-R | GTGCTCTAGATCACTGTCGGTAATCCATTGTGTC | |
| 5330-F | GAAACTGAcCCAGCACACCGCCTGTCA | rs3765524位点定点突变 |
| 5330-R | TGTGCTGGgTCAGTTTCTGAGAATACCTGCGAC | |
| 5780-F | TCTGTTCCaCGTTCACTTCGAAGATCTTGTATTTC | rs2274223位点定点突变 |
| 5780-R | AGTGAACGtGGAACAGAAACTGCTCGTTCCA | |
| F R |
CCAATCCAAGCGACTATGTGC TCCACTTGCTTTGGGCTTGA |
PLCE1实时定量引物 |
| Actin-F Actin-R |
CACGAAACTACATTCAATTCCATC CAGAGCAGTGATCTCCTTCT |
β-actin实时定量引物 |
1.2.3 RNA提取及反转录
用RNA提取试剂盒提取HEK-293T细胞的总RNA，并测浓度，-80℃保存备用；取500ng总RNA，按去gDNA反转录试剂盒说明书配制反应体系，合成cDNA。
1.2.4 PCR扩增按PrimeSTAR GXL DNA聚合酶说明书，配置PCR反应体系，进行如下反应程序：95℃ 5 min；95℃ 1 min，退火1 min, 72℃ 2~5 min (根据扩增片段长度设置)，共30个循环；72℃ 10 min；4℃保存。琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增结果，DNA测序验证，DNA纯化回收试剂盒回收序列正确的DNA扩增片段，-20℃保存备用。
1.2.5 细胞转染取对数生长期的HEK-293T细胞，制成10万个/ml的单细胞悬液，每孔2 ml，铺于六孔板，培养过夜；用200 μl培养基稀释2μg质粒，并加入6 μl转染试剂，上下吹打混匀，室温孵育30 min，并将转染混合物逐滴加入六孔板内，培养24 h后检测PLCE1的表达。
1.2.6 实时定量PCR按实时定量PCR试剂盒说明书在冰上配制20 μl反应体系，进行如下反应程序：95℃ 3 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，反应40个循环。结果用2-△△CT表示。
1.2.7 Western blot (WB)吸弃旧培养基，加1 ml含蛋白酶抑制剂混合物的PBS，刮取细胞并300×g离心5 min，收取细胞沉淀，加RIPA裂解液适量，冰上裂解30 min，12 000 r/ min，离心5 min，收取上清，BCA法进行蛋白定量；取20 μg总蛋白经SDS-Page电泳分离(6%分离胶)，转膜(100 V，3 h)，BSA封闭液封闭1h，分别用抗PLCE1抗体(1:500)、Flag (1:3 000)标签抗体和β-actin抗体(1:3 000)杂交，4℃过夜，TBST洗膜3次后分别室温孵育相应二抗1 h，TBST洗膜3次后用化学发光试剂盒显色并检测。
1.2.8 统计学方法采用SPSS 18.0统计软件对实验数据行进行统计学分析，计量资料以均值±标准差表示，多组间均值比较采用One-way ANOVA，两两比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.01。
2 结果 2.1 PLCE1基因扩增与真核表达载体构建因为PLCE1基因开放阅读框长达6 909 bp (参考序列NM_016341.3)，为了增加克隆的成功率，我们采用了重叠延伸PCR (gene splicing by overlap extension PCR，SOE-PCR)技术分段扩增PLCE1基因全长，设计方案模式见图 1。通过PCR，我们从培养的HEK-293T细胞中分别扩增出了PLCE1的4个目的片段，并用DNA测序验证。利用SOE-PCR技术，我们分别连接第二、三段形成五段，加入第四段形成第六段，再加入第一段，从而成功获得全长目的基因PLCE1(图 2)。然后通过In-Fusion技术扩增PLCE1基因全长，Not I和Xba I酶切pcDNA3.0-Flag载体，同源重组的方式将线性化的空载体与PLCE1基因进行重组、DNA测序。Blast分析显示，我们扩增的PLCE1与参考序列PLCE1 transcript variant1(NM_016341)序列匹配程度达到99.7%，其中有2个同义点突变、3个错义点突变(分别为rs2274224，rs3765524和rs2274223)，以及一段18bp的插入序列。并且证实我们所获基因为PLCE1 rs2274223G-rs3765524T单体型真核表达重组载体，因为GT基因型在亚洲人种的频率很低，我们将其命名为PLCE1 Minor，其编码的氨基酸序列如图 3中PLCE1 Minor.pro所示。
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| 图 1 PLCE1基因分段扩增模式 Figure 1 Pattern diagram of PLCE1 gene segmented amplification |
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| 图 2 PLCE1基因分段扩增电泳 Figure 2 Agarose gel electrophoresis of amplified segments of PLCE1 M: DNA marker; 1~7 represent the first to seventh segments of PLCE1 gene respectively |
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| 图 3 PLCE1编码氨基酸序列及部分DNA序列比对 Figure 3 Alignments of PLCE1 encoded a mino acid and partial DNA sequences A：Alignments of partial encoded a mino acid sequences of PLCE1 mRNA transcript variant1 in NCBI database with PLCE1 Major and PLCE1 Minor. The a mino acid sequences in black are in complete agreement with the one encoded by PLCE1 mRNA transcript variant1.The gray box at 1185~1190bp represents 6 inserted a mino acid residues (RPCLCC); The differences at 1575, 1777 and 1927 represent the rs2274224R>P, rs3765524T>I and rs2274223H>R SNPs respectively. B: Alignments of the 18bp insert of PLCE1 Minor with PLCE1 DNA sequence (NG015799.1) in NCBI database and 3 PLCE1 mRNA transcript variants (NM_016341, NM_001165979, NM_001288989). It displays that the insert comes from different splicing of PLCE1 |
经过分析PLCE1基因序列的开放阅读框，我们发现所构建的PLCE1真核表达载体能够正确转录和翻译(图 3)，与NCBI收录PLCE1转录本1的参考序列(NM_016341)进行比较，发现PLCE1各个结构域正确，rs3765524和rs2274223两个SNP位点所在密码子编码的氨基酸分别由野生型的苏氨酸(T)变为异亮氨酸(I)、组氨酸(H)变为精氨酸(R)。但与该参考序列不同的是，我们克隆的PLCE1的氨基酸序列第1 575位点由精氨酸(R)变为脯氨酸(P)，该位点对应PLCE1基因的另一个SNP (rs2274224)。另外，我们所扩增的PLCE1比参考序列NM_016341在编码区3 554~3 572bp处有18bp插入序列编码的氨基酸RPCLCC。经查找分析，插入序列来源于PLCE1基因组DNA序列(NG_015799.1)第269 794~269 811bp处，位于PLCE1第11内含子，并与第12外显子紧邻。因此我们推断该转录本属于PLCE1的一种新的剪接异构体。
2.2 PLCE1 rs2274223A-rs3765524C (PLCE1 Major)单体型构建前期研究发现在胃癌组织样本中rs2274223和rs3765524两个SNP位点具有高度连锁的关系，因此我们拟研究PLCE1 rs2274223和rs3765524对PLCE1的表达和功能的影响，从而进一步揭示其在胃癌等肿瘤中的作用。我们在结果2.1的基础上，应用基因双点突变技术，以构建成功的PLCE1 rs2274223G-rs3765524T (PLCE1 Minor)为模板，用5330F-5780R和5780F-5330R两对引物分两段扩增PLCE1 Minor载体(图 4)，关键位点的DNA序列如图 5；Dpn I内切酶去除甲基化模板，最后经同源重组成环的方法，获得了序列正确的单克隆PLCE1 rs2274223A-rs3765524C单体型重组真核表达载体，并命名为PLCE1 Major，其编码氨基酸序列如图 3中PLCE1 Major.pro所示。
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| 图 4 PLCE1 Major重组表达载体构建的基因扩增电泳 Figure 4 Agarose gel electrophoresis of amplified segments of PLCE1 Major expression vector M1 and M2 represent DNA marker DL15000 and DL2000 respectively；1 and 2 represent the longer (11.9 kbp) and shorter (450 bp) amplified segments of PLCE1 Major respectively |
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| 图 5 PLCE1 Minor (A)和PLCE1 Major (B)基因型鉴定序列图 Figure 5 DNA sequencing of PLCE1 Minor (A) and PLCE1 Major (B) |
将构建的重组真核表达载体PLCE1 Minor (Min)和PLCE1 Major (Maj)分别转染HEK-293T细胞，检测PLCE1基因的表达，同时设立空载体对照组(Vector)。转染24 h后，分别提取细胞总RNA进行实时定量PCR分析mRNA转录水平，提取总蛋白进行WB分析蛋白质表达水平。如图 6所示，与Vector组比较，Min组和Maj组中PLCE1的mRNA和蛋白表达显著增加(P < 0.01)。不仅证明了我们构建的PLCE1重组表达载体都能够正确转录和翻译，还发现PLCE1基因表达水平在Maj组和Min组有显著差异(P < 0.01)，Min组的表达明显高于Maj组，提示rs3765524T和rs2274223G多态性及其基因型能够影响PLCE1基因自身的表达水平。
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| 图 6 PLCE1重组基因的转染与表达 Figure 6 Recombinant PLCE1 gene transfection and expression A：mRNA level detected by qPCR in HEK-293T cells 24h after transfection. n=3 for each group.** : P < 0.01 B：Protein expression detected by Western blotting in HEK-293T cells 24h after transfection. Vector: mock plasmlid; Maj: PLCE1 Major; Min:PLCE1 Minor |
与PLC其它家族成员相比，PLCE1具有独特的RA和CDC25结构域，能够被Ras家族成员激活，并持续水解PIP2等产生大量的第二信使，参与多种信号通路的调节[8]。已有的研究报道PLCE1基因多态性与多种肿瘤的易感性密切相关，特别是食道癌[9-10]、胃癌[11-13]等消化道癌症。有研究者通过Meta分析发现PLCE1 rs3765524和rs2274223多态性与胃癌易感性相关，且rs3765524T和rs2274223G都能独自增加胃癌易感性[14]；又有人发现rs2274223G-rs3765524T-rs7922612C、rs2274223A-3765524C-7922612T和rs2274223G-3765524C-7922612T等单体型在克什米尔地区的胃癌人群中的频率较高[15]，由此我们推断不同的SNPs连锁后可能发挥不同的作用，即使是保护性SNP连锁后也可能增加癌症的易感性；另外，虽然大多数学者发现PLCE1 rs2274223G能增加胃癌患病风险，但是Luo等发现PLCE1 rs2274223与胃癌患者的良好预后相关，即rs2274223G可以降低胃癌患者的死亡风险[16]。以上研究提示某些SNP的存在可能影响PLCE1的功能，并可能影响胃癌的发生。然而这种风险因素的作用机制尚未阐明。现阶段，相关研究对SNPs的认识尚有局限，缺乏功能研究。在前期研究中我们发现西北地区汉族人rs2274223和rs3765524在癌症样本中具有高度的连锁现象，主要可以形成4种单体型，其中rs2274223G-rs3765524T单体型与胃癌风险显著相关。因此我们构建了PLCE1 rs2274223G-rs3765524T (PLCE1 Minor)和PLCE1rs2274223A-rs3765524C (PLCE1 Major)单体型真核表达重组载体，为揭示基因多态性和单体型对基因表达和功能的影响奠定基础。
SOE-PCR通过末端部分互补引物产生重叠链，最后通过重叠链将不同片段连接起来，获得全长产物或者重组产物。这一技术获得成功的关键是引物设计，特别要考虑引物重叠长度是否利于扩增以及有效扩增。实验中，我们设计将PLCE1基因分割成容易获得的四段，每段引物之间给予充分的重叠序列(15 bp-30 bp)经过三次融合后成功获得全长基因。在构建PLCE1 Major单体型真核表达重组载体时需要创建2个突变位点，传统的分别突变法不仅费时，还容易导致随机突变产生。我们在实验中采用了限制性核酸内切酶DpnⅠ酶切后同源重组的方法，因为DpnⅠ酶能够特异性识别并切断腺嘌呤甲基化的GmATC序列，不能识别和切割未甲基化的GATC序列。根据这一特性，我们可以在需要突变的多个位点上同时设计突变引物，以PLCE1 Minor质粒为模板，用高保真DNA聚合酶进行PCR反应，最后用DpnⅠ酶切除原始的甲基化模板，获得未甲基化的质粒片段，并经同源重组后，直接用于转化感受态细菌，得到突变的质粒，整个过程操作简单。从实验过程来看，甲基化的模板是关键，一般使用从DH5α等dam+大肠杆菌中抽提的质粒用于定点突变的模板。
NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)已经收录了3条人类PLCE1基因的转录序列(NM_016341、NM_001165979和NM_001288989)。将它们编码的氨基酸序列和本实验扩增的PLCE1 Minor基因编码的氨基酸序列比对分析，发现PLCE1 Minor基因编码的氨基酸序列与NM_016341和NM_001165979编码的序列存在6个连续氨基酸(RPCLCC)的差别，而与NM_001288989编码的序列存在22个连续氨基酸(RPVSSPVLSSSNKSPSRPCLCC)的差别，这种差别来源于该基因内含子的不同剪切方式。由此可见，我们扩增获得了一种新的PLCE1转录本，其所编码的氨基酸序列可折叠成一种新的PLCE1异构体存在于机体内，该异构体的生物学功能尚待进一步研究。对于PLCE1异构体研究的文献非常少，其中Sorli等[1]发现PLCE1异构体1和2(PLCE1a和PLCE1b)在不同的组织及不同的细胞系中有差异表达，但尚没有发现两种异构体在功能上的明显差异。
通过基因转染，我们发现PLCE1 Minor比PLCE1 Major能显著提高PLCE1基因的表达量，说明PLCE1 rs2274223 A/G和rs3765524 C/T多态性及单体型能对自身基因的表达产生影响。虽然Wang等[17]已经发现rs2274223位点等位基因G (AG或GG)能够提高食管癌组织和食管癌细胞系PLCE1 mRNA和蛋白质表达水平并提高PLCE1酶活性，但他们的研究结果基于不同的食管癌细胞系，并不能排除不同细胞系中PLCE1基因其他位点的突变，以及其他PLC家族成员对最终结果的影响。可见，PLCE1 SNP与基因表达及其功能的关系亟待阐明。
综上所述，我们从HEK-293T细胞中成功克隆了人PLCE1 cDNA，并证实其属于PLCE1一种新的转录本。成功构建了PLCE1 rs2274223和rs3765524两种单体型真核重组表达载体，发现PLCE1 Minor单体型能够促进自身mRNA和蛋白质表达。实验结果为进一步研究PLCE1SNP与癌症易感性的关系奠定了基础。
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