虾青素是一种橘红色的类胡萝卜素，在自然界的多种水生生物体内都有发现。目前虾青素广泛应用于食品(饲料)、医疗和保健行业(营养品、化妆品)。虾青素具有比玉米黄质、叶黄素、角黄素等其它类胡萝卜素强10倍的抗氧化能力^[1]，特别是在自由基清除能力方面比β-胡萝卜素强38倍、比维生素E强500倍^[2]。因此，虾青素也能够降低与年纪相关的退行性疾病和局部缺血性疾病的发病风险^[3]，还可以预防部分癌症并增强免疫系统^[4-5]，在抗衰老、抗紫外线、增强免疫力、穿越血脑屏障抗氧化抗炎等方面有着显著成效。目前，虾青素主要来源有以下4种^[6]：①人工合成；②甲壳类动物提取；③法夫酵母生产；④雨生红球藻制备。综合考虑提取过程的成本以及相关的生物利用率和安全性^{[4, 7]}，利用雨声红球藻来生产虾青素具有性价比的综合优势，因而近年来从雨生红球藻中提取虾青素获得了越来越多的关注^[8]。

雨生红球藻是一种淡水单细胞绿藻，在氮、磷限制，以及高光强、高温高盐等环境压力下，由于氧化应激开始合成虾青素^[9-14]。作为一种强有力的虾青素生产者，尽管雨生红球藻具有生长速率慢、需光培养等不利条件^[15]，但由于其可以积累很高含量的虾青素^[16-19]、产生的虾青素抗氧化能力强^[14]，且没有毒性^[20-21]。而成为在大规模生产条件下天然虾青素最主要的来源^[22-23]。

目前，以雨生红球藻进行虾青素生产的研究主要集中在以下两个方面：获得高密度的生物量以及进行产物合成的高表达，目前的研究较多集中在前者。为了获得高生物量，国内外大量研究^{[17, 24-26]}尝试了多种培养基的优化，但是性价比仍然没有达到最优，在产量与成本间存在进一步优化的空间。因此，开发产量与成本的最佳耦合技术成为人们尝试的目标。近年来，利用废弃物(下脚料、发酵残余、工业糖渣)进行藻类养殖已逐渐进入人们的视野。

随着我国城市化进程加剧，城市人口不断膨胀，导致城市污水排放量急剧增多。而城市污水是一种水量稳定、供给可靠的潜在水资源^[27]。早在20世纪60年代就已经有了利用污水进行藻类培养的相关研究^[28]。近年来，大量研究^[29-33]进一步证明了利用污水培养藻类的可行性和安全性，如城市再生水培养能源藻(高油脂藻类)、二级排放水生产培养生物柴油藻，以及市政管网废水培养饲料藻等。然而，针对雨声红球藻的污水培养尚不多见，为了探索“变费为宝、节能环保”的养藻方式，实现水质净化和生物质生产的有效耦合，我们利用城市污水对红球藻进行了培养。实验评估了污水培养对藻类生产的促进作用和养藻后的氮、磷去除效果，为雨声红球藻高密度培养和水质净化寻找一条可行的双效路径。

1 材料与方法 1.1 实验材料

雨生红球藻(H. pluvialis)购自中科院水生生物研究所淡水藻种库，编号：FACHB-797。水样取自广东省深圳市南山区深圳水务集团西丽再生水厂曝气沉砂池。对照组培养基采用BG11培养基(1L)：NaNO₃ 1.5g，K₂HPO₄ 40mg，MgSO₄·7H₂O 75mg，CaCl₂·2H₂O 36mg，柠檬酸6mg，柠檬酸铁5.26mg，EDTANa₂ 1mg，Na₂CO₃ 20mg，A5微量元素液1ml；微量元素混合物配方(1L)：H₃BO₃ 2.86mg，MnCl₂·4H₂O 1.86mg，ZnSO₄·7H₂O 0.22mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.39mg，CuSO₄·5 H₂O 0.08mg，Co(NO₃)₂·6 H₂O 0.05mg。

1.2 实验方法

1.2.1 污水预处理

取得的水样在14 000r/min条件下离心5min，去除泥沙，取上清液。之后用0.22μm的滤膜进行过滤，去除颗粒悬浮物和微生物。

1.2.2 雨生红球藻培养

将BG11培养基、纯污水培养基，以及经过2倍、5倍和10倍稀释后的污水培养基在121℃、0.1MPa条件下，高温、高压灭菌15min。雨生红球藻初始接种密度为5×10³个/ml，接种前用超纯水清洗3次，以去除残留的培养基。藻液分装于250ml的三角瓶中，每瓶150ml。实验设5个实验组，每组3个平行。培养条件如下：温度为(25±1)℃,光照时间L∶D=12h∶12h,光照强度(3 300±200)lx。每天摇晃一次，并交换放置位置以保证接受到相同的光照。

1.3 检测方法

1.3.1 雨生红球藻生物量检测

取480μl经300目滤膜过滤后的藻液，加入20μl荧光计数微球，采用流式细胞仪(BD FACSCalibur)对雨生红球藻进行计数。

1.3.2 叶绿素含量(ChI)测定

取2ml藻液，采用浮游植物分类荧光仪(PHYTO-PAM，德国)进行叶绿素含量(Chl)测定。

1.3.3 营养盐测定

采用全自动间断化学分析仪(德国DeChem-Tech Cleverchem380)对培养过程中每个样品的氨氮(NH₄⁺)、亚硝氮(NO₂^－)、硝氮(NO₃^－)、磷酸盐(PO₄^3－)、总氮(TN)、总磷(TP)含量进行测定。

1.3.4 藻内虾青素提取及含量检测

每个实验组取50ml藻液14 000r/min条件下离心5min，冷冻干燥后称重。加入有机溶剂(甲醇∶二氯甲烷=3∶1)超声破碎30min，离心，取上清液。参考Hou等^[34]的方法，采用超高效液相色谱仪(UPLC,Waters)检测提取得到的虾青素的含量。色谱条件为：BEH C18色谱柱(1.7μm,2.1×50mm)，流动相A∶乙腈-甲酸(100∶0.1,V/V)，流动相B纯水。

1.3.5 重金属含量检测

采用原子发射光谱仪(ICP)对培养雨生红球藻前后纯污水培养基和BG11培养基中和藻细胞内的Cd、Se、Sb、Hg、Pb、As、Cr、Co、Sn、Mo、B、Sr、Cu、Ni 14种重金属含量进行检测。

1.4 数据统计

采用Excel进行平均值和标准差的计算，用SPSS软件进行显著性检验和单因素方差分析(P<0.05)。

2 实验结果 2.1 雨生红球藻生物量检测

实验选用BG11培养基，纯污水及分别稀释2倍、5倍和10倍后的污水，共5种培养基，培养雨生红球藻15天，每2天测定雨生红球藻生物量，结果如图 1所示。

从图 1中可以看出，对照组、污水稀释2倍组、稀释5倍组和稀释10倍组在接种后生物量具有显著提升。其中对照组在整个生长周期保持较恒定的生长速率，生物量持续增加，在第15天达到1.24×10⁵个/ml。而稀释5倍组、稀释10倍组在接种后前3天具有最高的生长速率，但第3~7天生物量有所下降，出现负增长，随后以较低的生长速率继续增加生物量，在第15天分别达到8.66×10⁴个/ml和7.80×10⁴个/ml。稀释2倍组较高的生长速率可持续至第5天，随后生长放缓，在第15天生物量与对照组趋于同一水平。值得注意的是，未稀释组自接种后出现负增长，生物量有所下降，而从第3天开始，生物量显著增加，具有最高的生长速率，在第15天达到2.10×10⁵个/ml。

从图 2中可以看出，采用未稀释的污水培养得到的雨生红球藻相比其它实验组具有最高的生物量，存在极显著差异(P<0.001)。值得一提的是，未稀释污水组培养的雨生红球藻的生物量比BG11对照组高出约2倍。

2.2 叶绿素(ChI)含量测定

从图 3可以看出，污水培养的雨生红球藻的叶绿素含量在生长周期前期均有较快的提升，而后期叶绿素含量提升缓慢；对照组的叶绿素含量以相对恒定的速率持续增加。

2.3 营养盐测定

对培养过程中的氨氮(NH₄⁺)、亚硝氮(NO₂^－)、硝氮(NO₃^－)、磷酸盐(PO₄^3－)、总氮(TN)、总磷(TP)含量进行测定，结果如图 4所示。

从图 4(a)中可以看出，污水中的氨氮含量均呈现出明显的下降趋势，对照组中的氨氮含量在一定范围内波动。图 4(b)显示污水中的亚硝氮含量为0~0.01mg/L，而对照组中的亚硝氮含量随着培养时间的增加而增加。图 4(c)表明在培养过程中硝氮含量的变化过程，其中污水培养过程中硝氮含量为0.02~0.08mg/L的范围内，而对照组中前期硝氮含量呈显著下降趋势，后期有显著上升。图 4(d)~(f)则反映出各个实验组中磷酸盐、总氮及总磷的含量，均呈下降趋势。

2.4 藻内虾青素提取及含量检测

虾青素特征峰如图 5所示，虾青素保留时间为2.792min。

各个实验组虾青素单位含量检测结果见表 1。

2.5 重金属含量检测

采用原子发射光谱仪(ICP)对培养雨生红球藻前后污水、BG11培养液及藻细胞内的Cd、Se、Sb、Hg、Pb、As、Cr、Co、Sn、Mo、B、Sr、Cu和Ni 14种重金属含量进行检测。

从图 6可以看出，养藻前的污水中重金属含量非常低(部分低于最低检测限)，同时与BG11培养液中的含量不存在显著性差异。而Mo、B和Se在养藻后的污水中含量高于养藻前，表明这些元素未在藻体内明显富集。

图 7反映了污水培养及BG11培养后藻内重金属的含量。可以看出，污水培养得到的雨生红球藻中重金属检出量极低，仅检测到Se、Pb、Cr、Sr、Cu 5种元素。由BG11培养得到的藻细胞内除上述元素外还可检测到Co、Mo、B等重金属。而污水培养得到的雨生红球藻藻细胞中Se、Cr、Sr元素的含量显著高于对照组(P<0.05)。

3 讨论

城市污水进行藻类培养已有过多年的尝试，本实验在雨生红球藻中得到了可行性验证，丰富了污水养藻的实践经验。从实验结果中可以看出预处理后的城市污水可有效促进雨生红球藻的生长。其中获得最高生物量的组别是未稀释污水组(其最大生物量可达2×10⁵cells/ml)，而生长响应最迅速的是稀释组(2倍、5倍及10倍)。我们推测这一现象可能与初始氨氮值有关。未稀释组的初始氨氮含量为8.68mg/L，相比其它三组含量要高，而在污水中氨氮主要以NH₃的形式存在。有研究表明，NH₃形式的氨氮对微藻具有短期的毒性抑制，仅1.2mmol/L的NH₃就可以降低50%的光合转化率^[35-36]。同时Patricia等^[37]也指出，藻类可以利用氨氮作为氮源，但过高的氨含量会抑制藻类的生长。本实验中，未稀释组自接种后生物量响应滞后，可能是因为氨毒性效应暂时抑制了藻的生长，随着时间的推移，NH₃形式的氨氮转化为无毒的以NH₄⁺形式存在的氨氮，随后以此为氮源用于生物量的积累。另外，也可能由于存在其他我们未检测到的物质，由于较高的初始浓度而暂时抑制了雨生红球藻的生长，需要相关实验进行验证。由于未稀释组总的氨氮含量高，将会作为缓释N源促进藻细胞后期生物量的积累，因而在最终的生物量上具有最大值。而稀释组(2倍、5倍和10倍)由于初始氨氮含量相对较低，属于雨生红球藻耐受氨浓度的安全范围，因而可快速利用氮源进行生长，在生长速率上具有响应优势。

雨生红球藻在高浓度氨氮中的耐受性可能与其自身的生理特征有关。绿藻偏好以硝氮作为氮源^[38-39]，相比之下，雨生红球藻具有更广谱的氮源谱。在绿藻中，当它以硝氮为氮源时，微藻会在细胞内将摄取的硝氮经亚硝氮还原成氨氮后进入氨基酸的合成^[38-40]，这一过程会消耗大量的能量，从而影响细胞的生长。而在红球藻中可以以较高的吸收能力直接利用氨氮进行氨基酸的合成途径，避免了将硝氮还原为氨氮这一能耗过程，从而获得高于对照组的生物量。另外，氨氮相比硝氮可以优先被吸收^[41]，并且在氮压力下藻类对氨氮的吸收和同化能力会被增强^[42]。因此，雨生红球藻在污水的高氨氮环境下具有存活和长效的生长潜力。此外，高浓度的氨氮对雨生红球藻产生的毒物兴奋效应也可能是刺激藻类生长的一个原因，促使雨生红球藻快速分裂产生更多的个体以分担这一环境压力，但这一假设需要进行后续实验数据的支撑。

除了促进藻类生长外，污水培养还能更早启动虾青素的合成。该现象可通过3个方面得到证实。其一，叶绿素水平，污水培养的雨生红球藻叶绿素含量在生长周期前期均有较快的提升，而后期叶绿素含量提升缓慢。这可能是由于高氨氮的影响，因为氨氮会影响叶绿素代谢过程中的氧化还原反应，进而影响叶绿素的含量^[37]。图 4反映出污水培养的雨生红球藻的叶绿素含量显著低于对照组，这表明藻细胞的生长潜能已接近平台期，正处于生长期至产物合成期的过度。其二，从培养过程中可以观察到在第5天左右，污水培养的雨生红球藻藻液开始变红，雨生红球藻渐入虾青素合成时期。其三，营养盐的变化趋势也能进行辅助证明。前期营养盐的快速利用，导致污水中氮、磷含量较低，特别是稀释后的污水中磷酸盐含量低于0.1mg/L。当雨生红球藻在氮、磷等营养缺乏的状态下，受到环境应激，启动虾青素的合成。本实验发现污水养藻可以驱动雨生红球藻更快地进入虾青素合成时期，有效缩短虾青素合成周期，降低了时间成本。

通过对雨生红球藻虾青素含量进行检测发现，虽然对照组BG11培养基的营养含量远远高于实验组，有更多的营养物质可用于虾青素合成。但对照组虾青素单位含量仅为实验组的2倍，表明污水养藻在驱动雨生红球藻更快地进入虾青素合成时期的同时，也具有较高的转换效率。

雨生红球藻在污水的生长中也展现出氮、磷的去除能力。对照组的亚硝氮(NO₂^－)和硝氮(NO₃^－)含量在后期均呈上升趋势。而在雨生红球藻的前期生长中，氨氮(NH₄⁺)、亚硝氮(NO₂^－)、硝氮(NO₃^－)、磷酸盐(PO₄^3－)、总氮(TN)、总磷(TP)含量总体呈下降趋势，表明藻细胞在生长过程中具有一定的水质净化能力。而实验组后期N源含量增加是由于后期藻类衰老死亡，细胞破裂，硝氮被释放入藻液中，导致硝氮含量呈现上升。值得注意的是，在培养雨生红球藻的后期，污水中氨氮、总氮、总磷含量均达到《GB 18918-2002城镇污水处理厂污染物排放标准》中一级A类标准。因此，在污水培养雨生红球藻的同时，藻类也可以净化污水，达到资源获取和环境保护的双赢。

考虑到虾青素的生物安全性，对污水培养前后藻液及藻细胞内重金属的含量进行了评估。结果表明，污水培养得到的雨生红球藻中重金属含量极低，并且部分含量超出检测下限；同时在可检测到的Cr、Sr、Se三种元素的含量符合《GB2762-2012食品安全国家标准食品中污染物限量》及《GBT19643-2005藻类制品卫生标准》。另外，污水中含量较高的Cu为雨生红球藻生长所必需的微量元素，在BG11培养基中也有添加。综合来看，养藻前的污水中重金属含量极低，同时与BG11培养液中的含量不存在显著性差异。而部分元素在养藻后的污水中含量高于养藻前，表明雨生红球藻对各类重金属不具有显著的富集作用。

4 结论

本实验证实了采用城市生活污水进行低成本雨生红球藻培养的新方法。实验结果表明，城市生活污水培养雨生红球藻，极大地提升了生物量；也可使其更快地进入虾青素合成期，有效的地缩短了产物的合成周期，并保持着较高的虾青素单位含量。同时，通过重金属含量检测，证实采用生活污水培养得到的雨生红球藻不存在安全风险。此外，养藻后的污水氮、磷含量显著下降，水质达到一级A类排放标准。因此，采用城市污水培养雨生红球藻不仅可以创造经济效益和生态效益，而且可以发展出可再生能源生产和减排的双效模式，具有极好的发展前景。