2016, Vol. 36文章信息
- 郭永华, 陈济琛, 蔡海松, 陈龙军, 林新坚.
- GUO Yong hua, CHEN Ji chen, CAI Hai song, CHEN Long jun, LIN Xin jian.
- Geobacillus sp.CHB1环糊精葡萄糖基转移酶淀粉结合位点N623饱和突变对催化效率与产物特异性的影响
- Saturated Mutation Effects on Catalytic Efficiency and Product Specificity of Starch Binding Site N623 of Cyclodextrin Glucanotransferase from Geobacillus sp. CHB1
- 中国生物工程杂志, 2016, 36(11): 30-38
- China Biotechnology, 2016, 36(11): 30-38
- http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20161105
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文章历史
- 收稿日期: 2016-04-28
- 修回日期: 2016-06-20
2. 福建农林大学生命科学学院 福州 350002
2. College of Life Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China
环糊精(CDs)因特殊的内疏水外亲水的筒形结构被广泛应用于环保、医药、化学、食品等领域[1]，根据葡萄糖单元数目的不同，分为α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精等，主要由环糊精葡萄糖基转移酶通过催化分子内的转糖基反应将淀粉和相关基质转化而来[2]。
环糊精葡萄糖基转移酶(EC 2.4.1.19 ；cyclodextrin glucosetransferase，CGTase)是α-淀粉酶家族(家族13)的成员之一，除了具有与α-淀粉酶相同的A、B、C结构域之外，还有D和E结构域，其特别功能是催化分子内的转糖基反应生成相应的产物[3]。其中E结构域具有结合淀粉颗粒的作用，也称为淀粉结合区域(starch-binding domain,SBD)，属于碳水化合物结合域(carbohydrate-binding module,CBM)家族20(CBM20)[4-5]。淀粉结合区域广泛存在于淀粉酶家族中，并且，除了米根霉糖化酶的SBD存在于氨基端外，几乎大多数淀粉酶中的SBD都位于羧基端。SBD是由7个β链组成的一个开放、扭曲的β桶形结构[6]。在完整结构的淀粉酶中，SBD有三个主要功能，即使底物结合到催化区域的活性位点上、使不溶底物与溶液中的酶相互作用、在某些情况下分解淀粉颗粒的表面[7]。SBD的结合位点因其在不同的酶中而有不同情况。CGT酶的SBD区域(E结构域)有两个淀粉结合位点，分别称为淀粉结合位点1和淀粉结合位点2。Kimura等[8]研究表明，结构域E影响CGT酶的环化反应。Chang等[9]在结构域E中的634位构建点突变体，得到使环化活力提高25%的突变体Y634F。
目前，国内外研究者对不同来源的CGTase进行了大量的基因改造研究[9-10]，期望获得具有理想性质的突变体。绝大多数的定点突变发生在CGTase活性中心附近底物结合凹槽的氨基酸残基[10]。虽然众多的研究取得了一些成果，但仍不能满足工业用酶的需求。对于结构域E中两个淀粉结合位点的研究，目前少见相关报道。
本实验以Geobacillus sp. CHB1 CGT酶为研究对象，通过对不同来源的CGT酶蛋白结构域E序列进行多重序列比对发现，淀粉结合位点1高度保守，淀粉结合位点2比较多源化，第623位氨基酸存在明显差异。基于以上分析，本研究试图通过定点饱和突变方法将CGT酶第623位氨基酸用其它氨基酸替代，以探讨该位点对酶性质的影响，从而为通过分子改造得到理想性质的CGT酶提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株与质粒地芽孢杆菌CHB1是本实验室从堆肥中筛选获得的；克隆宿主菌E.coli DH5α和表达菌E.coli BL21(DE3)购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；克隆质粒pMD-19购自大连宝生物工程有限公司；表达质粒pET-28a(+)-ompA由本实验室保存；重组质粒pET-28a(+)-ompA-cgt由本实验室构建并保存。
1.1.2 酶和试剂质粒小量提取试剂盒、Bradford蛋白浓度测定试剂盒、卡那霉素、NI-IDA纯化试剂盒购自上海生工生物工程公司；DNA纯化试剂盒、限制性内切核酸酶、T4 DNA连接酶、PrimerStarDNA聚合酶购自日本TaRaKa公司；环糊精(α-CD、β-CD、γ-CD产品编号分别为C4642、C4767、C4892)购自Simga公司；其它试剂为国产分析纯。
1.1.3 培养基LB培养基(/L)：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g；筛选培养基[LB培养基+3%(m/V)可溶性淀粉]；乳糖自诱导培养基[11](/L)：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，Na2HPO4 17.9g，KH2PO4 6.8g，(NH4)2SO4 3.3g，MgSO4 0.5g，甘油5ml，Trace Metal 200μl。
1.2 方法 1.2.1 突变体的构建首先以pET-28a(+)-ompA-cgt载体作为模板，突变引物列表见表 1(下划线为突变氨基酸密码子)。通过Primerstar DNA酶扩增，获得的PCR产物胶回收后，经Overlap-PCR方法扩增出全长基因。PCR产物纯化后，产物和表达载体都经BamH I 和Xho I 双酶切，然后加入T4连接酶，16℃过夜连接，连接产物转化E.coli DH5α，挑取阳性克隆子，提取质粒进行双酶切验证和测序验证。将验证正确的突变质粒分别转化表达菌E.coli BL21(DE3)，得到含有突变质粒的重组菌。
| Primer name | Primer sequence (5′-3′) | |
| Forward | N623F | TTAATAACGCTACTACCTTCCTAGGGCAAAAT |
| N623M | TTAATAACGCTACTACCATGCTAGGGCAAAAT | |
| N623P | TTAATAACGCTACTACCCCGCTAGGGCAAAAT | |
| N623A | TTAATAACGCTACTACCGCACTAGGGCAAAAT | |
| N623Y | TTAATAACGCTACTACCTATCTAGGGCAAAAT | |
| N623H | TTAATAACGCTACTACCCATCTAGGGCAAAAT | |
| N623K | TTAATAACGCTACTACCAAGCTAGGGCAAAAT | |
| N623D | TTAATAACGCTACTACCGATCTAGGGCAAAAT | |
| N623C | TTAATAACGCTACTACCTGCCTAGGGCAAAAT | |
| N623Q | TTAATAACGCTACTACCCAGCTAGGGCAAAAT | |
| N623L | TTAATAACGCTACTACCCTGCTAGGGCAAAAT | |
| N623I | TTAATAACGCTACTACCATTCTAGGGCAAAAT | |
| N623V | TTAATAACGCTACTACCGTGCTAGGGCAAAAT | |
| N623S | TTAATAACGCTACTACCTCTCTAGGGCAAAAT | |
| N623T | TTAATAACGCTACTACCACCCTAGGGCAAAAT | |
| N623N | TTAATAACGCTACTACCAATCTAGGGCAAAAT | |
| N623E | TTAATAACGCTACTACCGAACTAGGGCAAAAT | |
| N623R | TTAATAACGCTACTACCCGGCTAGGGCAAAAT | |
| N623G | TTAATAACGCTACTACCGGCCTAGGGCAAAAT | |
| Reverse | 623Rev | AGTAGCGTTATTAACAACAAACC |
1.2.2 突变体的胞外表达与纯化
种子培养：将含有突变质粒的重组菌E.coli BL21(DE3)接入装有50ml含100μg/ml Kan的LB培养基中，回旋式摇床转速180r/min，培养温度为37℃，培养8h。
发酵培养：将种子液按2%(V/V)的接种量接种至装有50ml含100μg/ml Kan的乳糖自诱导培养基中进行培养，培养温度为25℃，摇床转速为180r/min，加入葡萄糖和乳糖进行诱导72h。
发酵72h后的发酵液在10 000r/min、4℃下离心5min，收集菌体。菌体在冰浴中经超声波破碎，破碎后的上清液纯化采用Ni柱一步亲和层析法。
1.2.3 酶活测定甲基橙法测定α-环化活力的方法[12]：取适当稀释的酶液0.1ml，加入装有0.9ml预先用50mmol/L磷酸缓冲液PBS(pH 6.0)配制的3%可溶性淀粉溶液中，在60℃下反应10min后加入1.0ml 1.0mol/L的盐酸终止反应，再加入1.0ml用50mmol/L磷酸缓冲液配制的0.1mmol/L甲基橙，在16℃下保温20min，在505nm下测定吸光度。一个酶活单位定义在该条件下每分钟生成1μmol α-环糊精所需酶量。
酚酞法测定β-环化活力的方法[13]：取适当稀释的酶液0.1ml，加入装有0.9ml预先用50mmol/L的磷酸缓冲液PBS(pH 6.0)配制的3%(m/V)可溶性淀粉溶液的试管中，在60℃下反应10min后加入3.5ml 30mmol/L NaOH和0.5ml由5mmol/L Na2CO3溶液配制的0.02%(m/V)酚酞终止反应，在室温下保温20min，在550nm下测定吸光度。一个酶活单位定义为在上述条件下每分钟生成1μmol β-环糊精所需的酶量。
溴甲酚氯法测定γ-环化活力的方法[14]：取适当稀释的酶液0.1ml，加入装有0.9ml预先用50mmol/L磷酸缓冲液PBS(pH 6.0)配制的3% (m/V)可溶性淀粉溶液的试管中，在60℃下反应10min后，加入50μL 1.0mol/L的盐酸终止反应，再加入2ml 0.2mol/L柠檬酸缓冲液(pH 4.2)和100μl 5mmol/L溴甲酚氯溶液，在室温下保温20min，在630nm下测定吸光度。一个酶活单位定义为在上述条件下每分钟生成1μmol γ-环糊精所需的酶量。
1.2.4 蛋白质浓度测定蛋白质浓度测定使用Bradford法[15]，以牛血清白蛋白作为标准品[15]。
1.2.5 CGT酶最适温度和最适pH在不同温度(30~90℃)下,按1.2.3 的方法测定纯化酶的α-环化活力，将酶活最高者定为100%，计算相对酶活，作温度-相对酶活力曲线，以确定酶的最适温度。
分别用浓度为50mmol/L的不同pH的缓冲液(柠檬酸-柠檬酸钠：pH 3~6；Na2HPO4-NaH2PO4：pH 6~8；甘氨酸-氢氧化钠：pH 8~10)稀释酶液和配制底物,按1.2.3的方法测定纯化酶的α-环化活力，将酶活最高者定为100%，计算相对酶活，作pH-相对酶活力曲线,以确定酶的最适pH。
1.2.6 酶动力学性质分析用50mmol/L磷酸缓冲液(pH5.0或6.0)分别配制底物浓度为0.1~10mg/ml的溶液,按1.2.3 的方法测定α-CGT酶的酶活，按Lineweaver-Burk双倒数法作图,计算酶的动力学参数,包括米氏常数(Km)、最大反应速率(Vmax)、催化常数(Kcat)和催化效率(Kcat/Km)。
1.2.7 突变体的结构模拟野生型和突变型CGT酶的理论晶体结构通过SWISS-MODEL(http://www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html)[16-17]和I-TASSER(http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/)[18]蛋白模拟在线服务器进行同源模拟获得，模板为来源于Geobacillus stearothermophilus的CGT酶(PDB:1CYG)。理论结构与模板具有91%的同源性。所有分子结构图形由Accelrys Discovery Studio Client 4.0 和MOE软件制作。
1.2.8 CGT酶产物特异性分析用50mmol/L磷酸缓冲液(pH 5.0或6.0)配制3%(m/V)的可溶性淀粉溶液作为底物,加入终浓度为1U/ml的纯化酶，置于60℃摇床(200r/min)中反应24h,煮沸灭酶10min,10 000r/min离心10min，取上清液经0.45μm超滤膜过滤后，采用高效液相色谱法(HPLC)测定反应液中α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精浓度。
HPLC测定条件[19]为:Agilent 1260 HPLC系统(配示差折光检测器)，色谱柱Lichrosorb NH2(4.6mm×150mm)，流动相采用68%(V/V)的乙腈水溶液，柱温为30℃,流速为1ml/min。
2 结果与分析 2.1 位点分析通过多重序列比对和晶体结构分析发现[9]，淀粉结合位点(starch-binding site 1和starch-binding site 2)普遍存在于环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)中，且这两个位点处氨基酸残基具有较高的保守性。CGT酶第589、620、635～636、640位氨基酸序列中有5个氨基酸残基与淀粉颗粒结合，这5个位点构成淀粉结合位点1，这5个氨基酸残基依次是Trp、Lys、Trp、Glu和Asn。通过多重序列比对发现(表 2)，淀粉结合位点1处氨基酸残基具有高度的保守性。CGT酶淀粉结合位点2大部分由9个或10个氨基酸残基组成，分别为第622～627、651～652、655和660位氨基酸残基，这些氨基酸残基通过离子健、氢键、范德华力等与淀粉颗粒结合。通过多重序列比对发现(表 2)，CGT酶淀粉结合位点2处氨基酸残基具有一定的保守性，如第622位氨基酸残基均为苏氨酸(T)、第625位氨基酸残基均为甘氨酸(G)，除来源于Klebsiella pneumoniae的α-CGT酶外，其余CGTase的第627、651位氨基酸残基均为天冬酰胺(N)，第660位氨基酸残基均为色氨酸(W)；但是CGTase的第623位氨基酸残基在不同来源的CGTase中呈现出一定的特异性。
| Type | Bacterial source | Accession No. | Starch-binding site 1 (589,620,635,636,640) | Starch-binding site 2 (622~627，651,652，655，660) |
| α-CGTase | Klebsiella oxytoca | P08704 | WKWEN | TISGQSPPW |
| α/β-CGTase | Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes | P26827 | WKWEN | TVYGENNQYW |
| α/β-CGTase | B.circulans 8 | P30920 | WKWEN | TTLGQNNPW |
| α/β-CGTase | Geobacillus stearothermophilus | P31797 | WKWEN | TNLGQNNQYW |
| β-CGTase | Bacillus circulans 251 | P43379 | WKWEN | TALGQNNQYW |
| β-CGTase | Paenibacillus pabuli | CAO05752 | WKWEN | TTLGQNNPW |
| β-CGTase | Bacillus sp. B1018 | P17692 | WKWEN | TALGQNNQYW |
| β/γ-CGTase | Bacillus sp. 1-1 | P31746 | WKWEN | TSPGTNN PW |
| β/γ-CGTase | Brevibacillus brevis | O30565 | WKWEN | TNSGTNN PW |
| γ-CGTase | Bacillus clarkii 7364 | Q8L3E0 | WKWEN | TNYGENN PW |
| α/β-CGTase | Geobacillus sp. CHB1 | - | WKWEN | TNLGQNNQYW |
通过SWISS-MODEL和I-TASSER(http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/)蛋白质模拟在线服务器，以Geobacillus stearothermophilus的CGT酶晶体结构(PDB:1CYG)为模板，模拟得到野生型Geobacillus sp. CHB1的CGTase，与模板具有91%的同源性，与报道的CGTase晶体结构相比，CGTase的整体结构没有大的变化，整个酶分子由5个结构域组成，主链的构象也基本相同，但是局部结构有明显的变化，CGTase的淀粉结合位点2区域构象存在明显不同，因不同氨基酸残基的极性、侧链长度、所带基团不同，可能导致该区域的构象方向、空间大小存在差异，如野生型Geobacillus sp. CHB1 CGTase淀粉结合位点2的623位是酰胺类极性带负电荷氨基酸，而表 2中其它623位的丙氨酸(A)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)是非极性不带电氨基酸。野生型Geobacillus sp. CHB1 CGTase催化淀粉合成环糊精的效率比较低，可能是第623位氨基酸残基的性质及结构不利于酶的催化反应进行导致的。因此，本研究拟在该酶的第623位氨基酸处通过饱和突变将天冬酰胺(Asn623)用其它19种氨基酸替代，来探究第623位氨基酸构象对催化效率和产物专一性的影响。
2.2 突变体的表达通过重叠PCR扩增突变基因，基因片段纯化酶切后与用同样内切酶酶切的载体连接，转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取阳性克隆子进行测序，突变位点正确突变。阳性克隆进行乳糖诱导表达，SDS-PAGE鉴定发现，突变体成功表达(图 1)。发酵90h后粗酶液冰水浴超声破碎，经镍柱纯化得到电泳纯酶蛋白(图 2)。测定纯化后的突变酶和野生酶的环糊精形成活力，结果表明(表 3)，相对于野生酶，表 3所列的突变酶的总环化活力有所提高，表中未列其它突变体的总环化活力大幅度降低。其中，突变体N623T的总环化活力提高了58.6%，α-环化活力提高了64%，β-环化活力提高了80.5%，而γ-环化活力降低了35.3%。
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| 图 1 野生型和突变体CGT酶的SDS-PAGE分析 Figure 1 SDS-PAGE analysis of the wild type and mutantCGTase M: Protein marker; 1: Wild type supernatant fractionation; 2: Wild type inclusion body; 3: Mutant N623G supernatant fractionation; 4: N623G mutant inclusion body; 5: N623R mutant supernatant fractionation; 6: N623R mutant inclusion body；7: N623T mutant supernatant fractionation; 8: N623T mutant inclusion body |
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| 图 2 纯化后野生型和突变CGT酶的SDS-PAGE分析 Figure 2 SDS-PAGE analysis of the purification of wild type and mutant CGTase M: Protein marker; 2: Wild type; 3: Mutant N623T |
| CGTase | α-cyclization activity (U/mg) | β-cyclization activity (U/mg) | γ-cyclization activity (U/mg) | Total (U/mg) |
| WT | 166.8 ± 1.70 | 72.9 ± 0.29 | 26.6 ± 0.005 | 266.3 |
| N623E | 132.7 ± 1.45 | 115.0 ± 0.41 | 9.4 ± 0.003 | 257.1 |
| N623F | 94.3 ± 0.35 | 125.1 ± 0.48 | 9.0 ± 0.002 | 228.4 |
| N623G | 178.2 ± 1.67 | 116.0 ± 0.56 | 7.0 ± 0.001 | 301.2 |
| N623R | 167.7 ± 1.68 | 106.3 ± 0.45 | 15.0 ± 0.003 | 289 |
| N623S | 171.5 ± 1.70 | 95.8 ± 0.32 | 3.9 ± 0.001 | 271.2 |
| N623T | 273.6 ± 1.83 | 131.6 ± 0.56 | 17.2 ± 0.004 | 422.4 |
| Note: Each value represents the mean of three independent measurements. Numbers between brackets indicate the ratio in specific activities for the formation of the differentcyclodextrins | ||||
2.3 突变体的最适温度和最适pH
为了确定底物与酶反应的最佳反应条件，研究了突变体的最适温度和pH。如图 3所示，突变体的最适反应温度为60℃，比野生型高了10℃，当温度逐渐升高时，突变体酶活性逐渐下降，当温度达到90℃时，野生型已基本失活，突变体酶活下降至原来的10%。
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| 图 3 原始CGTase和突变体N623T的最适温度 Figure 3 The optimum temperature of the wild-type CGTase and N623T |
与最适温度变化一样，突变体的最适pH由野生型的5升到6(图 4)，在酸性条件下，突变体和野生型酶活都较低，碱性条件下，二者的酶活开始随pH的升高而降低，但突变体可保持较高的活力。
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| 图 4 原始CGTase和突变体N623T的最适pH Figure 4 The optimum pH of the wild-type CGTase and N623T |
以不同浓度的可溶性淀粉为底物，在最适温度和pH条件下测定野生型CGTase和突变体N623T酶动力学参数。野生型CGTase和突变体N623T的Km值分别为4.3和3.97，突变体的Km降低了7.67%，而Vmax增大了192.9%(表 4)。结果表明，突变体CGTase对底物的亲和力增强，催化效率比原始酶提高了20%。
| Enzyme | Vmax[mmol/(ml·min)] | Km(mg/ml) | Kcat(/s) | Kcat/Km[g/(s·L)] |
| Wild-type | 0.013±0.005 | 4.3±0.15 | 492 | 114.4 |
| N623T | 0.038 08±0.011 | 3.97±0.16 | 546 | 137.5 |
2.5 突变体的产物特异性
在野生酶和突变酶各自的最适温度和pH下进行酶转化淀粉生产环糊精实验，从表 5可知，野生酶转化淀粉生产环糊精中α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精之比为1.1∶1.2∶0.41，其中α-环糊精占38.8% ，β-环糊精、γ-环糊精分别占45.5% 和15.7% 。突变酶N623T转化淀粉生产环糊精中α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精之比为3.9∶7.1∶0.9，其中α-环糊精、γ-环糊精所占比例缩减为32.8%和7.7%，β-环糊精提高至59.5%。突变酶N623T α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精的产量有所升高，与预期结果一致，相对于野生酶，突变酶N623T的淀粉总转化率从11.3%提高至39.7%，提高了251.3%。
| CGTase | Conversion of starch into Cyclodextrins (%) | Product (g/L) | ||
| α | β | γ | ||
| WT | 11.3 | 1.1 ± 0.1 (38.8) | 1.2 ± 0.1 (45.5) | 0.41 ± 0.1 (15.7) |
| N623E | 11.0 | 0.9 ± 0.1 (27.8) | 1.8 ± 0.1 (55.6) | 0.5 ± 0.1 (16.6) |
| N623F | 21.5 | 0.7 ± 0.1 (11.0) | 5.2 ±0.3 (80.5) | 0.5 ± 0.1 (8.5) |
| N623G | 23.4 | 2.9 ± 0.2 (40.9) | 3.6 ± 0.2 (51.9) | 0.5 ± 0.1 (7.2) |
| N623R | 11.5 | 1.0 ± 0.1 (29.0) | 1.7 ± 0.1 (49.7) | 0.7 ± 0.1 (21.3) |
| N623S | 13.5 | 2.1 ± 0.1 (51.1) | 1.5 ± 0.1 (37.0) | 0.5 ± 0.1 (11.9) |
| N623T | 39.7 | 3.9 ± 0.2 (32.8) | 7.1 ± 0.4 (59.5) | 0.9 ± 0.1 (7.7) |
| Note:CGTase proteins (0.1U/ml β-cyclization activity) were incubated with 3% (wet basis,m/V) soluble starch solution at optimal pH and temperature for 24h.Numbers in parentheses indicate the percentage of each cyclodextrin present in the product mixture. Each value represents the mean of three independent measurements,and means with different letters within the same column are significantly different (P< 0.05) | ||||
2.6 反应动力学及作用机制分析
淀粉结合区域(SBD)广泛存在于淀粉酶家族中，主要功能是使底物结合到催化区域(CD)的活性位点上，其多个结合位点因在各种不同的酶中而各有不同。研究发现黑曲霉糖化酶的SBD具有两个结合位点[20]，当SBD结合到β-环化糊精上时，两个位点的结构和功能各不相同。位点l的Trp543和Trp590形成一个芳香环平面，能够与底物中的碳水化合物快速结合，结合过程中结构基本不发生改变，且始终与酶表面平行；位点2含有两个关键的氨基酸残基Tyr527和Tyr556，不与酶表面平行，突出于酶表面之外，Tyr556形成一个固定的轴，而Tyr527与淀粉链一起围绕这个轴旋转适当的角度，以利于底物作用方向，使得酶与底物的反应更加高效。
图 5所示为野生型及突变型CGTase的淀粉结合位点2处第622～627位氨基酸残基的三维结构，其中图 5(a)为野生型CGTase、图 5(b)为突变体N623T。从图 5中可以看出，突变型CGTase被突变的氨基酸残基与原始型差别较大，尤其是氨基酸残基空间结构的变化。第622～627位氨基酸残基不与酶表面平行，而是突出于酶表面之外[图 5(c)、(d)]。突变体N623T的第622~627位氨基酸残基空间结构与酶表面垂直，与淀粉链的作用方向比较一致，从而优化底物作用方向，有利于反应的进行，这可能就是突变体N623T转化效率提高的原因。
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| 图 5 野生型CGTase和突变体N623T在第623位氨基酸残基的模拟结构对比 Figure 5 Alignment of wild type and mutant N623T on the 623th amino acid residues (a),(c)Wild-type CGTase (b),(d) Mutant N623T |
如表 3所示，突变体N623T的α-、β-环化活力与野生型相比都是增加的，可能是由于苏氨酸残基的侧链比天冬酰胺要长、形成氢键的可能性大及附近氨基酸残基之间的构象变化，导致中间产物构象更加稳定，从而使这两种环化反应更容易进行。野生型CGTase有比较高的γ-环化活力，而N623的所有突变体的γ-环化活力都明显减少，这可能是这些突变体没有在底物结合凹槽处产生更大的空间去容纳更多的葡萄糖残基。
Nikolov等[9]在淀粉结合结构域E中的634位构建点突变体Y634F，由于氨基酸残基侧链长度变短使酶与底物作用的空间加大，结果使环化活力提高25%。根据Penninga等[21]报道，将第616位的色氨酸突变成丙氨酸时，因侧链长度变短及与底物的氢键关系变化，结果突变体与底物的亲和力变小和环化活力明显降低。结合文献报道与本实验结果，说明淀粉结合位点氨基酸的改变对酶的底物亲和力、催化效率、产物专一性有比较大的影响。
3 结论本实验通过定点饱和突变技术构建了淀粉结合位点2第623位氨基酸残基的19种突变体，得到多个环化活力和淀粉转化率明显提高的CGTase突变体，其中突变体N623T以可溶性淀粉为底物合成环糊精的总环化活力提高了58.6%，淀粉总转化率提高了251.3%。通过动力学分析和晶体模拟结构我们初步阐述了突变体酶催化效率改善的机制。研究结果使我们进一步了解了淀粉结合位点2处氨基酸残基与酶催化反应的相关性，为进一步阐明CGTase的催化反应机制奠定了基础，同时也为构建具有高催化效率的CGTase突变体提供了依据。
| [1] | Loftsson T, Duchene D. Cyclodextrins and their pharmaceutical applications. International Journal of Pharmaceutics , 2007, 329 (1-2) : 1–11. DOI:10.1016/j.ijpharm.2006.10.044 |
| [2] | Uitdehaag J C M, Veen B A V D, Dijkhuizen L, et al. Catalytic mechanism and product specificity of cyclodextrin glycosyltransferase, a prototypical transglycosylase from the α-amylase family. Enzyme & Microbial Technology , 2002, 30 (01) : 295–304. |
| [3] | Leemhuis H, Kelly R M, Dijkhuizen L. Engineering of cyclodextrin glucanotransferases and the impact for biotechnological applications. Applied Microbiology & Biotechnology , 2009, 85 (4) : 823–835. |
| [4] | Christiansen C, Hachem M A, Janečk K Š, et al. The carbohydrate-binding module family 20-diversity, structure, and function. Febs Journal , 2009, 276 (18) : 5006–5029. DOI:10.1111/j.1742-4658.2009.07221.x |
| [5] | Dalmia B K, Schütte K, Nikolov Z L. Domain E of Bacillus macerans cyclodextrin glucanotransferase:An independent starch-binding domain. Biotechnology & Bioengineering , 1995, 47 (47) : 575–584. |
| [6] | Lawson C L, Montfort R, V an, B Strokopytov, et al. Nucleotide Sequence and X-ray structure of cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus circulans Strain 251 in a maltose-dependent crystal Form. Journal of Molecular Biology , 1994, 236 (2) : 590–600. DOI:10.1006/jmbi.1994.1168 |
| [7] | Sanoja-Romina R, Oviedo N, Sánchez S. Microbial starch-binding domain. Current Opinion in Microbiology , 2005, 8 (3) : 260–267. DOI:10.1016/j.mib.2005.04.013 |
| [8] | Kimura K, Kataoka S, Nakamura A, et al. Functions of the COOH-terminal region of cyclodextrin glucanotransferase of alkalophilic ja:math sp.#1011:relation to catalyzing activity and pH stability. Biochemical & Biophysical Research Communications , 1989, 161 (3) : 1273–1279. |
| [9] | Chang H Y, Irwin P M, Nikolov Z L. Effects of mutations in the starch-binding domain of Bacillus macerans cyclodextrin glycosyltransferase. Journal of Biotechnology , 1998, 65 (2-3) : 191–202. DOI:10.1016/S0168-1656(98)00115-1 |
| [10] | Veen B A V D, Uitdehaag J C M, Dijkstra B W, et al. Engineering of cyclodextrin glycosyltransferase reaction and product specificity. Biochimica Et Biophysica Acta , 2000, 1543 (2) : 336–360. DOI:10.1016/S0167-4838(00)00233-8 |
| [11] | Studier F. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures. Protein Expression & Purification , 2005, 41 (1) : 207–234. |
| [12] | Lejeune A, Sakaguchi K, Imanaka T. A spectrophotometric assay for the cyclization activity of cyclomaltohexaose (α-cyclodextrin) glucanotransferase. Analytical Biochemistry , 1989, 181 (1) : 6–11. DOI:10.1016/0003-2697(89)90385-0 |
| [13] | Mäkelä M, Korpela T, Laakso S. Colorimetric determination of β-cyclodextrin:two assay modifications based on molecular complexation of phenolphatalein. Journal of Biochemical & Biophysical Methods , 1987, 14 (2) : 85–92. |
| [14] | Kato T, Horikoshi K. Colorimetric determination of.gamma.-cyclodextrin. Analytical Chemistry , 2002, 56 (9) : 1738–1740. |
| [15] | Bradford M M. A rapid method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry , 1976, 72 (s1-2) : 248–254. |
| [16] | Arnold K, Bordoli L, Kopp J T. The SWISS-MODEL workspace:a web-based environment for protein structure homology modelling. Bioinformatics , 2006, 22 (2) : 195–201. DOI:10.1093/bioinformatics/bti770 |
| [17] | Kopp J, Schwede T. The SWISS-MODEL repository of annotated three-dimensional protein structure homology models. Nucleic Acids Research , 2004, 32 (22) : 230–234. |
| [18] | Zhang Y. I-TASSER server for protein 3D structure prediction. Bmc Bioinformatics , 2008, 9 (3) : 297–315. |
| [19] | 杨冬, 田靖斐, 陈晟, 等. 亚位点-7处突变对碱性芽胞杆菌CGT酶产物特异性的影响. 生物工程学报 , 2012, 28 (2) : 191–202. Yang D, Tian J F, Chen S, et al. Effect of mutating subsite-7 on product specificity of cyclodextrin glucanotransferase from alkalophilic Bacillus clarkia. Chinese Journal of Biotechnology , 2012, 28 (2) : 191–202. |
| [20] | Giardina T, Gunning A P, Juge N, et al. Both binding sites of the starch-binding domain of Aspergillus niger glucoamylase are essential for inducing a conformational change in amylose. Journal of Molecular Biology , 2001, 313 (5) : 1149–1159. DOI:10.1006/jmbi.2001.5097 |
| [21] | Penninga D, Veen B A, Van Der, Knegtel R M, et al. The raw starch binding domain of cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus circulans strain 251. Journal of Biological Chemistry , 1996, 271 (51) : 32777–32784. DOI:10.1074/jbc.271.51.32777 |