钙离子(Ca²⁺)通道参与神经、肌肉、分泌、生殖等重要的生理过程，广泛存在于机体可兴奋细胞的细胞膜上，已发现Ca²⁺通道基因突变可引发多种疾病^[1]。其中L型电压依赖性钙通道(LTCC)具有高电压激活、电导大、开放时间长,能与多种拮抗剂作用等特点，是Ca²⁺进入细胞内的主要通道^[2]。由α1、α2、β、γ、δ 5个亚单位构成，其中α1是跨膜的亲水通道，是构成LTCC的主要亚单位，是大多数药物的结合位点。编码LTCC α1亚基的基因有4种，α1 S、 α1 C、 α1 D、 α1 F。只有αlC(Cav 1．2基因)在心肌中高表达 ^[3]。

但迄今为止，有关Cav1.2转录调控机制仍然不清楚。

Myocardin 是血清应答因子(SRF)的辅助因子，通过Q-rich功能区与SRF结合然后绑定在相关基因启动子区CarG box[CC(A/T)6GG box]上形成稳定的三元络合物，进而激活心脏发育相关基因，如结构基因和应激诱导的肥厚特异性基因等^[4]。敲除Myocardin 的小鼠，胚胎早期E 10.5天发育迟缓并出现心包积液及心脏血管机能不全，最终导致早期胚胎致死^[5]；小鼠心脏过表达Myocardin，表现出心肌肥厚和心律失常，如Q-T 间隙缩短^[6]；成体小鼠Myocardin 仍然在心脏和血管平滑肌中特异性高度表达。心肌细胞分化功能的维持及成熟过程都需要Myocardin的参与 ^[7-8]。

Myocardin和Cav1.2在维持心脏正常结构和功能过程中都发挥着重要作用。那么Myocardin作为一种心肌细胞重要的转录因子能否调控Cav1.2，如何调控以及Myocardin调控对心肌Ca²⁺通道的功能会有怎样的影响，这些问题目前尚不清楚。本文围绕以上几个问题展开研究，进一步阐明心肌细胞电生理活动的分子基础，为先天性心脏病、心力衰竭、心肌肥厚等心脏相关疾病的病因学研究提供线索，并为针对其病理机制的新药开发及临床防治提供理论基础。

1 材料与方法 1.1 实验材料

1.1.1 细胞和质粒

H9C2大鼠心肌细胞系购买于武汉博士德生物工程有限公司，pMD^®18-T Vector载体质粒购自TaKaRa公司；293T细胞、pcDNA3.1质粒、pGL3-Basic质粒和心肌素Myocardin质粒为天津科技大学分子生物学国家重点实验室赠送；大鼠Cav1.2启动子和Myocardin慢病毒质粒为本实验室构建并经全基因组测序确认。

1.1.2 主要试剂

质粒中量提取试剂盒和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自AXYGEN公司；T4 DNA 连接酶、pfu DNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker均购自Thermo公司；限制性内切核酸酶KpnⅠ和HindⅢ等酶购自NEB公司。荧光素酶底物luciferin购自Promega公司；Lenti-Pac^TM慢病毒浓缩试剂盒和Lenti-Pac^TM HIV 慢病毒颗粒滴度检测试剂盒购自GeneCopoeia公司；DMEM高糖培养基和胎牛血清购自Gibco公司。

1.2 实验方法

1.2.1 慢病毒包装及细胞感染

293-T细胞长至70%~80%用于转染。转染质粒：目标慢病毒质粒Ad-Myocardin 12μg、包膜蛋白VSVG 4μg和结构蛋白NRF 8μg。加48μl Turbo转染试剂，涡旋振荡混匀，室温孵育20min。转圈加入293-T细胞，37℃ 5% CO₂培养箱培养6~7h换成完全培养基。继续培养72h，观察绿色荧光强度，经0.45μm微孔滤膜过滤收集病毒，－80℃保存备用。病毒浓缩后测定病毒滴度以此确定病毒包装是否成功。用包装成功的病毒感染心肌细胞系H9C2: 6cm皿H9C2心肌细胞，加约5μl慢病毒浓缩液，48h后提取RNA或蛋白质，通过qPCR或Western blotting检测过表达效果。

1.2.2 电生理膜片钳技术全细胞记录钙电流

实验在室温(22~24℃)下进行。取出感染慢病毒48h后的心肌细胞H9C2的细胞爬片于灌流槽中，放置在倒置显微镜(Nikon) 工作台上，用100% O₂饱和的正常细胞灌流液灌流。灌流液成分(mmol/L)：NaCl 135、KCl 5.4、MgCl₂ 0.5、CaCl₂ 1.8、NaH₂PO₄ 0.33、HEPES 10、Glucose 10 (pH 7.4)。利用三维电动微操纵仪(MP285，Sutter，美国) 移动玻璃微电极至细胞表面负压吸引形成高阻封接(电阻为1~1.5MΩ)，再以负压吸破细胞膜，给予一定电压刺激(－80~40mV 持续200ms)，电流信号经Ag/AgCl 电极引导，经EP10膜片钳放大器(HEKA Electronic,Lambrecht,Pfalz Germany) 放大和滤波(2kHz)，以及双激发荧光光电倍增管系统进一步放大和转换电流信号后储存在计算机，以实现全细胞记录L型钙电流。玻璃微电极由两步玻璃微电极拉制仪(PP-83，Narishige，日本) 拉制，并经热抛光。电极内液的主要成分(mmol/L)：CsCl 80、CsOH 60、天冬氨酸40、CaCl₂ 0.65、HEPES 5、EGTA 10、MgATP 5，其中磷酸肌酸二钠盐和TTX(pH 7.2)用于阻断钠电流。

1.2.3 Real-time PCR法检测Myocadin，Cav1.2在转录水平的表达

应用primer primer 5软件设计定量引物，检测Myocardin和Cav1.2的表达。引物序列为：

GAPDH(F-ATTCAACGGCACAGTCAAGG，R-GCAGAAGGGGCGGAGATGA)

Myocardin(F-AGCCACCAGTCAGATGCG，R-TGGCGTTGAAGAAGAGTTTG)

Cav1.2(F-GATGAAAGGTGGGATACGAA，R-CCAAGAGCAAGTTAGGAGCAA)

Trizol法提总RNA，TaKaRa公司反转录试剂盒，两步法反转录得到cDNA，以cDNA为模板，应用TaKaRa公司的Real-time PCR试剂盒PCR，加入过量SYBR Green荧光染料，然后于CFX96 Real-time System检测目的基因mRNA的表达。

1.2.4 Western bloting检测Myocadin和Cav1.2蛋白的表达

RIPA细胞裂解液4℃裂解H9C2细胞1h ，收集裂解液，100℃金属浴5~7min，G250蛋白定量以确定上样量。80V恒压电泳 2~3h，按滤纸-凝胶-NC膜-滤纸的顺序，胶负膜正200mA转膜90~120min。室温封闭1.5h，1∶2 000稀释一抗(Santa公司GADPH、Myocardin、L-type Ca²⁺ CP α1 C)4℃过夜孵育。1∶5 000稀释二抗，室温孵育2h。ECL化学发光，用Quantity One凝胶成像系统对NC膜进行扫描和定量分析，以GADPH为内参，测定Myocardin、CAV1.2的蛋白质表达量。

1.2.5 PCR介导的定点突变

UCSC查询LTCC编码基因启动子序列，分析发现启动子－2 500bp区域内有3个Myocardin 的结合位点(CarGbox)，应用primer primer 5软件，根据CarGbox位点，从启动子区－2 300～42bp设计定点突变引物，序列见表 1。

PCR介导的定点突变：20μl体系加1μl高保真DNA聚合酶pfu，以事先构建好的WT-Cav1.2-pGL3-Basic为模板，用上述定点突变引物反向PCR。PCR产物 20μl体系加1μl DpnⅠ消化2~3h后转化，第二天挑取单个菌落，小量培养后测序。PCR介导的定点突变质粒，经擎科生物技术有限公司目的基因全序列测序，测序结果用DNAMAN软件比对分析。将测序正确的克隆中量提取质粒，用于后续荧光素酶报告系统检测启动子活性。

1.2.6 荧光素酶活性检测

24孔板接种293-T细胞，60%~70%融合后转染。Control组：0.8μg pcDNA3.1 + 0.2μg Cav1.2-luci；Myocardin组：0.8μg Myocardin + 0.2μg Cav1.2-luci，每孔加2μl turbo转染试剂，8h后更换新鲜培养基，继续培养48h，4℃预冷1×PBS清洗细胞，加100μl 1×Passive Lysis Buffer 4℃裂解细胞15min。收集裂解液，10 000r/min离心10min取上清液。取50μl蛋白质上清液加入100μl luciferin于BIO-RAID多功能酶标仪中检测荧光强度。取20μl蛋白质上清液加200μl G250检测595nm处的吸光度，蛋白质定量。

1.2.7 统计学处理

本次研究所有实验均至少重复3次。用SPSS 20.0软件进行数据处理，计量资料以x±s表示，组间比较均采用F检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 Myocardin对心肌细胞膜Ca²⁺电流的影响

包装Myocardin-GFP慢病毒之后的293T细胞在荧光倒置显微镜下观察其细胞形态和荧光强度，如图 1所示。包装病毒后，293T细胞膨胀变圆，70%细胞可观察到绿色荧光，病毒经浓缩滴度检测后感染大鼠心肌细胞系H9C2细胞。分两组：对照组(感染PTK642空载体病毒)、Myocardin组(感染Myocardin慢病毒)。细胞感染48h后 ，用电生理膜片钳技术全细胞记录细胞膜Ca²⁺电流。

如图 2所示，Control组与Myocardin组细胞大小相当，Control组无法检测到明显钙电流，过表达Myocardin组钙电流为54pA，细胞大小5.1pF，电流密度=钙电流/细胞大小=10.6pA/pF。与Control组相比，过表达Myocardin后电流密度显著上调(n=6 ；P<0.01)。由此表明，Myocardin激活LTCC的表达影响了心肌细胞膜L型Ca²⁺电流。

2.2 Myocardin促进Cav1.2基因的表达

大鼠心肌细胞系H9C2分两组：对照组 (顺转空质粒pcDNA3.1)、Myocardin组(顺转过表达Myocardin) 。48h后，用Trizol法提取总RNA，反转录成cDNA，以GAPDH为内参，通过Real-time PCR 检测各组Cav1.2 mRNA的表达水平；RIPA裂解液裂解细胞，收集蛋白质，Western blotting 检测各组GAPDH、Myocardin、Cav1.2蛋白表达水平。如图 3所示，过表达Myocardin组Cav1.2 mRNA[图 3(a)]和蛋白质[图 3(b)]表达量较对照组显著上升(P<0.05)，以此表明Myocardin可激活Cav1.2基因的表达。

2.3 Myocardin激活LTCC Cav1.2基因的转录

293T 细胞turbo脂质体法转染质粒。实验组：WT-Cav1.2-luci+Myocardin、对照组WT-Cav1.2-luci+pcDNA3，48h后检测荧光素酶报告基因活性，以此来判断Myocardin是否可以激活LTCC Cav1.2基因的转录。

如图 4所示，加入特定的荧光素酶底物后，过表达Myocardin组发出的荧光强度明显高于对照组(P<0.01)，表明Myocardin可激活Cav1.2启动子活性，从而激活其表达。

2.4 Myocardin 激活LTCC Cav1.2基因依赖其启动子上的CarGbox

启动子活性检测结果如图 5所示，所有启动子相对于其Control组均有显著活性(P<0.01)，CarGbox突变之后相对WT活性均降低。将位于－2 182bp处的CarGbox(C3)单独突变之后，报告基因活性降低不显著，而将 －995bp或－1 561bp处的CarGbox(C1或C2)突变之后，相对于WT报告基因活性显著降低(P<0.05)。 将－995bp和－1 561bp处的两个CarGbox(mc12)同时突变之后，报告基因活性降低极显著(P<0.01)。同样将3个CarGbox(mc123)同时突变之后，报告基因活性仍显著降低(P<0.01)。表明Myocardin激活LTCC Cav1.2基因的转录依赖其启动子上的CarGbox，Myocardin可能与靠近转录起始位点的C1和/或C2 CarGbox结合进而启动下游基因的表达。

3 讨论

目前LTCC 转录调控研究较少，特别是有关Myocardin 对其转录调控目前尚无报道，对此开展探索性研究，具有较好的创新性。本课题通过Myocardin对钙离子通道Cav1.2基因转录调控的研究，证实Myocardin可以激活Cav1.2基因的表达,进而增强心肌细胞膜钙电流；发现Myocardin在Cav1.2基因启动子区的作用靶点为C1和C2 CarGbox。

然而心血管疾病的发生发展是个多因素多因子参与并相互作用的复杂过程，Myocardin对Ca²⁺通道的调控只是心肌细胞Ca²⁺信号介导的信号转导通路中的很小一部分，以下就心肌细胞Ca²⁺信号介导的信号转导通路加以讨论。

Ca²⁺诱导心肌肥厚研究过程中，发现过表达Myocardin的心肌细胞胞质内的Ca²⁺浓度升高。沉默Myocardin 表达后，细胞质内的Ca²⁺浓度也有所下降^[9]。在进一步对Ca²⁺下游的NFAT与Myocardin 相互关系研究中，我们也发现NFATc4 可较强的激活Myocardin 的转录和表达^[10]，这些结果促使我们思考Myocardin 是否与心肌细胞膜上的钙通道相关，Ca²⁺和Myocardin 之间是否存在正反馈环路联系，其机制是否涉及钙通道蛋白表达及NFATc4。

此外，已有报道，microRNA是内源性非编码的16～22bp的小分子RNA，在肌肉中特异性表达的miR-133能够与SRF mRNA 3′-UTR结合，沉默SRF mRNA 并抑制Myocarin-SRF-CarG对心肌相关基因的激活^[11]。此外，已有报道miR-133过度表达将导致Q-T间期延长综合征^[12]，这意味着动作电位时程延长，而Ca²⁺内流对动作电位2时相影响最为明显，这提示我们，miR-133可能通过沉默SRF，进而影响Myocardin对Cav1.2的转录激活，形成负反馈调节。

对以上心肌细胞Ca²⁺信号介导的信号转导通路进行研究，将揭示Myocardin 对LTCC 组件Cav1.2 转录调控的确切机制和反馈联系。总之，可揭示Myocardin 对心肌LTCC 转录调控机制，为心脏电生理调控提供新的理论基础，并为针对其病理机制的新药开发及临床防治提供理论基础。

4 结语

本文通过Myocardin对Ca²⁺通道Cav1.2基因转录调控的研究，发现Myocardin与Cav1.2基因启动子区的C1和C2 CarGbox结合，激活Cav1.2基因转录和表达，进而增强心肌细胞膜钙电流。然而心血管疾病的发生发展是个多因素多因子参与并相互作用的复杂过程，Myocardin对于其他离子通道(如Na⁺、K⁺等)的转录调控作用及其机制、Myocardin 能否通过自身的组蛋白乙酰转移酶活性影响LTCC启动子的乙酰化并促进其转录，以及Myocardin是否与其他转录因子(如NFAT和miR-133)之间存在相互作用进而影响其对Ca²⁺通道的转录调控，以上过程仍然不清楚，有待进一步研究。