胆固醇(5-胆甾烯-3β-醇，cholesterol)又称为胆甾醇，化学式为C₂₇H₄₆O，属于类固醇，是一种重要的甾体化合物，它在微生物的作用下可以转化成4-胆甾烯-3-酮。4-胆甾烯-3-酮(4-cholesten-3-one)又称为胆甾烯酮，化学式为C₂₇H₄₄O，可作为减肥食品添加剂或抗高脂血症药物抑制人体内脂肪的积累，用以防止发生肥胖及相应的一些症状^[1]。此外，4-胆甾烯-3-酮也是合成一些药物激素的重要原料或中间体^[2]。

利用生物转化法氧化胆固醇，具有绿色环保、低能耗等特点^[3-4]。近年来，通过微生物的生物转化对甾体化合物进行脱氢、羟化及侧链切割等反应而获得一系列价值高昂的药物制剂或药物中间体^[5-7]。

简单节杆菌(Arthrobacter simplex)是一株重要的工业菌种，可以对甾体化合物进行高效的1、2位脱氢，同时也可利用细胞内的胆固醇氧化酶(EC 1.1.3.6 )将胆固醇转化为4-胆甾烯-3-酮。目前，对于4-胆甾烯-3-酮的生物转化方法很多都限于在微生物培养基中或酶的反应液中添加有机试剂，使其组成双相系统来提高其转化率^[8-9]，虽然这些方法可以使4-胆甾烯-3-酮的转化率有一定的提高，但其生产成本也会进一步增加。

随着简单节杆菌的全基因组测序的完善^[10]，其中的胆固醇氧化酶序列也已公布。本研究利用分子生物学的方法克隆胆固醇氧化酶基因，以简单节杆菌的16S rDNA作为整合位点，使整合后的基因都以多拷贝形式存在于基因组，从而实现简单节杆菌胆固醇氧化酶基因cho的多拷贝过表达，构建可以氧化胆固醇生产4-胆甾烯-3-酮且基因型较稳定的重组菌株。此外，本研究针对胆固醇在水中溶解度低，还对胆固醇投料量、颗粒度及不同促溶剂对胆固醇的转化影响等参数进行了优化。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 工具酶与试剂

限制性内切核酸酶(Cla I、Xba I、EcoR V)、LA Taq Poly DNA Polymerase及其缓冲液、T4 DNA连接酶、质粒DNA提取纯化试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒均为TaKaRa公司产品。胆固醇、4-胆甾烯-3-酮购自Sigma公司。

1.1.2 菌株、质粒和培养基

质粒pTY2(含有氯霉素抗性基因，16S rDNA同源臂)、大肠杆菌DH5α、简单节杆菌11037(Arthrobacter simplex 11037)均由本实验室保存。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖8、玉米浆8、蛋白胨4、KH₂PO₄ 2，pH 7.2。

1.2 方法

1.2.1 pTY2-5332重组质粒的构建

以Arthrobacter simplex 11037基因组DNA为模板，通过特异性引物(上游引物5332F: 5′- CCATCGATATGCACGCAGAAGACCGCG-3′，下划线部分为Cla I酶切位点；下游引物5332R: 5′-CTAGTCTAGATCACGCGGTGGCCTCGGTC-3′，下划线部分为Xba I酶切位点)。PCR扩增胆固醇氧化酶基因cho 5332，扩增片段大小为1 755bp。用限制性内切核酸酶Cla I和Xba I对以上片段和pTY2进行酶切；纯化回收产物经T4连接酶连接，将连接反应混合物转化大肠杆菌株DH5α后，氨苄青霉素(Amp⁺)抗性筛选重组转化子并测序。得到表达载体pTY2-5332。

1.2.2 表达模块整合基因组和转化子筛选

pTY2-5332表达载体测序正确后，利用BamH I 进行线性化。根据文献^[11]的方法用上述片段以Arthrobacter simplex 11037为宿主菌株进行电转化，用含50μg/ml氯霉素的LB培养基筛选，30℃恒温倒置培养2～3天，至长出重组克隆，分别挑取8个单菌落在含氯霉素的LB固体培养基上划线分纯，30℃恒温倒置培养至长出单菌落，挑取单菌落到含氯霉素的LB液体培养基，30℃、200r/min培养至OD₆₀₀约为4，取菌液12 000r/min离心2min，弃上清液收集菌体提取基因组，基因组PCR验证转化子，出现正确大小的目标条带，则证明筛选到了正确的阳性克隆，得到重组菌株。重组菌株重组原理示意图如图 1所示。

1.2.3 重组菌株的生长曲线测定

将菌种接种于50ml液体发酵培养基中，30℃、180r/min条件下振荡培养16h后即为种子液。按接种量2%接种于50ml液体发酵培养基中继续培养，隔2h取样，每个取样点设置3个平行，分光光度计检测600nm下的吸光值，以培养时间和菌液吸光值作图，获得生长曲线。

1.2.4 4-胆甾烯-3-酮的转化

从重组菌斜面培养基上刮取一定量的简单节杆菌放于50ml发酵培养基中，30℃、180r/min培养菌体16h，再以2%的接种量将菌种转接至新鲜的发酵培养基中。当菌体的OD₆₀₀为5.0时，投入底物胆固醇使其终浓度为2g/L，4%的无水乙醇作为助溶剂，发酵24h，期间每隔4h取样。

1.2.5 4-胆甾烯-3-酮的转化率测定

4-胆甾烯-3-酮标准曲线制作：称取10mg的4-胆甾烯-3-酮溶于10ml无水乙醇中，浓度为1mg/ml，然后用无水乙醇稀释成终浓度为4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、12μg/ml、16μg/ml，在241nm处测定吸光值制作产物的标准曲线，进行直线回归，通过计算最终得到直线回归方程。

转化反应完成后，取发酵液200μl，加入600μl的乙酸乙酯，轻微振荡萃取，离心后取上层有机相，晾干并用无水乙醇溶解。紫外分光光度计在241nm处测定吸光值，通过直线回归方程计算出胆甾-4-烯-3-酮的含量，用胆甾-4-烯-3-酮的含量除以胆固醇的投放量即可得到转化率。

1.2.6 转化条件优化

依次对菌体培养时间(14h、16h、18h、20h、22h)、胆固醇颗粒度(胆固醇研磨，分别经40目和120目的筛子过筛)、投料量(1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L)、促溶剂种类(乙醇、甲醇、二氯甲烷、二甲基亚砜和二甲基甲酰胺，添加量为2%)及促溶剂的添加量进行了优化。每个因素的实验都是在上一因素实验确定的最佳条件基础上进行的。

2 结果与分析 2.1 重组质粒pTY2-5332的构建及验证

简单节杆菌基因组中的cho 5332的基因长度为1 755bp，以简单节杆菌基因组DNA为模板进行PCR，产物经1%琼脂糖电泳检测，在2 000bp以下可见有一条明显的特异性条带[图 2(a)]，与目的片段的大小位置相符。将cho 5332基因连接到载体pTY2上，转入E. coli DH5α中，提取重组质粒pTY2-5332，在质粒Xba I处有甲基化现象，故采用EcoR V单切，单切后结果显示有4 000bp和3 000bp左右的条带，与预期大小相符[图 2(b)]。

2.2 重组菌的构建及验证

提取重组菌的基因组DNA，分别以16S rDNA的上下游引物27F和1492R对其进行PCR验证，通过PCR扩增的方式验证目的基因整合位点是否为基因组中的16S rDNA。

PCR检测结果如图 3所示，PCR产物片段大小为4.6kb和1.4kb的DNA条带，而未转化的简单节杆菌中只有一条大小为1.4kb的扩增条带，说明cho 5332已成功整合到简单节杆菌基因组中的16S rDNA位点。

2.3 不同重组菌株生长特性的研究

为了探究16S rDNA的插入失活对重组菌生长的影响，选取3株重组菌分别命名为5332_1、5332_2、5332_3，将重组菌与原始菌按2%的接种量，30℃条件下进行发酵培养，检测600nm下的吸光值，获得生长曲线，结果如图 4所示。

从图 4可以看出，经16S rDNA插入失活的重组菌与原始菌株相比，其生长并没有受到影响。本实验选择5332-1为实验菌株进行后续优化实验。

2.4 4-胆甾烯-3-酮高效转化重组菌的验证

将重组菌及原始菌分别在30℃条件下，以2%接种量发酵培养16h，添加2g/L的胆固醇，分别于4h、8h、12h、16h、20h、24h取样，检测底物的转化情况。实验结果如图 5所示。

当底物浓度为2g/L时，重组菌5332-1在24h以内的转化率明显高于原始菌。重组菌在20h时便可将浓度为2g/L的胆固醇完全转化成为4-胆甾烯-3-酮，而原始菌将胆固醇完全转化需要24h，重组菌将4-胆甾烯-3-酮的转化时间缩短了4h，是原始菌的1.2倍。

2.5 转化条件优化

2.5.1 菌体不同培养时间对胆固醇转化的影响

本实验选择重组菌5332-1按2%的接种量发酵培养14h、16h、18h、20h、22h后添加2g/L胆固醇转化8h，检测不同培养时间对胆固醇转化的影响，实验结果如图 6所示。

适宜的菌体培养时间可以有效的提高底物的转化率。由图 6可见，在发酵过程中，菌体的培养时间对胆固醇的转化率有一定的影响，当培养16h添加胆固醇可以使4-胆甾烯-3-酮的转化率达到最高。随着菌体培养时间的增加，胆固醇的转化率有下降的趋势，其原因可能是，菌体生长到一定状态后，随着培养时间的延长，培养基的营养缺乏及菌体自身的凋亡导致后期转化效率降低。

2.5.2 胆固醇颗粒度对胆固醇转化的影响

胆固醇的颗粒度大小会影响胆固醇的转化率，由于胆固醇的水不溶性，颗粒太大会影响胆固醇与菌体及培养基中胆固醇氧化酶的接触面积，进而影响其转化率。本实验将重组菌按2%的接种量发酵培养16h后，分别添加2g/L经40目和120目筛子过筛的胆固醇转化8h，检测胆固醇颗粒度对胆固醇转化的影响，检测结果如图 7所示。

由图 7可以看出，当胆固醇的颗粒度为120目时，转化率明显高于颗粒度为40目时的胆固醇，所以选择颗粒度为120目的胆固醇来进行生物转化较适宜。

2.5.3 不同投料量对胆固醇转化的影响

底物浓度是影响简单节杆菌转化的因素之一。高浓度的胆固醇会抑制简单节杆菌的生长，使转化率下降，故选择合适的底物浓度尤为重要。本实验将重组菌按2%的接种量发酵培养16h后，分别添加1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L经120目筛子过筛的胆固醇转化8h，检测投料量对胆固醇转化的影响，检测结果如图 8所示。

如图 8所示，随着胆固醇投料的增加，胆固醇的转化率略有上升的趋势，但是在投料3g/L时，转化率开始下降，因此选择胆固醇2g/L为最佳投料量。

2.5.4 促溶剂对胆固醇转化的影响

底物溶解度问题是制约微生物转化的关键问题，因此选择不同的溶剂来促进胆固醇的生物转化。本实验将重组菌按2%的接种量发酵培养16h后添加2g/L经120目筛子过筛的胆固醇，并同时分别添加2%的乙醇(ethanol)、甲醇(methanol)、二氯甲烷(DCM)、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)作为促溶剂转化8h，检测促溶剂对胆固醇转化的影响，检测结果如图 9所示。

由图 9可以看出，添加methanol、DCM和DMSO使转化率降低，可能是这些有机溶剂对菌体毒性较大，微生物的生长受到限制，因而使底物的转化受到影响；ethanol对转化率影响不大；添加DMF可使转化有所提高。

为了进一步提高胆固醇的转化率，本实验将重组菌按2%的接种量发酵培养16h后，添加2g/L经120目筛子过筛的胆固醇，并同时分别添加2%、4%、6%、8%、10%的DMF作为促溶剂转化8h，检测DMF的添加量对胆固醇转化的影响，检测结果如图 10所示。

由图 10可以看出，随着DMF添加量的增加转化率呈现下降趋势，可能是随着DMF浓度的增加，简单节杆菌对有机试剂的不耐受逐渐增强而引起了4-胆甾烯-3-酮转化率的下降。综上所述，添加DMF对胆固醇的转化有一定的影响，在添加量为2%时最为明显，将终浓度为2%的DMF添加培养基中可以使胆固醇转化率提高。

按优化后条件进行胆固醇完全转化实验，结果发现重组菌转化18h后可将2g/L胆固醇完全转化为4-胆甾烯-3-酮(数据未显示)，是未优化前的1.11倍。为胆固醇生物转化的进一步改良提供一定的理论依据。

3 讨论

胆固醇氧化酶(EC 1.1.3.6 )是胆固醇降解途径中的第一个酶，当类固醇环的3β-位置含有羟基基团时可催化类固醇底物的氧化^[12]。它是一种双功能的黄素酶，该酶在一个活性位点可催化两步反应：胆固醇经胆固醇氧化酶生成5-胆甾烯-3-酮和H₂O₂，5-胆甾烯-3-酮进一步异构化生成4-胆甾烯-3-酮作为最后的产物^[13]。此外，在农业上它还能有效抑制鳞翅目等昆虫的生长繁殖，是一种有效的生物杀虫剂^[14]。

核糖体DNA(rDNA)一般以多拷贝的形式存在于基因组上。例如，简单节杆菌、大肠杆菌分别含有6个和7个拷贝数^{[10, 15]}，以rDNA作为同源重组整合位点，整合效率会得到很大的提高，并且能够得到含有不同拷贝数目基因的基因工程菌^[16]。Condon等^[17]的研究认为，若总16S rRNA的量维持一定的平衡，即使一定数目拷贝数rDNA缺失也不会影响菌体的正常生长，因此插入失活掉一定数目的rDNA 操纵元件(rrn)并不会使宿主菌死亡。

为了增加基因拷贝数，同时克服多拷贝质粒容易丢失的问题。本研究采用基因克隆的方法，从简单节杆菌的的基因组上克隆了胆固醇氧化酶，然后通过同源重组的方法插入到了简单节杆菌的16S rDNA位点上，增加了胆固醇氧化酶在基因组上的拷贝。通过质粒上的氯霉素启动子，使得胆固醇氧化酶形成了组成型表达，从而提高了4-胆甾烯-3-酮的转化率，同时也为简单节杆菌的分子改造提供了一定的理论依据。