衣原体是引起多种人类疾病的专性胞内寄生的革兰阴性菌^[1]。目前已知的有20多种，其中，能引起人类疾病的衣原体主要有三种：沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis，Ct)、肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae，Cpn)和鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydophila psittaci，Cps)。虽然不同种类的衣原体具有类似的生物学特性，但不同衣原体的组织亲嗜性及致病谱差异很大。其中，Ct主要感染眼部、泌尿生殖道等^[2]；Cpn主要感染呼吸道、脉管系统等^[3]；Cps主要感染呼吸道^[4]。衣原体疾病会对人类健康产生严重危害。因此，如何有效控制和预防衣原体疾病，已成为普遍关注的公共卫生问题，开发新型有效并且安全的抗衣原体疫苗已成为控制衣原体感染迫切需要解决的问题。

目前，衣原体疫苗主要集中于亚单位疫苗、载体疫苗、DNA疫苗等新型疫苗。这些疫苗往往免疫原性较弱，需要安全有效的免疫佐剂来增强其免疫效果。佐剂是非特异性的免疫增强剂，能够增强机体对疫苗抗原组分的特异性免疫应答或改变免疫反应的类型，是影响疫苗免疫效果的重要因素^[5]。尽管佐剂研究已经有几十年的历史，但是目前已认证应用于人类的佐剂仍寥寥无几。在衣原体疫苗的研究中使用过多种佐剂，不同的佐剂产生不同的效果。本文就近年来衣原体疫苗佐剂研究进展情况进行综述。

1 具备免疫原性的佐剂 1.1 免疫刺激复合物

免疫刺激复合物(lipophilic immune response-stimulating complexs，ISCOMs)基质是由抗原物质、糖苷Quil A以及胆固醇等体积混合后形成的一种具有较高免疫活性的脂质小泡，疏水性笼状结构。ISCOMs是一种具有较高免疫活性的抗原递呈系统，具有佐剂和抗原递呈的双重功能，能被B细胞、辅助性T细胞和细胞毒性T细胞识别，并活化这些免疫细胞^[6]。Igietseme等^[7]以ISCOMs的形式，以Ct的主要外膜蛋白(major outer membrane protein，MOMP)为抗原，构建了Ct疫苗MOMP-ISCOMs，通过肌内注射免疫BALB/c小鼠，发现生殖道黏膜局部产生高水平的Thl型免疫应答，将免疫后小鼠的T细胞转移给未免疫的同系小鼠，然后阴道内感染D型Ct。结果发现在一星期内小鼠可以清除Ct并能抵抗再次感染。Zhang等^[8]以ISCOMs的形式，制备pcDNA3-MOMP-ISCOMs及MOMP-ISCOMs疫苗免疫小鼠，发现小鼠能有效抵抗Ct感染。然而，ISCOMs中的成分之一Quil A，具有表面活性和针对红细胞的溶血活性，当其使用过量时，可产生局部反应，甚至引起组织坏死。因此，制备ISCOMs，必须确定可获得最佳免疫增强效果和最小局部反应的适当剂量。目前，ISCOMs已在兽用疫苗上广泛使用，尚不能直接用于人体。

1.2 CpG寡核苷酸

CpG寡核苷酸(oligodeoxynucleotides containing CpG motifs，CpG ODN)是一类以CpG二核苷酸为核心的未甲基化的特殊的DNA序列。CpG能够模拟细菌DNA的免疫刺激活性，作为一种病原相关分子模式(PAMP)与B细胞、树突状细胞、单核细胞及巨噬细胞等免疫细胞中的内质网膜上的Toll样受体9(TLR-9)结合，能有效地增强免疫细胞的活性并促进多种细胞因子的分泌，在机体抵抗病原体入侵和抗肿瘤等方面发挥一定的作用^[9]。Cheng等^[10]以CpG和油佐Montanide ISA 720 VG为佐剂，以F型Ct的nMOMP(Ct-F-nMOMP)为抗原，免疫恒河猴，发现免疫后的恒河猴不仅可以产生高水平的特异性IgG、IgA抗体，而且还可以产生IFN-γ、TNF-α等Thl型细胞因子。Meoni等^[11]以CT043为抗原，添加LTK63+CpG组合佐剂后，能够诱导机体产生很强的Thl型免疫应答，可显著提高宿主抗Ct感染的能力。Vasilevsky等^[12]以CTB-CpG(霍乱毒素B亚单位-寡脱氧核苷酸)为佐剂，鼠衣原体MOMP为抗原构建疫苗免疫小鼠，不但能显著提高特异性细胞和体液免疫应答，还能保护小鼠抵抗衣原体感染。此外，Cong等^[13]研究发现CpG可以提高衣原体蛋白酶样活性因子(CPAF)蛋白的免疫原性。CpG ODN作为一种新型疫苗佐剂，既能单独使用也可与其他佐剂联合使用发挥协同作用，具有用量少、作用强、副作用小、应用广等优点。但是，目前CpG ODN的安全性尚未完全阐明。

1.3 细胞因子

细胞因子(cytokines，CK)是由细胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白质的统称，具有免疫调节、细胞毒效应、促进造血细胞增生分化及抑制肿瘤细胞增殖等多种生物学功能^[14]。细胞因子可以用作基因佐剂，既可以通过其蛋白，也可以通过其表达重组质粒来发挥作用^[15]。目前，在衣原体中应用较多的为IL-2。齐蔓莉等^[16]用IL-2重组质粒作为Ct E型pcDNA3.1(+)-MOMP DNA疫苗的佐剂，通过肌内接种免疫BALB/c小鼠，证明IL-2基因佐剂能够增强Ct E型DNA疫苗的以Th1型反应为主的细胞免疫，而增强机体抵抗Ct感染的能力。谢长青等^[17]以IL-2真核表达质粒为佐剂，与pcDNA3.1(+)-Cpn-MOMP一起免疫小鼠，与pcDNA3.1(+)-MOMP单独免疫组比较，IL-2佐剂能显著增强小鼠特异性体液免疫和细胞免疫应答。目前，已证明可以用作免疫佐剂的细胞因子很多，因各自的作用机制和效果不同，为了达到满意的免疫效果，可以尝试将不同的细胞因子联合起来^[18]。Zhang等^[19]研究发现，以IL-2和IL-7细胞因子联合佐剂可以提高犬细小病毒VP2 DNA疫苗的免疫原性。此外，Staats等^[20]用IL-1、IL-6、IL-12、IL-18、GM-CSF之间各种组合与HIV抗原滴鼻免疫后，能有效地增强细胞毒性T淋巴细胞的反应。虽然细胞因子基因佐剂的表达产物对机体无毒副作用，但是这些外来疫苗佐剂能否在人体内诱导抗DNA抗体的产生从而导致自身免疫病，或者与宿主染色体DNA发生整合、变异，导致肿瘤的发生，均有待进一步研究。

1.4 活载体

活载体疫苗是将免疫原基因通过分子生物学手段重组到细菌或病毒载体的基因上，再接种动物表达重组蛋白^[21]。活载体分为细菌活载体和病毒活载体。Zhou等^[22]以腺病毒载体作为佐剂，递呈鹦鹉热嗜衣原体的MOMP蛋白，免疫无特定病原的SPF鸡，证明了腺病毒载体能够很好地递呈MOMP抗原，产生很强的免疫应答，可保护禽类免于鹦鹉热嗜衣原体的感染。He等^[23]利用H1N1流感病毒减毒活菌株作为佐剂，Ct MOMP中几个高免疫活性多肽片段为抗原，免疫宿主后产生高水平的IgG2a和Thl型细胞因子，并能有效地防御Ct生殖道感染。Penttila等^[24]利用塞姆利基森林病毒(SFV)为载体，以Cpn MOMP或Omp2蛋白为抗原，首先分别用pcDNA3.1-MOMP和pcDNA3.1-Omp2进行首次免疫，之后分别用rSFV-MOMP和rSFV-Omp2进行二次免疫，结果显示宿主都能够产生高水平的IFN-γ，且能抵抗Cpn感染。活载体是基因工程疫苗中最具发展潜力的抗原递送系统之一。活载体疫苗可以诱导动物产生细胞免疫和体液免疫，甚至黏膜免疫。但是，有时会因为机体自身对载体的免疫反应而影响活载体疫苗的再次免疫效果，同时活载体疫苗的生物安全性问题也需进一步探讨。

1.5 菌影

菌影(bacterial ghosts，BGs)是一种不含胞浆成分而仍保留其外部形态学特征结构以及可以装载药物、酶、蛋白质、基因等物质的细菌空壳^[25]。Eko等^[26]以霍乱弧菌菌影(vibrio Cholerae Ghosts，VCG)作为佐剂，递呈Ct MOMP蛋白，发现rVCG载体能增强MOMP刺激宿主产生高水平的Thl型免疫应答和体液免疫。随后，Eko等^[27]又进一步利用rVCG载体，同时表达Ompl和Omp2两个抗原蛋白，得到了良好的免疫效果，且二价疫苗的效果明显高于单价疫苗。Macmillan等^[28]用rVCG作为佐剂，同时递呈Ct MOMP蛋白和疱疹病毒2型的糖蛋白D，结果证明该疫苗能同时具有对这两种疾病的免疫保护作用。此外，潘青^[29]报道以霍乱弧菌菌影为抗原递送系统，猪流产衣原体多型外膜蛋白中Pmp18蛋白为抗原，构建rVCG-Pmp18N疫苗，免疫小鼠后，小鼠产生很强的体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫抵抗猪流产衣原体感染。菌影可作为一种靶向性的载体，发挥抗原呈递作用，从而诱发强烈的免疫应答。菌影空壳与天然活菌在形态和结构上保持良好的一致性，但没有活菌的致病性，不仅可以直接作为疫苗诱导机体产生细胞免疫和体液免疫应答，还可作为载体输送药物和疫苗等物质。

2 不具备免疫原性的佐剂 2.1 脂质体

脂质体是一层或多层脂质双分子膜以同心圆形式包封而成，兼具佐剂和载体功能，类似细胞膜的微球体。脂质体可以把抗原传递给合适的免疫细胞，具有良好的靶向作用，而且安全无毒、无免疫原性。脂质体主要诱导B细胞为主的免疫应答，可以产生高水平IgG，还可以促进淋巴细胞增殖，是一种良好的佐剂^[30]。Hansen等^[31]以脂质体CAF01作为佐剂，应用于鼠衣原体疫苗的研究，用脂质体制成的MOMP/CAF01疫苗免疫小鼠后，不仅产生高水平的IgG2b，且IFN-γ和TNF-α产生水平明显提高，而且，在抗感染实验中能极大地减少阴道鼠衣原体的数量。Yu等^[32]分别以脂质体、CpG、氢氧化铝和角鲨烯油包水乳状液为佐剂，鼠衣原体蛋白PmpG为抗原，来诱导抗鼠衣原体保护性免疫。结果表明两种脂质体佐剂DDA-MPL和DDA-TDB的免疫效果明显高于CpG、氢氧化铝和角鲨烯油包水乳状液佐剂，尤其是诱导IFN-γ和TNF-α的产生。然而，脂质体不能长期保持稳定性，且成本又高，因此极大地限制了脂质体佐剂在疫苗中的应用。

2.2 纳米佐剂

纳米佐剂是将抗原物质或能编码免疫原多肽的DNA或RNA包裹于纳米粒子内部或是吸附在纳米粒子表面，也可通过化学连接作用与纳米粒子结合，从而持久地释放被包裹的抗原。目前，已有关于纳米材料作为潜在疫苗载体或佐剂的一些研究，主要包括金纳米颗粒、钙盐纳米颗粒、微乳载体、脂质体、聚合物纳米颗粒。Stary等^[33]以聚合物纳米颗粒cSAP为佐剂，与紫外线灭活Ct(UV-Ct)制成疫苗，经鼻内接种或子宫粘膜接种免疫小鼠后，可诱导小鼠产生大量的效应性T细胞，其中一部分迁移至感染相关的淋巴组织形成常驻型记忆T细胞，而另外一部分在血液中形成循环型记忆T细胞，机体一旦再次感染Ct，两种细胞均能大量增殖且迁移至感染部位，抑制Ct感染。Dixit等^[34]以一种可生物降解的纳米材料PLA-PEG为佐剂，与Ct MOMP肽M278制成疫苗，免疫小鼠后发现，它不仅能产生高水平的IFN-γ、IL-2和IL-17，还能表达高效价的M278特异性抗体IgG2a、IgG1和IgG2b。Fairley等^[35]用纳米材料聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)包裹Ct rMOMP，免疫小鼠后，可显著增强细胞免疫和体液免疫应答。纳米材料不仅易于合成和修饰加工，且具有良好的生物安全性。

3 展望

疫苗接种仍然是预防衣原体感染及其并发症的有效途径。虽然对衣原体疫苗已有广泛深入的研究，但是，至今还没有一种衣原体疫苗进入临床试验阶段。而佐剂的研究是现代新型疫苗发展不可缺少的重要环节。而安全问题仍是目前佐剂使用的瓶颈。如何突破这个瓶颈，开发出安全、有效的佐剂，是未来佐剂研发工作的核心任务。

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