高山被孢霉是一种油脂合成能力很强的丝状真菌，能够从头合成多种多不饱和脂肪酸(PUFA)，也是花生四烯酸(AA)的工业生产菌株^[1-2]。通过研究高山被孢霉的脂质合成机制，可为利用单细胞油脂作为生物柴油和食用脂肪提供理论依据。NADPH是脂肪酸合成所需还原力的唯一来源，是脂质合成的限速步骤之一^[3]。研究表明，产油微生物脂肪酸合成所需的NADPH多由苹果酸酶和磷酸戊糖提供，然而，脂质合成所需NADPH的其他来源尚未研究透彻^[4]。

传统意义上，叶酸代谢主要参与核苷酸合成、蛋白质合成、氨基酸代谢、维生素代谢和甲基化等生理过程^[5-8]。但最近对小鼠肝脏细胞生长过程中NADPH代谢流的分析表明，叶酸代谢途径产生的NADPH占总NADPH生成量的80%，其中大部分参与脂肪酸合成^[9]。因此，在产油微生物中，叶酸代谢途径很可能作为NADPH的另一来源，在脂质合成中发挥重要作用。叶酸代谢途径中，亚甲基四氢叶酸脱氢酶(MTHFD)可将5,10-亚甲基四氢叶酸氧化为5,10-甲炔基四氢叶酸，此过程需要NAD(P)⁺的参与(图 1)。对MTHFD的分子水平鉴定表明，来源自不同物种的MTHFD甚至同一物种中MTHFD的异构体对辅酶因子的依赖性都有很大差异，它可以将NAD⁺转化为NADH，或将NADP⁺转化为NADPH^[9-11]。

本实验室首先完成了高山被孢霉的全基因组测序^[12]。基因组分析表明，高山被孢霉基因组中存在MTHFD基因。MTHFD对不同辅酶因子的偏好性决定了其是否可以作为高山被孢霉脂肪酸合成所需NADPH的来源之一。本文选择高山被孢霉中的MTHFD基因进行克隆表达，进而对其酶学性质和辅酶因子偏好性进行研究，并对其在脂质合成中的转录调控规律进行研究，为研究产油微生物中NADPH的来源提供理论基础。

1 材料与方法 1.1 材料与试剂

高山被孢霉(Mortierella alpina ATCC 32222，美国标准生物品收藏中心)；pET-28a(+)、E. coli Top10和E. coli BL21保存于本实验室。

限制性内切核酸酶购自大连宝生物(TaKaRa)；T4 DNA ligase、TEMED、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、DNA maker购自美国Promega公司；KOD酶购于Toyobo公司；Kanamycin sulfate、IPTG、lysozyme、RNase A、SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒、SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒、柱式胶回收试剂盒均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；PrimeScript RT reagent kit (TaKaRa)；HisTrapTMHP 纯化柱(GE Healthcare)；其它常规试剂均为进口分装或国产分析纯。

1.2 仪器与设备

液相色谱质谱联用检测仪(LC-MS)(热电，美国)；TSK gel Amide-80氨基色谱柱(150mm×2.0mm,2.0μm)(Tosoh，日本)；蛋白质纯化系统(GE Healthcare)；离心机(热电，德国)；荧光定量PCR仪(伯乐，美国)；凝胶成像分析系统(伯乐，美国)；Nanodrop(热电，美国)；PCR仪(伯乐，美国)；酶标仪(热电，美国)。

1.3 试验方法

1.3.1 高山被孢霉的培养及培养基残氮测定

参考之前的方法对高山被孢霉进行发酵培养，并利用靛酚蓝比色法对培养基残氮含量进行测定^[4]。

1.3.2 基因搜索

对于已完成的高山被孢霉(ATCC 32222)基因组(基因库序列号ADAG01000000)，使用Blast程序在NR(www.ncbi.nlm.nih.gov)、KOGs和COGs、KEGG、Swiss-Prot、UniRef100和BRENDA蛋白数据库中进行比对，E值设为1×10⁵，注释目的蛋白。

1.3.3 脂肪酸含量分析

高山被孢霉脂肪酸提取和分析方法参考以前的研究^{[4, 13]}。

1.3.4 表达载体的构建

利用Trizol(Invitrogen)根据说明书提取总RNA，经反转录后得到cDNA。采用表 1中的MTHFD引物，在上游引物引入Nhe I酶切位点，下游引物引入Hind Ⅲ酶切位点，对MTHFD基因进行扩增。PCR条件为：94℃，30s；55℃，45s；延伸68℃，1min(总共25个循环)。对PCR产物进行纯化后进行酶切，将其连接到到pET28a(+)载体上，电转进E.coli Top10。利用酶切和菌落PCR筛选出阳性转化子，利用ABI3730测序仪对表达质粒进行测序验证。所用PCR验证引物及测序引物均为T7和T7ter，如表 1所示。

1.3.5 蛋白质表达和纯化

将上述携带有MTHFD基因的重组质粒电转导入E. coli BL21于－80℃保存。接种于20ml选择性LB培养基中(含50μg/ml卡那霉素)，37℃，200r/min培养16h。1%接种量接种于250ml选择性LB培养基(含50μg/ml卡那霉素)，37℃、200r/min培养至OD₆₀₀为0.6左右。加入IPTG进行诱导，离心收集菌体，用结合缓冲液(50mmol/L Tris-HCl,300mmol/L NaCl和10mmol/L咪唑，pH 8.0)洗涤菌体后，再用此缓冲液重悬菌体，并加入PMSF(终浓度1mmol/L)和溶菌酶(终浓度1mg/ml)，冰浴30min后进行超声破碎。离心后取上清液，根据说明书使用HisTrap HP纯化柱(GE Healthcare)对带有His标签的重组蛋白进行纯化。以30倍柱体积的洗涤缓冲液(50mmol/L Tris-HCl、300mmol/L NaCl、20mmol/L 咪唑，pH 8.0)洗涤未结合蛋白。重组蛋白用10ml洗脱缓冲液(50mmol/L Tris-HCl、300mmol/L NaCl和500mmol/L咪唑，pH8.0)进行洗脱。蛋白质浓度采用Bradford法测定。

1.3.6 酶活测定及酶学性质研究

MTHFD反应体系为25mmol/L磷酸钾缓冲液(pH7.0)、36mmol/L巯基乙醇、100μmol/L NAD(P)⁺、0.5mmol/L 5,10-亚甲基四氢叶酸和1μmol/L纯化后的MTHFD蛋白，总体积50μl。37℃反应8min，反应结束加入50μl 0.36mol/L HCl终止反应。5,10-甲炔基四氢叶酸含量用样品在350nm处的吸光值计算得出，5,10-甲炔基四氢叶酸的摩尔吸光系数为24.9mmol/[(L·m)]^[14]。为分析MTHFD的最适反应温度，上述反应体系在4～55℃反应5min后测定活性。为分析MTHFD的温度稳定性，分别在4℃、37℃、45℃和55℃下孵育2h，然后在上述反应体系中37℃反应5min后测定活性。为分析MTHFD的最适反应pH，上述反应体系分别在25mmol/L磷酸钾缓冲液(pH7.0和8.0)、25mmol/L乙酸钠冲液(pH3.0和5.0)及25mmol/L甘氨酸氢氧化钠缓冲液(pH10.0和12.0)中，37℃反应5min后测定活性。为分析金属离子对MTHFD活性的影响，分别在体系中添加终浓度为5nmol/L的KCl、NaCl、MgCl₂、MnCl₂、FeCl₂、CuCl₂和CoCl₂，37℃反应5min后测定活性。

1.3.7 液相色谱-质谱(LC-MS)分析

利用LC-MS分析NADH和NADPH的含量。采用TSK gel Amide-80色谱柱，柱温设为35℃，流动相A为5mmol/L乙酸铵，流动相B为乙腈，进样量为5μl。质谱分析条件为负离子电离模式，鞘气和辅助气为氮气，探针加热温度250℃，毛细管温度325℃。

1.3.8 荧光定量PCR

反应体系为20μl，其中含Power SYBR^® Green PCR Master Mix 10μl，引物各1μl，cDNA 2μl，纯水7μl。PCR程序为95℃、10s，60℃、10s进行40个循环。18S rDNA作为内参基因。利用2^-(ΔΔCt)计算基因转录水平倍数变化，其中Δ Ct为Ct(样品)－Ct(参照)。引物序列见表 1。

2 结果与讨论 2.1 MTHFD的克隆

根据基因注释的结果，得到MTHFD基因的序列(GenBank ID1919498)。根据MTHFD基因序列设计引物，见表 1。将提取到的mRNA反转录为cDNA，以其为模板进行PCR扩增，所得DNA条带大小为1 000bp左右[图 2(a)]。将其连接至pET-28a(+)载体，命名为pw102。对转化子进行PCR鉴定，引物为T7和T7er，其中大小为1 100bp左右的DNA条带对应的转化子为阳性转化子[图 2(a)]。对阳性转化子进行测序后，其测序结果与MTHFD的基因序列相符。

2.2 MTHFD的诱导表达和纯化

通过0.01～0.5mmol/L的IPTG对pw102进行诱导表达。尽管高浓度IPTG有利于蛋白质的大量表达，但此时表达的蛋白质多为不可溶蛋白，通过对培养温度和时间进行优化后，得到了MTHFD的最适表达条件为：0.1mmol/L IPTG、20℃培养16h。当对MTHFD进行纯化时，发现pH7.0的洗脱缓冲液可以将目的蛋白洗脱下来，但很快凝结成絮状沉淀，这可能是洗脱缓冲液的pH与重组蛋白等电点相近，因此采用pH8.0的洗脱缓冲液对目的蛋白进行纯化。通过SDS-PAGE对纯化蛋白进行检测，条带单一而且无明显杂带，MTHFD大小为40kDa[图 2(b)]。最后利用10kDa超滤离心柱对所得蛋白质进行脱盐处理，蛋白质终浓度为10.92μg/ml。将纯化后的蛋白质溶于50%甘油后存于－80℃以备后续试验。

2.3 重组蛋白的活性分析

为确定重组蛋白的活性，以5,10-亚甲基四氢叶酸作为底物，分别加入不同辅酶因子，与重组蛋白一起进行孵育，生成5,10-甲炔基四氢叶酸的量用酶标仪在350nm的吸光值根据摩尔吸光系数计算得出。如图 3所示，在不添加重组蛋白的空白反应中，并没有5,10-甲炔基四氢叶酸生成；而在含有重组蛋白的反应中，无论以NAD⁺还是NADP⁺作为辅助因子，都可以生成5,10-甲炔基四氢叶酸。这表明重组蛋白具有MTHFD活性。单位酶活定义为生成100nmol 5,10-甲炔基四氢叶酸所需MTHFD的量(mg)。

2.4 重组蛋白的酶学性质研究

如图 4(a)所示，MTHFD在12~45℃都具有活性，最适反应温度为37℃，在12℃仍可保持36%的活性，表明此蛋白质对低温具有一定的适应性。如图 4(b)所示，MTHFD的热稳定性较差，当MTHFD在37℃放置2h后，只保留了13%的活性；在45℃及55℃放置1h后，活性分别保留了12%和4%；当在55℃放置2h后MTHFD彻底失活。如图 4(c)所示，MTHFD的最适反应pH为10，pH为5～12均有活性，具有较广的pH适应性。如图 4(d)所示，当在反应体系中添加EDTA时，MTHFD的活性没有发生变化，这表明MTHFD的活性并不依赖于金属离子；终浓度为5nmol/L的Na⁺、K⁺、Fe²⁺和Cu²⁺可以增强MTHFD的活性，而5nmol/L Co²⁺完全抑制了MTHFD的活性。

2.5 MTHFD对不同辅酶因子的转化率研究

通过LC-MS分析样品中NAD⁺、NADP⁺、NADH和NADPH的含量，如图 5所示。当以NAD⁺作为辅酶因子时，对不含有MTHFD的空白反应体系进行选择离子扫描(664.12m/z，NADH)时，并没有检测到催化产物[图 5(b)]；当对含有MTHFD的催化体系进行选择离子扫描时(664.12m/z，NADH)，在9.1min有峰出现，表明重组蛋白可以将NAD⁺转化为NADH[图 5(d)]。当以NADP⁺作为辅酶因子时，对不含有MTHFD的空白反应体系进行选择离子扫描(744.08m/z，NADPH)时，并没有检测到催化产物[图 5(f)]；当对含有MTHFD的催化体系进行选择离子扫描时(744.08m/z，NADPH)，在9.1min有峰出现，表明重组蛋白同样可以将NADP⁺转化为NADPH[图 5(h)]。

根据样品中NAD⁺、NADP⁺、NADH和NADPH的含量计算MTHFD对不同辅酶因子的转化率，NAD⁺转化率(%)=反应生成的NADH量/(反应生成的NADH量+反应剩余的NAD⁺量)，NADP⁺转化率(%)=反应生成的NADPH量/(反应生成的NADPH量+反应剩余的NADP⁺量)，结果如图 6所示。当分别添加NAD⁺和NADP⁺时，MTHFD对NAD⁺和NADP⁺的转化率分别为(20.50.±1.22)%和(77.62±3.21)%。当同时添加NAD⁺和NADP⁺时，MTHFD对NAD⁺和NADP⁺的转化率分别为(12.14±0.55)%和(70.09±3.41)%。因此，MTHFD对NAD⁺和NADP⁺都具有催化能力，但更倾向于催化NADP⁺。

2.6 MTHFD在脂肪酸积累过程中的转录调控规律

对于产油真菌而言，氮源是脂质积累的决定性因素，只有在氮源耗尽的情况下，产油真菌才开始大量积累脂质^[4]。根据靛酚蓝比色法分析结果发现，高山被孢霉在22h耗尽氮源。由图 7(a)可以看出，在氮源耗尽前(22h)脂肪酸含量较低；在氮源耗尽后脂肪酸大量积累，最后产量可达0.23g/g干重(70h)。同时，尽管在氮源耗尽前MTHFD的转录水平有所波动，但是在氮源耗尽之后，MTHFD的转录水平迅速上升，在70h的转录水平明显高于氮源耗尽前[图 7(b)]。同时，由于MTHFD更倾向于将NADP⁺转化为NADPH，这表明MTHFD在高山被孢霉脂质合成过程中发挥重要作用，很可能是脂质合成所需NADPH的关键来源。后续试验中，可利用本文纯化得到的纯化蛋白质进一步制备MTHFD的特异性抗体，进一步研究MTHFD在脂质积累过程中蛋白质水平的调控情况。

3 结论

综上所述，为了探究产油真菌高山被孢霉脂质合成所需NADPH的来源，本文完成了对高山被孢霉中MTHFD的克隆、表达和功能鉴定。构建了MTHFD的表达载体，并对MTHFD进行了诱导纯化，纯化后的目的蛋白具有MTHFD活性。高山被孢霉MTHFD对NAD⁺和NADP⁺均具有催化能力，但更偏好于将NADP⁺转化为NADPH。同时MTHFD的转录水平在脂质开始积累后发生了明显的上调，表明MTHFD在高山被孢霉脂质合成过程中发挥重要作用，很可能是脂质合成所需NADPH的关键来源。为对高山被孢霉进行分子改造，使之成为高产各种多不饱和脂肪酸的细胞工程提供理论依据。